吳 冰，張 蓮，郭 烽

（中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第940 醫(yī)院老年科，甘肅 蘭州 730050）

糖尿病發(fā)病率逐年升高，而心臟并發(fā)癥是糖尿病患者死亡的主要原因之一，主要表現(xiàn)為心臟充盈受損，舒張功能下降，心肌肥厚和纖維化，稱為糖尿病心肌?。╠iabetes acrdiomyopathy，DCM）。最新研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者心肌自噬活性增加［1］，而細(xì)胞自噬與心肌肥厚關(guān)系密切［2］。

淫羊藿苷（Icariin）是淫羊藿的主要活性成分，具有改善性功能、抗衰老、抗炎、減輕缺血損傷等作用。Icariin 能通過不同的信號(hào)通路調(diào)節(jié)自噬，且能減輕心肌纖維化［3］和心臟重構(gòu)［4］。然而，Icariin 能否通過調(diào)節(jié)自噬改善糖尿病心肌肥厚，國內(nèi)外未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究擬構(gòu)建糖尿病小鼠動(dòng)物模型，觀察Icariin 對糖尿病心肌肥厚的影響并探究相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雄性C57BL/6 小鼠購自聯(lián)勤保障部隊(duì)第940醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。鏈脲佐霉素（Streptozocin，STZ）、Icariin、mTOR 抑制劑雷帕霉素（Rapamycin）購自Sigma 公司；Beclin1、微管相關(guān)蛋白1 輕鏈-3B（MAP1LC3B，LC3B）、磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）（#2532）、磷酸化的AMPK（p-AMPK）（#2531）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）（#2983）、磷酸化的mTOR（p-mTOR）（#5536）抗體購自Cell Signaling Technology 公司；β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體及熒光標(biāo)記的二抗購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；B 型尿鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）和β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain，β-MHC）引物由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成。

1.2 糖尿病小鼠的建立

雄性C57BL/6 小鼠禁食12 h，腹腔注射55 mg/kg 1% STZ 檸檬酸鹽緩沖溶液，正常對照組小鼠注射相同體積的檸檬酸鹽緩沖液。連續(xù)注射5 d，每次注射后恢復(fù)自由取食。STZ 注射7 d后，測空腹血糖，空腹血糖為13.5～25 mmol/L，視為造模成功。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)

24 只實(shí)驗(yàn)C57BL/6 小鼠飼養(yǎng)于聯(lián)勤保障部隊(duì)第940 醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，鼠齡4～5 w，分為Ctrl 組（正常對照組）、DM 組（糖尿病組）、DM+ICA 組（糖尿病C57 小鼠灌胃Icariin 溶液80 mg·kg-1·d-1，連續(xù)3周）［5］，每組8 只。本實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物倫理規(guī)定，倫理審批編號(hào)：2020KYLL026。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測

心肌肥大的標(biāo)志因子BNP、β-MHC 表達(dá)量用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測。具體操作如下：提取各組心肌細(xì)胞總核糖核酸（RNA）并反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）。根據(jù)文獻(xiàn)［6］設(shè)計(jì)引物序列 ，BNP 正 向 引 物 5′-CAGAAGCTGCTGGAGCTGATAAG-3′； 反 向 引 物 5′-TGTAGGGCCTTGGTCCTTTG-3′；β-MHC 正向引物5′-ATCAAGGGAAAGCAGGAAGC-3′，反 向引物5′-CCTTGTCTACAGGTGCATCA-3′。后委托公司進(jìn)行引物合成。PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：包括2×SYBR green mix 10 μL，上下游引物各2 μL，10 ng cDNA，加ddH2O2至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃5 min，95 ℃15 s，60 ℃60 s，共35 個(gè)循環(huán)。

1.5 免疫印跡法（western blot）檢測蛋白表達(dá)

AMPK、mTOR 信號(hào)通路及自噬相關(guān)蛋白LC3B 及Beclin1，用免疫印跡法檢測。根據(jù)檢測蛋白分子量配制不同濃度的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠，將已定量的心肌組織蛋白加入梳孔中，進(jìn)行電泳。待溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠遠(yuǎn)端，應(yīng)用BIORAD 轉(zhuǎn)膜裝置轉(zhuǎn)膜。5%牛血清白蛋白封閉2 h，4 ℃一抗孵育過夜。次日孵育熒光標(biāo)記的二抗1 h，化學(xué)法發(fā)光、拍照。

1.6 超聲心動(dòng)圖檢測

提前1 d 心臟部位脫毛，用三溴乙醇麻醉小鼠，保證小鼠心率500～700 次/min，仰臥位固定采用Vevo 高分辨率動(dòng)物超聲儀對小鼠左室舒張末內(nèi)徑（LVEDD）、舒張期左室后壁厚度（LVPWD）、舒張期左室前壁厚度（LVAWD）、左室舒張末期容積（LVEDV）、左室收縮末期容積（LVESV）等指標(biāo)進(jìn)行檢測；每組數(shù)據(jù)均選取連續(xù)3 個(gè)心動(dòng)周期測量值的平均值。按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法［7］，計(jì)算左室質(zhì)量EF%=100×［LVEDV-LVESV］/LVEDV。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（±SEM）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)的比較采用配對t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Icariin 減低糖尿病小鼠心肌BNP 和β-MHC mRNA 表達(dá)

DM 組小鼠心肌肥大標(biāo)志因子BNP mRNA 表達(dá)量為（1.65±0.11），顯著高于Ctrl 組（1.00±0.05）（t=5.379，P＜0.05）。而Icariin 灌胃糖尿病小鼠心肌BNP mRNA 表達(dá)量為（1.20±0.06），顯著低于DM 組（t=3.591，P＜0.05）。見圖1A。

DM 組小鼠心肌肥大標(biāo)志因子β-MHC mRNA表達(dá)量為（1.40±0.09），顯著高于Ctrl 組（1.00±0.05）（t=3.885，P＜0.05）。而Icariin 灌胃糖尿病小鼠心肌β-MHC mRNA 表達(dá)量為（1.08±0.06），顯著低于DM 組（t=2.958，P＜0.05）。見圖1B。

圖1 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌BNP 和β-MHC mRNA 表達(dá)Fig 1 Myocardial hypertrophy markers BNP and β-MHC levels in experimental mice detected by real-time quantitative PCR

2.2 Icariin 減輕糖尿病小鼠左室質(zhì)量

DM 組小鼠左室質(zhì)量為(95.28±7.15) mg，顯著高 于Ctrl 組(75.29±5.38) mg(t=2.234，P＜0.05）。而Icariin 灌胃糖尿病小鼠心肌左室質(zhì)量為(74.76±5.52) mg，顯著低于DM 組（t=2.272，P＜0.05），見圖2A。

3 組試驗(yàn)小鼠心臟射血分?jǐn)?shù)分別為（61.18±5.75）%、（66.73±7.65）%、（64.58±6.20）%，3 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=0.1807，P＞0.05）。見圖2B。

圖2 超聲心動(dòng)圖檢測各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物左室質(zhì)量和射血分?jǐn)?shù)Fig 2 Left ventricular mass and ejection fraction in experimental mice detected by echocardiogram

2.3 Icariin 抑制糖尿病心肌的自噬

采用免疫印跡法檢測各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物L(fēng)C3B 和Beclin1 蛋白表達(dá)，見圖3A。結(jié)果顯示DM 組小鼠心肌自噬相關(guān)蛋白Beclin-1 相對表達(dá)量為（145.27±8.53），顯著高于Ctrl 組（100.0±5.25）（t=4.520，P＜0.05）。而Icariin 灌胃糖尿病小鼠心肌Beclin-1 相對表達(dá)量為（115.19±7.94），顯著低于DM 組（t=2.581，P＜0.05）。見圖3B。

DM 組小鼠自噬相關(guān)蛋白LC3B 相對表達(dá)量為（128.86±8.31），顯著高于Ctrl 組（100.0±5.56）（t=2.886，P＜0.05）。而Icariin 灌胃糖尿病小鼠心肌LC3B 相對表達(dá)量為（98.45±5.61），顯著低于DM組（t=3.033，P＜0.05）。見圖3C。

圖3 免疫印跡法檢測各組小鼠心肌LC3B 和Beclin-1 蛋白表達(dá)Fig 3 Myocardial LC3B and Beclin-1 protein expression in experimental mice detected by Western blotting detection

2.4 Icariin 通過AMPK-mTOR 信號(hào)通路抑制糖尿病心肌自噬

免疫印跡法檢測各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌AMPK、p-AMPK、mTOR 及p-mTOR 蛋 白 表 達(dá)，結(jié) 果 見 圖4A。 DM 組小鼠心肌p-AMPK 相對表達(dá)量為（160.37±8.77），顯著高于Ctrl 組（100.0±5.26）（t=5.903，P＜0.05）。而Icariin 灌胃糖尿病小鼠心肌p-AMPK 相對表達(dá)量為（108.45±7.19），顯著低于DM 組（t=4.578，P＜0.05）。見圖4B。

DM 組小鼠心肌p-mTOR 相對表達(dá)量為（68.22±7.67），顯著低于Ctrl 組（100.0±4.98）（t=3.475，P＜0.05）。而Icariin 灌胃糖尿病小鼠心肌pmTOR 相對表達(dá)量為（93.40±7.46），顯著高于DM 組（t=2.353，P＜0.05）。見圖4C。

圖4 免疫印跡法檢測各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌AMPK、p-AMPK、mTOR 及p-mTOR 蛋白表達(dá)Fig 4 Myocardial AMPK，p-AMPK，mTOR and p-mTOR protein expression in experimental animals detected with Western blotting method

2.5 mTOR 抑制劑Rapamycin 抵消Icariin 改善心肌肥厚的作用

DM 組小鼠左室質(zhì)量為（95.78±6.23）mg，顯著高于Ctrl 組（78.49±4.41）mg（t=2.265，P＜0.05）；Icariin 灌胃糖尿病小鼠心肌左室質(zhì)量為（77.58±5.14）mg，顯著低于DM 組（t=2.253，P＜0.05）。然而，DM+ICA+R 組 心 肌 左 室 質(zhì) 量 為（98.27±6.54），表明mTOR 抑制劑Rapamycin 可抵消Icariin改 善 心 肌 肥 厚 的 作 用（t=2.487，P＜0.05）。見圖5。

圖5 超聲心動(dòng)圖檢測各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物左室質(zhì)量Fig 5 Left ventricular mass in experimental animals detected by echocardiogram

3 討論

糖尿病心肌病是心衰的重要原因，而心臟肥厚和舒張功能障礙是糖尿病心肌病的主要標(biāo)志［8］。同以往的研究結(jié)果相似，本研究建立了糖尿病小鼠動(dòng)物模型，通過實(shí)時(shí)定量PCR 及心臟超聲檢測發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠心肌BNP及β-MHC基因表達(dá)顯著升高，左室質(zhì)量增加。BNP 及β-MHC 是心肌肥厚的分子標(biāo)志，檢測這些基因的表達(dá)改變不僅可以確認(rèn)心臟肥厚的存在，而且可以判斷肥厚的程度以及預(yù)后［9］。

細(xì)胞代謝，增殖，非編碼RNA，免疫應(yīng)答，翻譯調(diào)節(jié)和表觀遺傳修飾正向或負(fù)向調(diào)節(jié)心臟肥大［10］。而最新研究表明，細(xì)胞自噬在心肌肥大中發(fā)揮重要的作用［11］，纈沙坦降低高血壓動(dòng)物模型的心臟自噬及 左 室 肥 厚［12］。大 蒜 素 通 過PI3K/Akt/mTOR 和MAPK/ERK/mTOR 信號(hào)通路抑制自噬，減輕心肌肥大［13］。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病心肌LC3 和Beclin1 蛋白表達(dá)顯著升高，LC3 與Beclin-1 蛋白參與細(xì)胞自噬體的形成，可以反映糖尿病心肌細(xì)胞的自噬功能的增強(qiáng)。自噬作為機(jī)體的一種自我防御機(jī)制，保護(hù)心肌細(xì)胞減輕衰老及缺血誘導(dǎo)的心肌肥大；然而，過度激活的自噬會(huì)加重心肌肥厚和纖維化，導(dǎo)致心室擴(kuò)張，降低收縮功能［14］。

Icariin 是我國常用中草藥淫羊藿的活性成分［15］，具有很高的藥用價(jià)值。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，Icariin可通過激活ERK 信號(hào)通路，抑制心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激［16］；Icariin 降低糖尿病大鼠心肌膠原含量及心肌線粒體ROS 水平，增加SOD 活性，改善心臟功能［17］。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)：Icariin 能夠通過SIRT1/FoxO1 信號(hào)通路減輕心臟缺血再灌注損傷［18］。然而，目前尚未見到Icariin 通過調(diào)節(jié)自噬減輕糖尿病心肌肥大的相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)Icariin可顯著降低糖尿病心肌LC3 和Beclin-1 蛋白表達(dá)，表明Icariin 能夠改善糖尿病心肌過度激活的自噬功能。

然而Icariin 是如何調(diào)控糖尿病心肌的自噬功能目前尚不清楚。細(xì)胞的自噬功能受到細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)［19，20］。通過免疫印跡法和實(shí)時(shí)定量PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，糖尿病心肌p-AMPK 蛋白的表達(dá)顯著升高，p-mTOR 表達(dá)顯著降低，而Icariin 能夠逆轉(zhuǎn)上述改變，并且能夠降低糖尿病心肌BNP及β-MHC基因的表達(dá)；然而，Icariin 逆轉(zhuǎn)左室肥厚的功效可被mTOR 抑制劑Rapamycin 所抵消。上述研究表明Icariin 可能通過增強(qiáng)AMPK-mTOR 信號(hào)通路的活性，抑制糖尿病心肌細(xì)胞的自噬，減輕心肌肥厚。

綜上所述，筆者認(rèn)為糖尿病心肌自噬功能增強(qiáng)是糖尿病心肌肥厚的重要機(jī)制，而Icariin 可能通過AMPK-mTOR 信號(hào)通路抑制糖尿病心肌細(xì)胞的自噬，減輕糖尿病所致的心肌肥厚。不足的是，本研究未能對糖尿病心肌細(xì)胞自噬升高的程度進(jìn)行量化研究，且調(diào)節(jié)糖尿病心肌細(xì)胞自噬減輕心肌肥厚的具體機(jī)制，仍有待進(jìn)一步的深入研究。

作者貢獻(xiàn)度說明：

吳冰：課題設(shè)計(jì)，文章撰寫；張蓮：各項(xiàng)試驗(yàn)的完成；郭烽：課題設(shè)計(jì)與試驗(yàn)完成。