汪凌旭，易卓林，趙 海，黃 丹，羅惠波

（1. 四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000；2. 釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；3. 中國科學(xué)院環(huán)境與應(yīng)用微生物重點實驗室，成都 610041；4. 環(huán)境微生物四川省重點實驗室 成都 610041）

引 言

大曲是以小麥為主要原料制成的形狀較大、含有豐富菌系和酶系的曲塊，是釀酒用的糖化劑及發(fā)酵劑。大曲作為一種最古老的粗酶制劑，很早就被廣泛應(yīng)用于我國的釀酒行業(yè)。與西方純菌液態(tài)發(fā)酵的蒸餾酒相比，大曲酒是由多種微生物固態(tài)發(fā)酵所制成的大曲為發(fā)酵劑，采用獨特的邊糖化邊發(fā)酵的固態(tài)發(fā)酵工藝釀造而成。大曲獨一無二的固態(tài)制曲和固態(tài)發(fā)酵工藝［1］，是它區(qū)別于國外所有蒸餾酒的關(guān)鍵。

大曲的制作工藝復(fù)雜，大致包括潤麥、粉碎、拌料、成型、入室培菌、打攏以及入庫貯存等步驟［2］。制曲過程中，大曲在開放條件下網(wǎng)羅自然界中的微生物。大曲中多種微生物混合生長，經(jīng)協(xié)同和競爭發(fā)展，最終形成了穩(wěn)定的特色菌系。大曲微生物生長的同時，還產(chǎn)生多種酶和代謝產(chǎn)物，使大曲成為3 種體系平衡的復(fù)合體。影響大曲平衡的因素有很多，原料、水分、pH、溫度等因素都能影響微生物的生長以及酶和代謝產(chǎn)物的生成［3］。進一步研究證實，微生物的多樣性及其所產(chǎn)功能酶的協(xié)同作用是形成白酒感官風(fēng)味的關(guān)鍵，對大曲的好壞起決定性的作用，所以對大曲中菌系和酶系的研究顯得尤為重要。大曲微生物的研究可分為培養(yǎng)方法與非培養(yǎng)方法兩種。培養(yǎng)方法指無菌接種，分離培養(yǎng)大曲中的微生物菌種，并對其生理及代謝功能進行研究。該方法可為后續(xù)研究白酒的化學(xué)性質(zhì)和形成機理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。非培養(yǎng)方法主要是指聚合酶鏈式反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）、454 焦磷酸測序、SOLiD 連接法測序、Illumina 合成測序（Solexa 測序、Hiseq 測序）以及宏基因組等組學(xué)技術(shù)。該方法能在完成大曲基因組學(xué)測序和注釋的同時，一定程度上解析功能基因組，極大地促進了非培養(yǎng)微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)等研究的進展。大曲酶系的研究在初期主要集中于化學(xué)檢測法和高效液相色譜法（HPLC）分析大曲粗酶液以及自大曲分離的純菌所產(chǎn)粗酶的酶學(xué)性質(zhì)，而后采用宏轉(zhuǎn)錄組等組學(xué)技術(shù)檢測大曲酶系種類，以揭示大曲活躍微生物和酶譜。如今大曲酶系研究的難點主要體現(xiàn)在大曲宏轉(zhuǎn)錄組和宏蛋白組提取時容易降解、難以完全獲取以及來源于大曲的酶基因在不同表達系統(tǒng)中實現(xiàn)異源表達得到純酶兩個方面。

大曲按其制曲溫度可分高溫大曲、中溫大曲和低溫大曲，代表曲分別是為醬香型大曲、濃香型大曲以及清香型大曲。目前濃香大曲酒占據(jù)了70% 白酒市場份額［4］，為當(dāng)?shù)亟?jīng)濟的發(fā)展做出了重要的貢獻。因此，本文將從菌系、酶系以及它們在大曲中的應(yīng)用這3 個方面來闡述濃香型大曲的研究進展。

1 大曲微生物——菌系

濃香型白酒微生物的分離篩選始于20 世紀60 年代［5］，起初利用純培養(yǎng)方法分離、篩選、鑒定濃香型大曲中的微生物菌種，并簡單研究其生理代謝功能。隨著技術(shù)的進步，又采用PCR-DGGE、454 焦磷酸測序、Illumina MiSeq以及宏基因組學(xué)等技術(shù)對微生物的種類、數(shù)量、分布以及動態(tài)變化進行研究。

早在1995年，唐玉明等［6］就采用純培養(yǎng)方法從瀘州老窖大曲分離到酵母菌、霉菌、細菌以及芽孢桿菌。而后，祝云飛等［7］人采用Biolog 技術(shù)來鑒定基于純培養(yǎng)得到休哈塔假絲酵母。目前使用較多的方式，是將傳統(tǒng)純培養(yǎng)和頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）等新技術(shù)相結(jié)合研究大曲微生物，在一定程度上追溯濃香型大曲酒感官風(fēng)味的來源。明紅梅等［8］采用純培養(yǎng)方法從濃香型大曲篩選出地衣芽孢桿菌和異常威克漢姆酵母等產(chǎn)濃郁香氣的菌株。經(jīng)HS-SPME-GC-MS 檢測，兩株菌產(chǎn)生的香味物質(zhì)，如2,3,5-三甲基吡嗪等，皆是濃香型大曲香味的重要組成成分。大曲中的香味物質(zhì)主要來源于細菌和酵母菌，對這些風(fēng)味產(chǎn)生菌進行研究，能做到感官風(fēng)味的溯源以及產(chǎn)香菌株的性能優(yōu)化。由于白酒是地域性很強的產(chǎn)品，溯源其風(fēng)味物質(zhì)不僅有利于提高大曲質(zhì)量，還有利于在異地重現(xiàn)名優(yōu)酒品質(zhì)和風(fēng)味。

純培養(yǎng)分離方法具有耗時長、效率低，且只能分離篩選一部分可培養(yǎng)微生物等缺點，于是各種非培養(yǎng)方式被不斷地用于濃香型大曲微生物的研究。如表1 所示，葉光斌等［9］與Yan 等［10］采用PCR-DGGE 技術(shù)分析了大曲生產(chǎn)過程中細菌和真菌群落的多樣性；Huang 等［11］采用454 焦磷酸測序技術(shù)分析了濃香型大曲高溫制曲階段微生物的多樣性和豐富度；Wang 等［12］采用Illumina MiSeq技術(shù)分析了濃香型大曲中的好氧菌、兼性好氧菌；Yang等［13］采用Illumina MiSeq技術(shù)分析了不同時期菌的優(yōu)勢菌群；Wang 等［14］采用高通量測序分析得到了大曲優(yōu)勢菌群的種類；翟磊等［15］采用宏基因組學(xué)測得不同來源的大曲微生物種群，并比較了其差異性。PCR-DGGE和現(xiàn)代高效測序技術(shù)應(yīng)用于大曲，能更加高效、全面地解析濃香型大曲微生物的多樣性、群落結(jié)構(gòu)及代謝功能［16-17］，揭示大曲制備過程中微生物的消長規(guī)律，證實大曲中各菌群之間緊密而復(fù)雜的代謝關(guān)系。相較于純培養(yǎng)方法只能分離純化部分大曲可培養(yǎng)微生物的種類，采用非培養(yǎng)方法中的測序技術(shù)既能系統(tǒng)高效地了解濃香型大曲不同階段微生物的多樣性和豐富度，打破慣性認知；又能準確得知微生物的代謝途徑和產(chǎn)物；還能發(fā)現(xiàn)許多未知菌種，極大地豐富了濃香型大曲微生物數(shù)據(jù)庫。采用非培養(yǎng)方式研究濃香型大曲中微生物群落多樣性的做法固然高效全面，但是也并非沒有缺點，如大曲中的乳球菌、鏈球菌、產(chǎn)芽孢桿菌等能夠通過傳統(tǒng)微生物手段純化分離，但是PCR-DGGE 無法檢出［18］。所以，對濃香型大曲中微生物菌落的多樣性進行研究，最好是采用兩種或者兩種以上的檢測手段，以保證試驗結(jié)果的系統(tǒng)性、全面性和可靠性。

表1 濃香型大曲菌系的研究

濃香型大曲菌系龐大而復(fù)雜，且菌系的種類和數(shù)量影響著酶系和化合物的產(chǎn)生，直接決定大曲酒的酒質(zhì)。非培養(yǎng)微生物的研究利于全面了解大曲微生物的種類、分布及其發(fā)酵機理，具有重要的研究意義；可培養(yǎng)微生物的研究則有利于從大曲中篩選到許多可應(yīng)用于白酒釀造或更多行業(yè)的優(yōu)良菌系，具有很強的現(xiàn)實意義。所以，在利用測序技術(shù)得到的微生物信息研究大曲發(fā)酵機理的同時，將高性能的可培養(yǎng)微生物進行篩選、鑒定，乃至研究其應(yīng)用性，是目前研究大曲微生物較為全面的一種方式。

2 大曲酶系

酶是由生物細胞產(chǎn)生的、具有高度催化活性的蛋白質(zhì)，一切微生物的生命活動都離不開酶［19］。濃香型大曲中多種微生物混合發(fā)酵，產(chǎn)生大量酶系才能滿足大曲酒的釀造需求，其主要酶系有：淀粉酶、蛋白酶、氧化還原酶、纖維素酶、單寧酶、木聚糖酶、果膠酶、裂解酶、異構(gòu)酶等［20］。各種酶系在白酒釀造中起到舉足輕重的作用：如淀粉酶能將原料中分子量較大的淀粉分解成小分子的糖為酒精發(fā)酵奠定物質(zhì)基礎(chǔ)；蛋白酶能水解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸，并為微生物生長繁殖提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)；纖維素酶能水解植物細胞壁、釋放胞內(nèi)淀粉，提高出酒率；脂肪酶分解脂肪為微生物提供能量，為大曲酒的香味組成提供前體物質(zhì)等。

糖化力和液化力是評價大曲質(zhì)量的重要指標(biāo)。最初對大曲酶系的研究，主要是采用傳統(tǒng)化學(xué)法檢測其糖化力和液化力。由于白酒行業(yè)的快速發(fā)展，傳統(tǒng)方法因耗時長、效率低、試驗結(jié)果精確度差等原因，逐漸不能滿足大曲質(zhì)量檢測需求，所以引進新的檢測技術(shù)就成了必然的選擇，見表2。張強等［21］先用直接滴定法和比色法測定不同品牌大曲酶提取液的糖化力和液化力，再用高效液相色譜法（HPLC）對提取液中酶的反應(yīng)產(chǎn)物進行分析，并計算其酶活力。研究表明，兩次檢測結(jié)果一致，證實了HPLC適用于分析大曲糖化力與液化力。

表2 濃香型大曲酶系的研究

對篩選到的特定功能菌所產(chǎn)粗酶的研究主要體現(xiàn)在利用純培養(yǎng)的方法自大曲中分離篩選能分泌α-淀粉酶、蛋白酶、酯化酶等不同功能酶的菌株，分析其酶學(xué)性質(zhì)。衛(wèi)春會等［22］從濃香型大曲中分離到一株產(chǎn)蛋白酶活性較高的菌株，分析了其酶學(xué)性質(zhì)以了解該酶的最適反應(yīng)條件包括pH、溫度、金屬離子對該酶的影響機理。王玉霞等［24］測定了整個大曲制作過程中α-淀粉酶、單寧酶、木聚糖酶和脂肪酶酶活變化，以及產(chǎn)酶菌種的多樣性，分析大曲曲皮、曲心的酶活變化。對特定功能酶進行分析，有利于后期進行分離純化以及條件優(yōu)化，提高功能酶的產(chǎn)量。而對不同時期的功能酶酶活變化進行研究，不僅有助于篩選特定功能酶產(chǎn)生菌，還能研究其酶學(xué)性質(zhì)，為制備強化大曲和純酶制劑打下基礎(chǔ)。

近年來，主要通過組學(xué)技術(shù)全面研究大曲功能酶的數(shù)量、種類以及相應(yīng)的作用機理。Huang 等［28］首次分析了濃香型大曲宏轉(zhuǎn)錄組，全面闡述了大曲活躍微生物的結(jié)構(gòu)組成和代謝特點，證實耐熱真菌是主要活躍微生物；其次挖掘了有關(guān)糖酵解、淀粉水解、丙酮酸代謝和乙醇代謝等代謝通路的關(guān)鍵酶；最后還證實了檸檬酸循環(huán)所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物是形成大曲風(fēng)味的關(guān)鍵。Wang等［14］采用宏蛋白組學(xué)技術(shù)對濃香型大曲進行研究，確定了乳桿菌、曲霉、畢赤酵母、釀酒酵母和根霉是宏蛋白的主要來源。組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于濃香型大曲微生物代謝功能的研究，有利于后期白酒質(zhì)量的優(yōu)化以及更多有價值酶的挖掘。但是由于大曲樣本多糖含量高和發(fā)酵產(chǎn)物復(fù)雜等原因，樣品RNA 和蛋白的提取十分不穩(wěn)定，極大地限制了組學(xué)技術(shù)在大曲方面的應(yīng)用。

以上例子是大曲粗酶和組學(xué)方面的分析，展示了大曲酶的豐富種類與籠統(tǒng)的酶學(xué)功能，均未能清晰深入揭示大曲特有功能酶的酶學(xué)價值。目前來說，關(guān)于大曲特有功能酶系較為熱點的研究是將來源于大曲的酶基因連接到不同的表達體系上，通過異源表達得到特定的純酶，進而精確分析大曲特有酶的酶學(xué)特性。Yi 等［29］和Barkat 等［30］分別將基于宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)得到的濃香型大曲中耐高溫α-淀粉酶基因和β-葡聚糖酶基因，在畢赤酵母X33 和大腸桿菌中進行異源表達，得到了耐高溫且熱穩(wěn)定性更好的α-淀粉酶純酶和β-葡聚糖酶純酶?；诤贽D(zhuǎn)錄組學(xué)的結(jié)果，可以從濃香型大曲中獲得更多無法通過純培養(yǎng)方法獲取的不同功能的酶基因，并通過異源表達得到純酶，研究它們在釀造過程中可能起到的協(xié)同作用。

長期以來，大曲酶系的研究都集中于大曲粗酶液和大曲來源微生物發(fā)酵粗酶液這兩個方面，這些領(lǐng)域的研究有助于識別大曲中的主要酶系。首先大曲存在“一菌產(chǎn)多酶”、“一酶來自于多菌”的現(xiàn)象，對大曲粗酶液進行研究，利于功能酶產(chǎn)生菌的溯源及篩選。其次大曲中還有多種酶系來源于不可培養(yǎng)的微生物，利用現(xiàn)代組學(xué)技術(shù)獲得其酶基因，通過異源表達得到純酶，是大曲研究過程中取得的重大進步。然而無論是通過篩選功能酶產(chǎn)生菌獲得的粗酶，還是通過異源表達獲得的純酶，若能研究、改進其酶學(xué)性質(zhì)，通過單酶或復(fù)配手段真正應(yīng)用于白酒生產(chǎn)，進一步提高白酒出酒率和酒質(zhì)，對于白酒行業(yè)來說，都具有積極意義。

3 菌系、酶系在濃香型大曲中的應(yīng)用

3.1 菌系

強化大曲是指通過人工接種純種菌（如酵母菌、霉菌、酯化菌），在生產(chǎn)中能起到減少大曲的用量、提高淀粉利用率、糧食出酒率以及成品酒酒質(zhì)的效果。自1982年起，田以清等［31］就制備出糖化力、發(fā)酵力都較高的強化大曲投用于生產(chǎn)。近年，楊躍寰等［32］從瀘州老窖大曲中分離純化得到棒曲霉和黑曲霉兩株高產(chǎn)菌株并應(yīng)用于大曲生產(chǎn)，發(fā)現(xiàn)大曲糖化力較穩(wěn)定，且能在不影響大曲風(fēng)味的情況下增加曲香（見表3）?？偟膩碇v，適用于制備強化大曲的菌種都有長處和短板，例如：生香活性干酵母的發(fā)酵力很低，但能有效提高白酒中總酯和乙酸乙酯的含量；產(chǎn)酒精酵母的發(fā)酵力強，但酯化力通常很差。所以各菌種通常要進行復(fù)配使用，才能達到提高出酒率和感官風(fēng)味的作用。陳雪玲等［33］研究發(fā)現(xiàn)，合適的復(fù)合菌劑能夠在不改變大曲酸度的情況下，提高大曲糖化力、液化力、發(fā)酵力以及轉(zhuǎn)化己酸乙酯的能力，豐富白酒的感官風(fēng)味。謝國排等［34］從金種子濃香型大曲中分離出6 株產(chǎn)蛋白嗜熱細菌，皆能產(chǎn)生不同的芳香族化合物、酚類、酯類等物質(zhì)，不同菌株復(fù)配制成的強化大曲功能各有不同?？聺龋?5］采用氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）的方式對從糟培中篩選出的產(chǎn)香細菌進行分析，并接種最佳比例的復(fù)合菌劑應(yīng)用于生產(chǎn)，發(fā)現(xiàn)其感官風(fēng)味和理化性質(zhì)都優(yōu)于原大曲，而且頂火期持續(xù)時間也更長，有望賦予濃香型大曲部分醬香味，改善濃香型白酒的香味成分組成。

除了制備強化大曲，還可以通過改進制曲工藝提高大曲的質(zhì)量。夏嶼等［36］采用實時定量基因擴增熒光檢測系統(tǒng)（qPCR）和高通量測序技術(shù)，分析比較熱風(fēng)干燥與自然干燥兩種不同的處理方式下大曲真菌群落的變化差異。研究發(fā)現(xiàn)熱風(fēng)干燥有利于假絲酵母屬生長，對排潮期大曲有積極意義，有助于改進傳統(tǒng)制曲工藝，提高大曲質(zhì)量。

大曲中的化合物不僅影響著菌系的物種多樣性和豐富度，還起著投糧、豐富大曲酒感官風(fēng)味的作用。化合物比例失調(diào)會在很大程度上影響大曲酒的感官風(fēng)味，而在實際生產(chǎn)中通過調(diào)整菌種的豐富度，可以達到提高或降低大曲中某些化合物含量的目的，如通過酵母菌和乳酸菌的拮抗作用降低乳酸乙酯的含量。生產(chǎn)乳酸乙酯的前體物質(zhì)是乳酸菌產(chǎn)生的乳酸以及酵母菌產(chǎn)生的乙醇，二者再通過酯化酶的作用生產(chǎn)乳酸乙酯。乳酸乙酯作為濃香型白酒重要的風(fēng)味物質(zhì)，它的比例是否恰當(dāng)在很大程度上影響著原酒乃至成品酒的感官風(fēng)味和質(zhì)量［37］。濃香型白酒長期以來都存在著乳酸乙酯含量過高的情況［38］，“増己降酸”一度是眾多酒廠關(guān)心的問題。羅青春等［39］從糟培中分離得到優(yōu)勢酵母菌和乳酸菌株，兩株菌分別抑制對方生長，又相互作用生成乳酸乙酯。因此，在大曲培菌期適當(dāng)引導(dǎo)酵母生長、減緩乳酸菌增殖，有助于降低乳酸乙酯含量。宋克偉等［40］從大曲中分離篩選到1 株枯草芽孢桿菌，通過試驗可知該菌株能高效降解白酒中乳酸乙酯的含量，降解率高達20%。楊望軍等［41］自大曲和酒醅中分離篩選到降解乳酸能力較強的解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌各1 株。模擬發(fā)酵結(jié)果發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌降解乳酸能力為25.97%，枯草芽孢桿菌降解乳酸能力為38.54%。

3.2 酶系

酶系在大曲中的應(yīng)用不多，主要包括固定化酶和純酶制劑的應(yīng)用。固定化酶的應(yīng)用在釀酒過程中較常見的是將糖化酶和液化酶固定在載體上，直接通過復(fù)配應(yīng)用于生料釀酒，可以跳過釀酒原料蒸煮糊化的過程［42］。純酶制劑在釀酒過程中的作用主要體現(xiàn)在降解原料中的纖維素，提高糖化力、出酒率以及酒質(zhì)等方面。釀造白酒所用的原料都含有較多的纖維素，適量添加纖維素酶有利于破壞間質(zhì)細胞壁的結(jié)構(gòu)，釋放淀粉。李旭暉等［43］將纖維素酶應(yīng)用于大曲固態(tài)發(fā)酵過程（表3），試驗結(jié)果表明：當(dāng)纖維素酶添加量為0.005%（10 FPU/kg 酒糟），可將出酒率提高1 倍；當(dāng)纖維素酶添加量為30 FPU/kg~50 FPU/kg（糟），所產(chǎn)白酒感官風(fēng)味更突出，酒質(zhì)更好。雜醇油是白酒主要香味成分之一，但含量過高會影響白酒的澄清度、降低酒質(zhì)。孫金旭等［44］將酵母、糖化酶、蛋白酶、大曲等按比例復(fù)配，試驗結(jié)果顯示當(dāng)?shù)鞍酌负窟m當(dāng)時，可以明顯抑制雜醇油的生成量。純酶制劑也常通過復(fù)配再應(yīng)用于大曲。阿米諾酶是白酒釀造中常用的復(fù)合酶制劑，包含根霉、曲霉、毛霉等多種性能優(yōu)良的菌株產(chǎn)生的復(fù)合粗酶［45］。阿米諾酶作為一種工業(yè)酶制劑，不僅能糖化和發(fā)酵淀粉質(zhì)原料，還具有耐高溫和耐酸的性能。將阿米諾酶應(yīng)用于濃香型大曲酒的生產(chǎn)以及雙輪底工藝，不但能減少用曲量、提高出酒率，還能促進生香和提高酒質(zhì)。

表3 菌系、酶系在濃香型大曲中的應(yīng)用

4 結(jié)束語

濃香型大曲中菌系、酶系的數(shù)量和種類，決定著白酒的出酒率、酒質(zhì)及風(fēng)味。對大曲菌系、酶系進行研究，有利于更深層次地揭示大曲的發(fā)酵機理，還能在一定程度上推動白酒釀造行業(yè)的發(fā)展。之前由于技術(shù)限制以及認知不完全，只能簡單篩選某些可培養(yǎng)微生物，粗略研究其酶學(xué)性質(zhì)及代謝產(chǎn)物，并不能完全、深刻地闡明大曲的發(fā)酵機理。而如今，將新一代測序技術(shù)和組學(xué)技術(shù)（包括風(fēng)味組學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)）相結(jié)合，研究大曲菌系、酶系的變化以及它們的關(guān)聯(lián)性，有利于分析微生物群體的種類、進化和體外功能代謝，有利于全面了解大曲酶系的組成和調(diào)控機理。但由于大曲樣本的復(fù)雜性，以及現(xiàn)有的科技瓶頸，只能得到可培養(yǎng)微生物和非培養(yǎng)微生物的群落多樣性和部分群落功能。如果能將宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組與宏蛋白組結(jié)合，便能完善宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組的不足，在核酸分析的基礎(chǔ)上對微生物表達蛋白進行分析，能夠更好地解釋濃香型大曲微生物的遺傳和功能。在現(xiàn)代化的理論和科技支撐下，濃香型大曲微生物的群落結(jié)構(gòu)、多樣性以及代謝通路將會得到更清晰、更全面地闡述，新的功能酶將會被更多地挖掘并應(yīng)用于大曲酒釀造，白酒固態(tài)發(fā)酵機理的解析必然會更加全面和透徹，并最終使得白酒固態(tài)發(fā)酵效率和品質(zhì)進一步提升。