劉世琳，李宇輝，王俊鋼*，盧士玲*，李曉楠，李蕊婷，岳建平

1(石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子，832000)2(新疆農(nóng)墾科學(xué)院,農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆 石河子，832000) 3(新疆農(nóng)墾科學(xué)院,農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，新疆 石河子，832000)4(額敏縣新大同創(chuàng)生物工程有限責任公司，新疆 額敏，834699)

風干牛肉是哈薩克族傳統(tǒng)美食，以牛肉為原料，短時腌制后再經(jīng)風干后熟制作而成。牛肉在風干過程中，蛋白質(zhì)適度降解產(chǎn)生的非蛋白質(zhì)化合物(多肽、肽、游離氨基酸及其衍生化合物)，能夠改善產(chǎn)品表面色澤、提高產(chǎn)品營養(yǎng)價值[1]。但牛肉蛋白質(zhì)發(fā)生熱變性、氧化和其他蛋白質(zhì)修飾會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)發(fā)生重大變化，包括側(cè)鏈基團的氧化、骨架斷裂、交聯(lián)、解折疊、疏水性和構(gòu)象變化[2]，改變對蛋白水解酶的敏感性并形成新的反應(yīng)性基團[3]，對牛肉加工特性和食用品質(zhì)產(chǎn)生消極作用[3]。因此，在發(fā)酵肉制品加工及流通過程中，如何抑制蛋白質(zhì)的過度氧化受到人們的廣泛關(guān)注。

蛋白水解是牛肉制品發(fā)酵過程中最重要的反應(yīng)之一，由肉類組織中存在的內(nèi)源酶或添加的發(fā)酵劑的微生物源催化。在肉制品發(fā)酵過程中，葡萄球菌、微球菌、乳酸菌均能產(chǎn)生蛋白酶，被認為是導(dǎo)致肉制品中蛋白水解現(xiàn)象的主要微生物[4]。盡管發(fā)酵肉制品負責蛋白質(zhì)降解的主要是內(nèi)源酶，但細菌蛋白酶和肽酶能夠顯著促進肌原纖維和肌漿蛋白的分解以及小肽和氨基酸的釋放[5]。肉制品中蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的非蛋白質(zhì)化合物，除了有利于增進風味外，還具有一定的抗氧化作用[6]。最近的研究證實，從發(fā)酵肉制品中提取的肽具有抗氧化活性，可以替代食品系統(tǒng)中的合成抗氧化劑[7]。此外，CAO 等[8]發(fā)現(xiàn)，用產(chǎn)蛋白酶活力較高的植物乳桿菌CD101發(fā)酵香腸，其肽抗氧化活性顯著提高。因此，研究具有較高蛋白酶活性的發(fā)酵劑培養(yǎng)物對于抑制蛋白質(zhì)氧化、生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)風干牛肉非常重要。

課題組前期從新疆傳統(tǒng)風干肉中分離出了3株具有較強蛋白酶水解活性的乳酸菌，乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)(S-1)、格式乳球菌(Lactococcusgracilis)(S-2)和戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)(S-3)。本研究將 S-1、S-2、S-3作為發(fā)酵劑接種到牛肉中制作風干肉，以自然風干牛肉作為對照組，利用化學(xué)方法檢測蛋白氧化變性，探究不同產(chǎn)蛋白酶乳酸菌對風干牛肉蛋白質(zhì)氧化的影響；并利用拉曼光譜技術(shù)對牛肉蛋白進行掃描，嘗試在分子水平上闡明牛肉蛋白質(zhì)的氧化變性，為抑制牛肉蛋白質(zhì)氧化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛后腿肉, 市購；Na2HPO4、NaH2PO4、2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine, DNPH), 北京百奧萊博科技有限公司；三氯乙酸、鹽酸胍、乙酸乙酯、Tris, 北京索萊寶科技有限公司；尿素、溴酚藍、β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate， SDS), 上海澤葉生物科技有限公司；實驗所用試劑均為分析純或生化級。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250C恒溫恒濕箱、101型電熱鼓風干燥箱， 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；DZ-40C2SA 多功能真空包裝機， 南通成盛機械有限公司；HENC實驗室攪拌機， 上海恒川機械設(shè)備有限公司；UV-1800紫外分光光度計， 北京世紀科信科學(xué)儀器有限公司；TGL16A高速冷凍離心機， 湖南凱達科學(xué)儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋， 常州澳華儀器有限公司；Bruker SENTERRAII智能顯微共聚焦拉曼光譜儀，重慶浩納科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 風干肉的制備

前處理：選擇新鮮的牛肉后腿，去除骨、筋腱，用冷水淋洗，切割修整為長條狀(200 g)；腌制期：加入糖1%、鹽2.5%(均為質(zhì)量分數(shù))以及亞硝酸鈉100 mg/kg(腌制溫度4 ℃、腌制時間12 h)；發(fā)酵期：在肉中接種不同產(chǎn)蛋白酶乳酸菌發(fā)酵劑(濃度1.0×107CFU/g，溫度15 ℃、濕度70%、發(fā)酵時間24 h)；風干期：溫度40 ℃，時間48 h；貯藏期：溫度4 ℃，貯藏14 d。分別在前處理結(jié)束、腌制結(jié)束、風干0、1、2 d以及貯藏第7、14天取樣。每個采樣點各取5份樣品(約200 g)，將樣品迅速保存于-20 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取

取一定量肉樣切塊后絞碎，取5 g放入離心管中，加入20 mL分離緩沖液I (10 mmol/L、pH 7.0的PBS緩沖液，含2 mmol/L MgCI2·6H2O、1 mmol/L EGTA)，在10 000×g條件冰浴下勻漿1 min。然后在4 ℃條件下，7 500×g離心10 min，除上清液取沉淀，再加入分離緩沖液I，相同操作重復(fù)3次，制得粗蛋白。再加入20 mL分離緩沖液Ⅱ(10 mmol/L、pH 7.0的PBS緩沖液)，用磁力攪拌器慢速混勻20 min。然后在4 ℃、7 500×g條件下離心10 min，去除上清液，取沉淀，相同操作重復(fù)3次，得到肌原纖維蛋白質(zhì)。

1.3.3 羰基含量測定

參考段麗菊等[9]的方法進行測定。用0.1 mol/L PBS(pH 7.4，0.6 mol/L NaCl)將肌原纖維蛋白稀釋至2 mg/mL，吸取500 μL 2 mg/mL的蛋白液分裝至2個10 mL離心管，其中一份加入2 mL 2 mol/L HCl溶液處理(對照)，另一份用2 mL含0.2%DNPH的2 mol/L HCl溶液處理。再加入4 mL 200 g/L三氯乙酸(trichloroacetic acid solution, TCA)沉淀蛋白，置于恒溫水浴鍋中，37 ℃條件下避光保溫30 min。隨后在10 000×g條件下離心15 min，沉淀用2 mLV(乙醇)∶V(乙酸乙酯)=1∶1洗滌3次。洗滌結(jié)束后加入3 mL TCA溶液，10 000×g離心15 min后取沉淀，用2 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液(含20 mmol/L，pH 6.5的磷酸鹽緩沖液)溶解，10 000×g離心15 min，在370 nm 處測定上清液的吸光度。羰基濃度用摩爾消光系數(shù)22 000 L/(mol·cm)來計算，將總羰基濃度表示為每毫克蛋白質(zhì)羰基的納摩爾濃度。

1.3.4 巰基含量測定

測定參照ELLMAN[10]的方法，略作修改。吸取1 mL 2 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液與8 mL PBS緩沖液(pH 8.0，0.086 mmol/L Tris-HCl、0.09 mol/L甘氨酸、4 mmol/L EDTA、8 mol/L尿素)置于10 mL離心管中，并以10 000×g離心15 min。取4.5 mL上清液與0.5 mL Ellman試劑(10 mmol/L DTNB)混合，在黑暗中于40 ℃條件下放置25 min，然后冷卻至室溫，在412 nm處測量其吸光度。巰基濃度用摩爾消光系數(shù)13 600 L/(mol·cm)來計算，結(jié)果表示為每毫克蛋白質(zhì)總巰基的納摩爾濃度。對照組除不加蛋白溶液外，其他處理方法均如上所述。

1.3.5 表面疏水性測定

表面疏水性的測定參照CHELH 等[11]的方法。吸取1 mL 2 mg/mL的蛋白液懸浮液分裝至2個10 mL離心管，其中一份加入0.1 mol/L的PBS緩沖液(對照組)，另一份加入200 μL 1 mg/mL的溴酚藍溶液，渦旋混勻15 min。混合液4 000×g離心15 min后取上清液，測定上清液595 nm處的吸光度。表面疏水性以溴酚藍結(jié)合量表示，按公式(1)計算:

(1)

式中：BPB表示溴酚藍結(jié)合量(μg)，用以表征肌原纖維蛋白表面疏水性；Ac表示空白組的吸光值；As表示樣品的吸光值。

1.3.6 蛋白質(zhì)相互分子作用力測定

參考VISESSANGUAN等[12]的方法。溶液包括：B1：0.6 mol/L KCl；B2：20 mmol/L Tris，pH 8.0；B3：20 mmol/L Tris、10 g/L SDS，pH 8.0；B4：20 mmol/L Tris、10 g/L SDS、8 mol/L尿素，pH 8.0；B5：20 mmol/L Tris、10 g/L SDS、8 mol/L尿素、2% (體積分數(shù))β-巰基乙醇，pH 8.0；B6：0.5 mol/L NaOH，pH 8.0。取2 g絞碎肉樣置于20 mL冷凍離心管，分別加入20 mL上述溶液，在10 000×g條件下冰浴勻漿1 min。隨后以10 000×g離心30 min，吸取4 mL上清液置于10 mL離心管中并加入1 mL 50% TCA溶液，在4 ℃條件下放置12 h后以4 000×g離心20 min，去上清液，用4 mL 0.5 mol/L NaOH溶液溶解沉淀1 h，采用雙縮脲法測定溶解液的蛋白含量。結(jié)果以各部分的蛋白溶解量與B6的蛋白溶解量的百分比表示。

1.3.7 拉曼光譜掃描

將少量牛肉蛋白樣品鋪在載玻片上，將其置于拉曼光譜儀樣品載物臺上進行掃描。氬離子激光器用作掃描光源，激光波長為532 nm，拉曼位移波數(shù)為50～4 500 cm-1，采集時間為10 s，累積2次。每個樣品取3個點掃描，最終拉曼光譜曲線取3次結(jié)果的平均值。采用LabSpec 6光譜軟件進行基點校正并去除熒光背景，以(1 004±2)cm-1處峰位為內(nèi)標進行歸一化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過Peakfit 4.12軟件進行峰分離和曲線擬合，以對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進行定量分析，并使用Origin Pro 2020軟件對數(shù)據(jù)進行分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 羰基含量變化

蛋白質(zhì)羰基的產(chǎn)生是自由基對蛋白質(zhì)分子進行氧化修飾的重要標志，通過測量羰基含量可以確定蛋白質(zhì)是否受到氧化損傷[13]。牛肉樣品中羰基含量的變化如圖1所示。

圖1 不同加工階段及貯藏過程中產(chǎn)蛋白酶乳酸菌 對風干牛肉羰基含量的影響Fig.1 Effect of protease-producing lactic acid bacteria on the carbonyl value of air-dried beef during different processing stages and storage注：圖中相同字母表示同一階段數(shù)據(jù)差異不顯著(P>0.05)， 不同字母表示同一階段數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)(下同)

由圖1可知，在整個加工階段肌原纖維蛋白羰基含量呈上升趨勢，且差異顯著(P<0.05)。這種氧化可能是由于肌原纖維蛋白中一些氨基酸受到自由基的攻擊轉(zhuǎn)變成了羰基衍生物[14]。風干0 d時，4組的肌原纖維蛋白羰基含量分別為3.42 nmol/mg蛋白(CK組)、2.54 nmol/mg蛋白(S-1組)、2.77 nmol/mg蛋白(S-2組)、2.64 nmol/mg蛋白(S-3組)，CK組羰基含量增加最大。風干結(jié)束時，S-1、S-2、S-3組之間差異不顯著(P>0.05)，但仍顯著高于CK組(P<0.05)，說明接種的產(chǎn)蛋白酶乳酸菌起到了一定的抗氧化作用，可能是由于蛋白酶將蛋白質(zhì)降解為許多具有抗氧化活性的多肽等小分子物質(zhì)，從而提高風干牛肉的氧化穩(wěn)定性[15]。貯藏期間S-1、S-3組的羰基含量顯著低于CK組和S-2組，可能與菌種產(chǎn)蛋白酶的能力不同有關(guān)。

2.2 巰基含量變化

半胱氨酸殘基中的巰基是所有蛋白質(zhì)氨基酸殘基中最活潑的基團，具有一定的抗氧化作用[16]。牛肉樣品中巰基含量的變化如圖2所示。發(fā)酵期4組風干肉總巰基含量均顯著下降(P<0.05)，說明此階段蛋白氧化較為嚴重[17]。在風干2 d后，4組的總巰基含量分別減少了31.61 nmol/mg蛋白(CK組、P>0.05)、24.13 nmol/mg蛋白(S-1組、P>0.05)、24.71 nmol/mg蛋白(S-2組、P>0.05)、12.06 nmol/mg蛋白(S-3組、P<0.05)。貯藏14 d后，S-1、S-2、S-3組巰基含量明顯高于CK組(P<0.05)?？梢娊?jīng)產(chǎn)蛋白酶乳酸菌發(fā)酵的牛肉在一定程度上能夠抑制蛋白氧化，抗氧化能力可能與蛋白酶增加的抗氧化活性肽和游離氨基酸的數(shù)量有關(guān)[18]。

圖2 不同加工階段及貯藏過程產(chǎn)蛋白酶乳酸菌對 風干牛肉巰基含量的影響Fig.2 Effect of protease-producing lactic acid bacteria on the sulfhydryl content of air-dried beef in different processing stages and storage

2.3 表面疏水性的變化

疏水相互作用能夠?qū)Φ鞍讟?gòu)象結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及蛋白的功能特性起到重要作用，可用于監(jiān)測蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)狀態(tài)的細微變化[19]。牛肉樣品表面疏水性含量變化如圖3所示。

圖3 不同加工階段及貯藏過程中產(chǎn)蛋白酶乳酸菌 對風干牛肉表面疏水性的影響Fig.3 Effect of protease-producing lactic acid bacteria on the surface hydrophobicity of air-dried beef in different processing stages and storage

如圖3所示，表面疏水性受到風干時間的顯著影響(P<0.05)。CK組肌原纖維蛋白表面疏水性從風干0 d開始急劇上升，貯藏7 d增長趨勢減緩，14 d后又開始緩慢上升；S-1組肌原纖維蛋白表面疏水性在風干1 d后開始逐漸上升，與S-2組趨勢相似，且最終與S-2組無明顯差異。在風干以及貯藏期間，CK組的蛋白質(zhì)表面疏水性顯著高于其他組(P<0.05)。在風干結(jié)束后，S-1、S-2的表面疏水性顯著低于CK組和S-3組的表面疏水性(P<0.05)，說明CK組和S-3組蛋白質(zhì)構(gòu)象更趨向于無序松散狀態(tài)?？赡苁怯捎贑K組和S-3組維持蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的作用力較弱，疏水殘基暴露，從而增加了蛋白質(zhì)的變性程度[20]。有研究表明，蛋白質(zhì)的表面疏水性與α-螺旋含量呈線性負相關(guān)，同時也與β-折疊含量密切相關(guān)[21]。

2.4 蛋白質(zhì)分子相互作用力在牛肉發(fā)酵中的變化

蛋白質(zhì)在不同溶劑中的溶解度分別代表靜電相互作用、氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵對蛋白三級結(jié)構(gòu)的貢獻，結(jié)果見表1。

表1 不同加工階段及貯藏過程中產(chǎn)蛋白酶乳酸菌對風干牛肉蛋白質(zhì)分子相互作用力的影響 單位：%

從量的角度看，在整個加工階段 B3、B4、B5 含量均較高，說明牛肉蛋白的結(jié)構(gòu)通過氫鍵、疏水相互作用力和二硫鍵得以維持，而靜電相互作用力影響較?。伙L干后這幾種作用力對蛋白三維結(jié)構(gòu)的貢獻發(fā)生了改變。蛋白質(zhì)在B1中的溶解度有所降低但未顯示出規(guī)律性的變化；B3溶解度在風干期間逐漸增加，貯藏期間保持穩(wěn)定略降；B4在加工前期不斷增加，風干2 d后趨于平穩(wěn)。貯藏結(jié)束時B4 > B5> B3，表明疏水相互作用和二硫鍵在貯藏結(jié)束的牛肉蛋白三維結(jié)構(gòu)中起主導(dǎo)作用；二硫鍵可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)的折疊構(gòu)象并降低構(gòu)象熵，從而改善其熱力學(xué)穩(wěn)定性[22]，S-2、S-3在B5中的溶解度顯著高于CK組，說明S-2、S-3蛋白質(zhì)中形成二硫鍵較多，空間結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定。這些變化對牛肉蛋白凝膠結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定性具有重要影響，可以影響風干牛肉感官品質(zhì)和營養(yǎng)特性[23]。

2.5 風干牛肉肌原纖維蛋白拉曼光譜圖

拉曼光譜技術(shù)可以通過反射氨基酸或者肽鏈的不同種振動模式獲得響應(yīng)信號，從而提供包含蛋白質(zhì)分子二級和三級結(jié)構(gòu)信息的光譜信息圖。由圖4可知，用不同產(chǎn)蛋白酶乳酸菌處理的風干牛肉拉曼光譜基本一致，4組風干牛肉蛋白的空間構(gòu)象與氨基酸殘基微環(huán)境的變化主要體現(xiàn)在500～1 800 cm-1和2 850～3 050 cm-1兩部分。通過比較上述2條重要拉曼譜帶的特征峰位置和相對峰強度，可以闡釋不同產(chǎn)蛋白酶乳酸菌處理對風干牛肉蛋白結(jié)構(gòu)變化的具體影響[24]。風干牛肉蛋白肽鍵骨架和氨基酸側(cè)鏈的拉曼光譜區(qū)帶指認結(jié)果如表2所示。

圖4 不同產(chǎn)蛋白酶乳酸菌處理的風干牛肉肌 原纖維蛋白拉曼光譜Fig.4 Raman spectra of air-dried beef myofibrillar protein treated with different protease-producing lactic acid bacteria

2.6 用酰胺I譜帶分析風干牛肉肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化

用于表征肉蛋白二級結(jié)構(gòu)的酰胺Ⅰ譜帶的拉曼光譜通常集中在1 645～1 685 cm-1，包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)卷曲，歸屬的拉曼譜帶分別為1 650～1 658 cm-1、1 660～1 665 cm-1、1 665～1 680 cm-1和1 680～1 690 cm-1。通過肌原纖維蛋白特征吸收峰的移動以及肌原纖維蛋白吸光度強度的不同，能夠顯示肌原纖維蛋白氨基酸殘基總吸光度以及蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的改變[25]。如圖5所示，加工結(jié)束后，CK組、S-1組、S-2組、S-3組主導(dǎo)峰分別為1 643.5、1 654.5、1 648.5、1 652 cm-1，說明S-1、S-2、S-3組的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量較高，可能與乳酸菌蛋白酶促進蛋白降解從而引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、蛋白等電點和疏水性改變有關(guān)[26]。

表2 風干牛肉肌原纖維蛋白拉曼光譜條帶的指認Table 2 Identification of Raman spectral bands of air-dried beef myofibrillar protein

圖5 不同產(chǎn)蛋白酶乳酸菌處理的風干牛肉肌 原纖維蛋白的拉曼光譜Fig.5 Raman spectra of air-dried beef myofibrillar protein treated with different protease-producing lactic acid bacteria

2.7 肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)的定量分析

用ALIX等[27]的方法對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行定量分析，結(jié)果見圖6，與CK組相比，添加產(chǎn)蛋白酶乳酸菌明顯降低了β-折疊含量，α-螺旋含量有明顯增加(P<0.05)，其中S-1組比S-2 (22.23%)、S-3 (25.36%)處理的樣品和CK組的樣品(20.03%)保持更高的α-螺旋比例(33.37%)(P<0.05)。此外，添加S-2、S-3的樣品與CK組相比，無規(guī)卷曲含量無明顯差異(P>0.05)。有研究表明，蛋白質(zhì)中的α-螺旋含量與硬度呈負相關(guān)，無規(guī)卷曲與彈性呈正相關(guān)[28]。由此可以推斷，添加產(chǎn)蛋白酶乳酸菌能夠降低風干牛肉硬度，提高牛肉的嫩度，而對彈性無明顯作用。

圖6 拉曼光譜定量風干牛肉肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)Fig.6 Raman spectroscopy to quantify the secondary structure of air-dried beef myofibril protein

3 結(jié)論

不同產(chǎn)蛋白酶乳酸菌處理的風干牛肉在不同加工階段，蛋白質(zhì)氧化變化比較一致。3組樣品中肌原纖維蛋白的羰基含量降低、巰基含量增加、表面疏水性降低，這表明產(chǎn)蛋白酶乳酸菌對牛肉風干過程中的蛋白質(zhì)氧化具有一定的抑制作用，其中S-1組對蛋白質(zhì)氧化的抑制作用最強。拉曼光譜對風干牛肉中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果表明，與對照組相比，添加產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的風干牛肉α-螺旋相對含量顯著增加，β-折疊的相對含量顯著降低，表明產(chǎn)蛋白酶乳酸菌發(fā)酵能夠降低蛋白質(zhì)聚集程度，顯著提高傳統(tǒng)風干牛肉的嫩度。