劉夢(mèng)蘭，謝 陽(yáng)，曾春蓉，李作孝

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，瀘州四川 646000）

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）的主要疾病特征包括炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘，其致殘率高，病因不明。目前有病毒感染、自身免疫性反應(yīng)、遺傳、環(huán)境等多種假說(shuō)，自身免疫性反應(yīng)得到了普遍認(rèn)可，但免疫抑制劑的使用并沒(méi)有很好地延緩MS 患者病情的惡化［1］。隨著近年來(lái)研究的深入，細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、線粒體功能障礙、星型膠質(zhì)細(xì)胞增生等均被認(rèn)為與MS 的發(fā)病相關(guān)，以上研究方向也越來(lái)越受到研究者們的重視。通過(guò)對(duì)MS 病人的尸檢證實(shí)，新病灶出現(xiàn)時(shí)，細(xì)胞凋亡是最早的病理改變之一。細(xì)胞凋亡出現(xiàn)后才有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、吞噬斑塊的形成、軸突的損傷等多種MS 典型的病理表現(xiàn)［2］。而在MS 的多條通路中，TLRs/NF-κB 信號(hào)通路是經(jīng)典的免疫通路，TOLL 樣受體（toll-like receptors，TLRs）是啟動(dòng)主動(dòng)免疫的關(guān)鍵，細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)可因TLRs 被抗原激活后觸發(fā)，繼而激活核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）通路，最終啟動(dòng)自身免疫反應(yīng)［3］。在細(xì)胞內(nèi)眾多核轉(zhuǎn)錄因子中，NF-κB 是最重要的因子之一，對(duì)細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)都具有重要調(diào)節(jié)作用。目前公認(rèn)轉(zhuǎn)錄NF-κB 在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用，其機(jī)制是多種炎癥因子、代謝應(yīng)激、化學(xué)反應(yīng)等激活NF-κB 信號(hào)通路后，導(dǎo)致NF-κB 從細(xì)胞漿向細(xì)胞核內(nèi)移位，從而引起細(xì)胞凋亡［4］。但目前尚無(wú)確切關(guān)于NF-κB 信號(hào)通路被激活后引起細(xì)胞凋亡從而引起機(jī)體的自身免疫反應(yīng)最終導(dǎo)致MS 發(fā)生的相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)使用某種藥物使TLRs/NF-κB信號(hào)通路被抑制，減少細(xì)胞凋亡對(duì)脊髓神經(jīng)細(xì)胞的損傷破壞，從而對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）小鼠產(chǎn)生保護(hù)作用。

姜黃素是植物姜黃的干燥根莖及中藥姜黃的天然提取物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤及抗凋亡等多方面的藥理作用［5］，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、腫瘤等方面都具有一定研究?jī)r(jià)值［6，7］。在既往的研究中，姜黃素常與炎癥相聯(lián)系，在近期的研究中，姜黃素對(duì)細(xì)胞的抗凋亡作用才被逐漸重視起來(lái)。有報(bào)道稱，姜黃素可通過(guò)下調(diào)NF-κB 信號(hào)因子保護(hù)EAE 小鼠神經(jīng)［8］，但該保護(hù)作用的機(jī)制是否通過(guò)減少細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)文中尚未提及。近年來(lái)，中醫(yī)中藥發(fā)展日益壯大，國(guó)家亦大力提倡與支持，許多中藥提取物雖具有一定療效，但缺乏有效理論數(shù)據(jù)支撐。因此，本研究通過(guò)對(duì)EAE 小鼠腹腔注射姜黃素，探討細(xì)胞凋亡、TLRs/NF-κB 信號(hào)通路與自身免疫性反應(yīng)的關(guān)系，并探討姜黃素是否通過(guò)上述通路對(duì)小鼠神經(jīng)系統(tǒng)起保護(hù)作用，為臨床治療MS 提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑

本研究選用45 只實(shí)驗(yàn)用C57BL/6 雌性小鼠，武漢恒意賽生物科技有限公司［SCXK（鄂）2020-0018，SYXK（鄂）2017-0065］，鼠齡6～8周，體重17～20 g，購(gòu)買后飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)忠山校區(qū)中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房中，已獲得動(dòng)物倫理批準(zhǔn)，編號(hào)2020696。飼養(yǎng)室溫22～26 ℃，每12 h 明暗交替一次，給予足夠食料與飲水，定期更換動(dòng)物墊料保持清潔，對(duì)于動(dòng)物的飼養(yǎng)、取材、保存組織、處死等操作嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室規(guī)范進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)全過(guò)程符合《實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物飼養(yǎng)和操作條例》。MOG35-55（國(guó)泰生物），結(jié)核桿菌H37Ra（BD 公司），百日咳毒素（GLPBIO 公司），福氏完全佐劑（美國(guó)Sigma 公司），姜黃素（武漢恒意賽生物科技有限公司）；PBS 溶液（武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司），蛋白酶K（Roche 公司），DAPI 染液（武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司），TUNEL 試劑盒（Roche 公司），TLR4 抗體（武漢恒意賽生物科技有限公司），NF-κBp65 抗體（武漢恒意賽生物科技有限公司），髓樣 分 化 因 子88（myeloiddiferentiation factor 88，MyD88）（武漢恒意賽生物科技有限公司），Bcl-2 抗體（Mouse，IF），Bax 抗體（武漢恒意賽生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物造模及分組處理 將45 只小鼠隨機(jī)分為空白組、EAE 組、姜黃素組，每組15 只。EAE 組及姜黃素組制備EAE 模型。首先將MOG35-55 多肽用生理鹽水稀釋成5 mg/mL，然后加入相同體積（1∶1）的完全弗氏佐劑和一定量的結(jié)核菌素使之互相混合形成油包水乳劑，最終使水乳劑中結(jié)核桿菌H37Ra 濃度達(dá)4 mg/mL，接下來(lái)在實(shí)驗(yàn)小鼠脊柱兩側(cè)分別選4 個(gè)點(diǎn)皮下注射0.1 mL 的試劑，并且將百日咳毒素劑量為500 ng/只，于實(shí)驗(yàn)小鼠免疫注射的第0 天（0 h）、第2 天（48 h）進(jìn)行2 次腹腔內(nèi)注射。自造模當(dāng)日起空白組與EAE 組腹腔注射生理鹽 水1 mL·kg-1·d-1，姜黃素組小鼠分別以100 mg·kg-1·d-1連續(xù)腹腔注射，每日同一時(shí)間（上午9 時(shí)）由同一位實(shí)驗(yàn)員分別對(duì)各組小鼠的活動(dòng)、進(jìn)食、毛發(fā)分布情況、體重、四肢癱瘓情況、尾巴活動(dòng)情況等進(jìn)行相應(yīng)記錄，以Benson 5 分評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)每天對(duì)小鼠進(jìn)行1 次神經(jīng)功能障礙評(píng)分。自造模當(dāng)天開(kāi)始給藥至發(fā)病高峰期，處死小鼠取材。

1.2.2 HE 染色觀察小鼠脊髓組織病理變化 將發(fā)病高峰期小鼠取出，充分麻醉后暴露心臟，先用溫?zé)岬纳睇}水進(jìn)行灌注至肝臟發(fā)白，然后用4%多聚甲醛灌流（約30 min）后取出脊髓組織，行常規(guī)石蠟包埋，于腰膨大處連續(xù)切片，制作3～4 μm 石蠟切片，將復(fù)水完畢后置于蒸餾水中的石蠟切片輕輕甩干，使用HE 染色試劑盒中蘇木素染核5 min，用洗瓶中的蒸餾水輕輕沖洗，如鏡下觀察核著色過(guò)藍(lán)，則滴加1% 鹽酸酒精分色2 s，迅速水洗后，滴加0.5%氨水行返藍(lán)染色1 min，水洗，75%乙醇快沖過(guò)組織，勿洗，隨后滴加1%醇溶性伊紅染液30 s，水洗，使用100%乙醇對(duì)組織進(jìn)行脫水1 min，于通風(fēng)櫥中晾干，二甲苯透明10 min 后，于通風(fēng)櫥中晾干，最后滴加中性樹(shù)膠后，用蓋玻片封片，光鏡下觀察脊髓組織病理改變。

1.2.3 TUNEL 染色觀察小鼠細(xì)胞凋亡情況以及計(jì)算其凋亡陽(yáng)性細(xì)胞率 37 ℃下胰蛋白酶K 工作液處 理 組 織25 min，試 劑1（TdT）50 μL+試 劑2（dUTP）450 μL 混 勻，制 備TUNEL 反 應(yīng) 混 合 液，PBS 漂洗3 次，玻片干后，滴加50 μL TUNEL 反應(yīng)混合液于標(biāo)本上，加蓋玻片37 ℃下暗濕盒中反應(yīng)1 h，PBS 漂洗3 次，滴加50 μL DAPI 染液于標(biāo)本上，同樣條件下反應(yīng)30 min，PBS 漂洗3 次，滴加抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 免疫熒光檢測(cè)各組小鼠凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax 變化 將之前制備好的石蠟切片置于烘箱中（65 ℃）烘片2 h，脫蠟至水，PBS 洗3 次，并在組織周圍用免疫組化筆畫(huà)圈。以PBS 配置成的0.5% TritonX-100 對(duì) 組 織 行 破 膜 處 理10 min 后，PBS 緩 沖 液潤(rùn)洗3 次，每次5 min；滴加5%羊血清在室溫下封閉60 min；輕甩干玻片上的封閉液后，于脊髓組織上滴加50 μL 的目標(biāo)一抗（Bcl-2、Bax，1∶50），放入避光濕盒中于4 ℃冰箱中過(guò)夜；第二日取出濕盒中組織切片，PBS 緩沖液洗凈后，滴加濃度為1∶50 的熒光二抗（FITC 標(biāo)記的羊抗兔IgG）后，再次放入避光濕盒中，于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置1 h；PBS 緩沖液潤(rùn)洗3 次，每次5 min，將DAPI 染核試劑滴加到組織上，孵育10 min；傾去切片上多余的DAPI 染液，取適量抗熒光淬滅劑滴加于組織上并覆蓋，封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 Western Blot 檢測(cè)各組小鼠脊髓組織TLR4、NF-κBp65、MyD88 蛋白 將分離出的脊髓腰膨大組織用PBS 緩沖液反復(fù)清洗2～3 次，清洗后去除血污并將組織剪碎放置在勻漿器中，加用RIPA 裂解液并將總蛋白進(jìn)行提取，提取蛋白的濃度均采用BCA 濃度測(cè)定試劑盒完成，經(jīng)SDS-PAGE 電泳，于80 V 電泳30 min 后（當(dāng)?shù)鞍仔兄练蛛x膠，并可見(jiàn)marker 清楚分層），切換電壓至120 V 電泳2 h，配置轉(zhuǎn)膜液Trans buffer，將轉(zhuǎn)好的膜放置TBST 潤(rùn)洗5 min×3 次，5%脫脂奶粉封閉1 h 以結(jié)合PVDF膜上無(wú)關(guān)的蛋白反應(yīng)位點(diǎn)，TBST 潤(rùn)洗5 min×3 次，采用牛血清白蛋白配置的一抗稀釋液，孵一抗，于4 ℃恒溫中孵育過(guò)夜，回收抗體，TBST 反復(fù)沖洗3 次，5 min/次，沖洗后加入已稀釋的二抗，室溫條件下孵育30 min，最后用化學(xué)發(fā)光底物A 液與B 液1∶1 混合后孵育PVDF 膜并曝光，據(jù)不同光強(qiáng)度而調(diào)整對(duì)應(yīng)的曝光條件進(jìn)行顯相和定影，掃描膠片并存檔后應(yīng)用Alpha Ease FC 軟件處理系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)帶相應(yīng)的光密度值進(jìn)行分析，該結(jié)果即蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料使用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較均采用ANOVA 單因素方差分析，兩兩比較應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 即具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)EAE小鼠脊髓組織病理變化的影響

光鏡下觀察，空白組小鼠脊髓組織形態(tài)正常，EAE 組小鼠發(fā)病高峰期可見(jiàn)脊髓組織內(nèi)大量小血管充血，血管周圍可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，典型者可圍繞在小血管周圍形成“袖套”樣改變。姜黃素組炎性細(xì)胞減少，袖套樣現(xiàn)象少見(jiàn)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠脊髓組織切片病理觀察（HE 染色，×200）Fig 1 Pathological changes of HE staining in diffirent groups（HE staining，×200）

2.2 姜黃素對(duì)小鼠細(xì)胞凋亡的影響

熒光顯微鏡下，空白組小鼠被TUNEL 染色后熒光標(biāo)記的凋亡細(xì)胞數(shù)量少，Merge 圖中DAPI 染色細(xì)胞與凋亡細(xì)胞重合少；與空白組比較，EAE 組小鼠被熒光標(biāo)記的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多，Merge 圖中DAPI 染色細(xì)胞與凋亡細(xì)胞重合增多；與EAE 組比較，姜黃組小鼠凋亡細(xì)胞減少，Merge 圖中DAPI 染色細(xì)胞與凋亡細(xì)胞重合較EAE 組減少。見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠發(fā)病高峰期時(shí)脊髓組織（TUNEL 染色，×400）Fig 2 TUNEL staining in diffirent groups at the peak period（Tunel staining，×400）

與空白組比較，EAE 組和姜黃素組小鼠經(jīng)TUNEL 染色的凋亡細(xì)胞均明顯增多。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎發(fā)病過(guò)程中存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。與EAE 組比較，姜黃素組凋亡細(xì)胞數(shù)低，說(shuō)明姜黃素有減少EAE 小鼠脊髓細(xì)胞凋亡的作用。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠脊髓細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)的比較（±s）Tab 1 Comparison of positive cell rate of spinal cord neurons in each group

表1 各組小鼠脊髓細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)的比較（±s）Tab 1 Comparison of positive cell rate of spinal cord neurons in each group

注：與空白組比較，aP ＜0.01；與EAE 組比較，bP＜0.05。

凋亡細(xì)胞的數(shù)量(個(gè)/視野)4.63±3.22 39.22±3.13a 19.47±3.64ab 67.28＜0.01組別空白組EAE 組姜黃素組n555 FP

2.3 姜黃素對(duì)EAE 小鼠凋亡相關(guān)蛋白的影響

免疫熒光雙標(biāo)法熒光顯微鏡下，與空白組相比，EAE 組凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 的表達(dá)下降，Bax 的表達(dá)上升，初步推斷EAE 小鼠發(fā)病高峰期存在著明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象；與EAE 組相比，姜黃素組熒光顯微鏡下顯示凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 的表達(dá)上升，Bax 的表達(dá)下降，因此姜黃素可抑制凋亡蛋白產(chǎn)生，對(duì)EAE 小鼠起抗凋亡作用。見(jiàn)圖3。

圖3 免疫熒光雙標(biāo)法熒光顯微鏡下各組小鼠脊髓組織中Bcl-2 與Bax 表達(dá)情況（×400）Fig 3 Expression of Bcl-2 and Bax in spinal cord tissue of mice in each group under fluorescence microscope with double immunofluorescence method（×400）

2.4 姜 黃 素 對(duì)EAE 小 鼠TLRs/NF- κ B 信 號(hào)通路的影響

與空白組比較，EAE 組小鼠脊髓組織中TLR4、NF- κ Bp65、MyD88 蛋 白 水 平 升 高。差 異 具 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（P＜0.05）；EAE 組 小鼠與姜黃素組小鼠相比，姜黃素組小鼠脊髓 組 織 中TLR4、NF- κ Bp65、MyD88 蛋 白 水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖4 和圖5。

圖4 各組小鼠脊髓組織中TLR4、NF-κBp65、MyD88蛋白條帶Fig 4 Bands of TLR4，NF-κBp65，and MyD88 protein in spinal cord tissue of mice in each group

圖5 各組小鼠脊髓組織中TLR4、NF-κBp65、MyD88 蛋白表達(dá)水平比較Fig 5 Comparison of TLR4，NF-κBp65，and MyD88 protein levels in spinal cord of mice in each group

3 討論

MS 的發(fā)病及病理改變十分復(fù)雜，因此臨床上具有發(fā)病癥狀多、發(fā)病時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，典型的病理改變包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、白質(zhì)脫髓鞘、軸突破壞等，既往研究認(rèn)為MS 患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的形成多由T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)下的慢性脫髓鞘改變引起，但通過(guò)MS 患者尸檢證實(shí)，細(xì)胞凋亡是最早出現(xiàn)的病理改變之一，新病灶的出現(xiàn)先伴隨細(xì)胞凋亡，隨后再出現(xiàn)T、B 淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、髓鞘斷裂、髓鞘崩解、軸突損害等特征性的病理組織學(xué)改變［9，10］。在EAE模型中，TLRs/NF-κB 信號(hào)通路是啟動(dòng)炎癥調(diào)控、細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)通路。TLRs 先與特異性配體識(shí)別并與MD2 和CD14 結(jié)合，使白介素受體相關(guān)激酶-1 與髓樣分化因子88 連接和磷酸化。MyD88 作為TLRs 信號(hào)通路中重要的銜接蛋白，被磷酸化后將信號(hào)有序傳導(dǎo)致下游通路，激活下游的NF-κB，使機(jī)體出現(xiàn)相應(yīng)變化，最終啟動(dòng)自身免疫反應(yīng)［11］。細(xì)胞凋亡是機(jī)體的一種程序性死亡，與線粒體功能紊亂相關(guān)，線粒體細(xì)胞膜損傷導(dǎo)致細(xì)胞色素C 釋放，鈣離子內(nèi)流，ATP 生成障礙，導(dǎo)致凋亡發(fā)生［12］。而NF-κB 可激活Bax 蛋白，因此NF-κB 對(duì)細(xì)胞凋亡具有重要調(diào)節(jié)作用［13］。而在細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，Bcl-2 和Bax是最具代表性的凋亡相關(guān)基因。Bcl-2 是重要的抑制細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子，它通過(guò)抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C 等物質(zhì)抑制凋亡發(fā)生［14］。與Bcl-2 相反，Bax 作為Bcl-2 家族成員具有促進(jìn)凋亡的作用。Bax 激活后可以使下游的效應(yīng)元件caspase 家族對(duì)毗鄰的天冬氨酸依次有序的切割活化，促進(jìn)細(xì)胞色素C 的釋放，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡［15］，NF-κB 在體內(nèi)有RelA（p65）、RelB、cRel（Rel）、p50 和p52 五種形式，這些具有共同的N-末端和DNA 結(jié)合域/二聚體域的轉(zhuǎn)錄因子一般情況下以同源和異源二聚體存在于胞漿內(nèi)，NF-κB 激活后 誘 導(dǎo)IκB 基 因 磷 酸 化，IκB 基 因 磷 酸 化 后 失 去 對(duì)NF-κB 的抑制作用，NF-κB 遂從胞漿向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位，與上述二聚體結(jié)合，激活下游凋亡蛋白的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生細(xì)胞凋亡現(xiàn)象［16-18］。隨著大家對(duì)凋亡認(rèn)識(shí)的逐漸深入，凋亡已被證實(shí)與多種系統(tǒng)疾病相關(guān)，包括結(jié)締組織病、動(dòng)脈粥樣硬化、帕金森病、阿爾茨海默病等多種炎癥性疾病和退行性疾病的動(dòng)物模型中，細(xì)胞凋亡均被證實(shí)與病因相關(guān)。

在膿毒血癥、糖尿病、腫瘤等動(dòng)物模型及細(xì)胞分子研究中，使用姜黃素干預(yù)后，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象均受到抑制。Zhang 等［19］的多項(xiàng)研究表明，姜黃素可以阻斷TLRs/NF-κB 通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。推測(cè)姜黃素是通過(guò)抑制TLRs/NF-κB 信號(hào)通路的傳導(dǎo)，使Bax 蛋白轉(zhuǎn)錄減少，Bcl-2 蛋白轉(zhuǎn)錄增多，抑制細(xì)胞凋亡，減輕神經(jīng)元損傷，從而起保護(hù)作用。為驗(yàn)證推測(cè)，筆者做了以上相關(guān)研究。

本研究結(jié)果顯示，TUNEL 染色中，與空白組比較，EAE 組和姜黃素組小鼠經(jīng)TUNEL 染色的凋亡細(xì)胞均明顯增多，說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎發(fā)病過(guò)程中存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。與EAE 組比較，姜黃素組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少，說(shuō)明姜黃素有減少EAE 小鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的作用。本研究對(duì)TLRs/NF-κB 信號(hào)通路中的相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示姜黃素組中TLR4、NFκBp65、MyD88 條帶光密度值低于EAE 組，熒光顯微鏡下與EAE 組相比凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 的表達(dá)增加，Bax 的表達(dá)減少；EAE 組TLR4、NF-κBp65、MyD88條帶光密度值高于空白組及姜黃素組，熒光顯微鏡下凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 的數(shù)量低于空白組及姜黃素組，Bax 的數(shù)量高于空白組及姜黃素組；空白組TLR4、NF-κBp65、MyD88 條帶光密度值低于EAE組及姜黃素組。由此可以得出姜黃素通過(guò)抑制TLRs/NF-κB 信號(hào)通路的傳導(dǎo)，抑制細(xì)胞凋亡，減少凋亡對(duì)脊髓神經(jīng)細(xì)胞的損傷破壞，減輕神經(jīng)變性，從而對(duì)EAE 小鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞起保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)探討了TLRs/NF-κB 信號(hào)通路與凋亡的關(guān)系，而TLRs/NF-κB 信號(hào)通路同時(shí)還是調(diào)控炎癥反應(yīng)的重要通路，在MS 的發(fā)病機(jī)制中是否存在凋亡與炎癥細(xì)胞因子共同作用引起神經(jīng)細(xì)胞破壞，還需要更進(jìn)一步的研究證明。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

劉夢(mèng)蘭：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施、執(zhí)筆；謝陽(yáng)：實(shí)驗(yàn)實(shí)施；曾春蓉：實(shí)驗(yàn)評(píng)估；李作孝：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和審校。