孫昊璐，吳一萬，卞和格，金 娟

(安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，安徽 合肥 230032)

阿司匹林是一種被廣泛使用的非甾體抗炎藥，已有100多年的歷史。研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林可以預(yù)防多種癌癥，其中包括肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。此外，阿司匹林還可以降低癌癥發(fā)病率和死亡率[1-2]。大量的證據(jù)證實阿司匹林對多種癌癥均有預(yù)防作用[3]。然而，HCC細(xì)胞對阿司匹林的應(yīng)答可能會導(dǎo)致阿司匹林抵抗性的產(chǎn)生，目前針對此領(lǐng)域仍然缺乏足夠的認(rèn)識。

自噬是細(xì)胞通過雙膜細(xì)胞器自食的過程，自噬參與了應(yīng)激條件下的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，包括能量限制、營養(yǎng)缺乏、缺氧和細(xì)胞應(yīng)激[4]。越來越多的證據(jù)表明，自噬在HCC疾病中具有關(guān)鍵作用[5]。既往有研究表明自噬具有抑制腫瘤生長的功能。與此同時，另一些研究人員認(rèn)為，HCC細(xì)胞依賴自噬生存。盡管自噬與細(xì)胞類型和環(huán)境應(yīng)激有關(guān)，其作用是抗癌還是促癌仍存在爭議[6-7]。

阿司匹林通過抑制環(huán)氧化酶(COX)、前列腺素和其他炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，從根本上抑制癌癥[8]。有研究表明，除了COX，阿司匹林還可能靶向其他蛋白，如腺苷單磷酸活化蛋白激酶((adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)，在代謝應(yīng)激中調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)和代謝應(yīng)激，從而促進細(xì)胞生存[9-10]。AMPK信號被認(rèn)為是阿司匹林誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬的關(guān)鍵因素[11]。AMPK和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)參與了自噬的起始階段。在營養(yǎng)缺乏的情況下，激活的AMPK通過抑制mTORC1，觸發(fā)自噬起始[7, 12]。部分研究表明，阿司匹林可能是通過誘導(dǎo)自噬抑制腫瘤血管生成的作用[13-14]。相反，也有研究發(fā)現(xiàn)AMPK介導(dǎo)的mTORC2和髓細(xì)胞白血病-1(myeloid leukemia-1，MCL-1)的上調(diào)可能會損害阿司匹林的抗癌作用[9]。這些發(fā)現(xiàn)提示，自噬可以激活并參與阿司匹林對HCC疾病的治療作用。然而，阿司匹林誘導(dǎo)的自噬作用是促進肝癌細(xì)胞存活還是抑制肝癌細(xì)胞生長仍存在較大的爭議。本研究旨在探討阿司匹林治療HCC的可能機制，以及評估阿司匹林單獨或聯(lián)合AMPK抑制劑治療肝癌的療效。

1 材料與方法

1.1 主要試劑肝癌細(xì)胞株HepG2購買于中國科學(xué)院(上海)細(xì)胞株庫。阿司匹林(貨號：A2093)、Compound C(貨號：866405-64-3)、CCK-8(貨號：96992)以及二乙基亞硝胺(DEN) (貨號：NO756-10ML)均購自美國Sigma。使用的抗體為:抗AMPK(貨號：ab3759)、抗mTOR(貨號：ab2732)、抗Beclin-1(貨號：ab62557)、抗LC-3(貨號：ab62721)、抗TFEB(貨號：ab270604)均購自美國Abcam。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)HepG2細(xì)胞保存于含有10%胎牛血清(FBS)、100 kU·L-1青霉素和100 g·L-1硫酸鏈霉素的DMEM中，在37℃、5%CO2、95%空氣濕度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.3 二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)的大鼠肝癌模型成年雄性SD大鼠，6周齡，購自安徽醫(yī)科大學(xué)動物中心。大鼠飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物房，室溫(28±2)℃，濕度45%-60%。整個實驗過程中，所有大鼠常規(guī)飼養(yǎng)。模型組大鼠于8周齡時，進行腹腔DEN注射。DEN注射條件為：50 mg·kg-1DEN，每周1次，連續(xù)注射18周。DEN注射12周后開始進行阿司匹林治療，將大鼠隨機分為4組，每組5只，腹腔灌注生理鹽水(對照組)、DEN組(模型組)、阿司匹林5、50 mg·kg-1。所有的動物都可以自由獲得水和飼料。所有實驗經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物委員會批準(zhǔn)。

1.4 組織病理學(xué)檢查實驗結(jié)束后，按照動物倫理準(zhǔn)則，將所有動物進行麻醉后犧牲。所有組織樣本均取自肝左葉。采用含40%福爾馬林的固定液固定組織，石蠟包埋后進行組織切片，組織切片厚度為5-6 μm，HE染色。

1.5 Western blot肝組織收集后，用RIPA裂解緩沖液肝組織進行總蛋白的提取。用Lowry蛋白法測定蛋白濃度。用抗AMPK、LC3、mTOR和β-actin的小鼠或人的抗體和相應(yīng)的辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合的山羊抗兔抗體(1 ∶10 000)進行免疫印跡檢測分析。采用增強化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)進行顯影。

1.6 平板克隆形成試驗HepG2細(xì)胞置于的6孔板中培養(yǎng)，培養(yǎng)密度為1×104個/孔。培養(yǎng)24 h后給予阿司匹林治療。將培養(yǎng)細(xì)胞分為4組：對照組、阿司匹林2.5、5、10 mmol·L-1。刺激48 h后，棄掉藥品培養(yǎng)液更換正常培養(yǎng)液，所有細(xì)胞正常培養(yǎng)20 d，PBS仔細(xì)清洗3遍，每孔加5 mL甲醇，固定15 min，棄去固定液，每孔加入Giemsa染色液2 mL，孵育20 min，純水洗凈，晾干，拍照。使用Image-Pro Plus軟件計算克隆的數(shù)量。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測將細(xì)胞(5×104個/孔)接種于12孔板中培養(yǎng)過夜，加不同濃度的阿司匹林24 h。棄掉培養(yǎng)液，PBS清洗2次。每孔加入膜聯(lián)蛋白V結(jié)合液400 μL，膜聯(lián)蛋白V/FITC染色液5 μL，碘化丙啶染色10 μL。混合后置于室溫，避光反應(yīng)15 min，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡率。

1.8 細(xì)胞增殖測定CCK-8法：取指數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，以8×104個/孔的密度種在96孔板上孵育過夜。然后，在用藥品刺激細(xì)胞之前，細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h。阿司匹林處理細(xì)胞24 h或48 h后，按照10 ∶1加入CCK-8試劑，加入細(xì)胞，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育2 h。450 nm測量OD值。細(xì)胞相對活力測定公式如下:細(xì)胞相對活力/%=(實驗樣品OD值-空白對照組OD值)/(對照OD值-空白對照組OD值)×100%。

2 結(jié)果

2.1 阿司匹林抑制DEN誘導(dǎo)的HCC為驗證阿司匹林對DEN誘導(dǎo)的肝癌的保護作用，將SD大鼠腹腔注射DEN 12周后，給予SD雄性大鼠阿司匹林5、50 mg·kg-1·d-1進行灌胃，連續(xù)8周。DEN給藥20周后，DEN組小鼠肝臟/體質(zhì)量比值較正常組明顯增加。不同濃度的阿司匹林組間大鼠的肝/體質(zhì)量比與正常組相比，沒有明顯差異(Fig 1A)。收集肝臟組織后分別檢測DEN組和阿司匹林治療組大鼠的病理切片(Fig 1B)。正常對照大鼠肝臟切片顯示肝臟組織學(xué)正常，肝細(xì)胞呈放射狀排列，圍繞中央靜脈。經(jīng)DEN處理的大鼠肝臟切片顯示肝小葉已喪失其特征性外觀，肝細(xì)胞壞死、變形、形態(tài)異常、結(jié)締組織增生。阿司匹林治療組的大鼠肝切片顯示，肝細(xì)胞正常排列并且有一定的恢復(fù)。

2.2 阿司匹林對DEN誘導(dǎo)的大鼠肝癌中自噬的影響因為激活A(yù)MPK會導(dǎo)致自噬，所以我們設(shè)計了自噬相關(guān)實驗進行檢驗。此外， LC3-Ⅱ是自噬標(biāo)記物。將AMPK和LC3蛋白與β-actin蛋白條帶強度表達相比較，分析其蛋白表達水平。如Fig 2所示，在5和50 mg·kg-1阿司匹林處理下，AMPK蛋白表達增加。與模型組比較，阿司匹林組LC3-Ⅱ/Ⅰ的蛋白比值較高。

2.3 阿司匹林對HepG2細(xì)胞增殖的影響為了驗證阿司匹林對肝癌細(xì)胞增殖的影響，本實驗分別用不同濃度的阿司匹林處理HepG2細(xì)胞，然后進行CCK-8分析。阿司匹林以時間及劑量依賴的方式抑制HepG2細(xì)胞的增殖(Fig 3A)。為進一步驗證阿司匹林對肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用，采用能反映癌細(xì)胞增殖和侵襲的平板克隆形成實驗[15]。結(jié)果顯示，阿司匹林明顯抑制HepG2細(xì)胞的克隆形成(Fig 3B)。

Fig 3 Effect of aspirin on cell growth and clone formation of HCC cells n=3)*P<0.05, **P<0.01 vs control group.

2.4 阿司匹林誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬Western blot檢測HepG2細(xì)胞中Beclin-1蛋白的表達。結(jié)果顯示，2.5、5 mmol·L-1阿司匹林均明顯刺激HepG2細(xì)胞中Beclin-1的表達，F(xiàn)ig 4。轉(zhuǎn)錄因子EB(TFEB)通過驅(qū)動自噬和溶酶體基因的表達來協(xié)調(diào)這一過程。因此，我們檢測了TFEB在阿司匹林治療后的表達。本研究中，2.5和5 mmol·L-1阿司匹林促進TFEB表達增加，與Beclin-1表達結(jié)果相一致(Fig 4)。

Fig 4 Autophagy in HepG2 induced by aspirin n=3) **P<0.01 vs control group.

2.5 阿司匹林對HepG2細(xì)胞AMPK相關(guān)自噬的影響最近有研究表明，阿司匹林通過直接激活A(yù)MPK和抑制mTOR信號通路來靶向調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)能量代謝和穩(wěn)態(tài)[11]。因此，我們研究了AMPK和mTOR信號在阿司匹林治療的HCC細(xì)胞生長中的作用。結(jié)果顯示，阿司匹林上調(diào)HepG2細(xì)胞中AMPK，降低了mTOR的表達(Fig 5)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明阿司匹林可激活A(yù)MPK信號并抑制mTOR而誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生。

Fig 5 Effect of aspirin on AMPK and mTOR expression in HepG2 cells by Western blot n=3)

2.6 阿司匹林聯(lián)合AMPK抑制劑協(xié)同抑制HCC細(xì)胞增殖和克隆形成阿司匹林誘導(dǎo)HCC細(xì)胞自噬激活，此過程可能與阿司匹林抵抗有關(guān)，我們推測AMPK抑制劑Compound C可能通過抑制自噬增強阿司匹林抗HCC作用。為了確定抑制自噬是否能增強阿司匹林抗HCC作用，我們采用阿司匹林聯(lián)合Compound C進行檢驗。Compound C作為AMPK抑制劑在已發(fā)表的論文有較多使用，根據(jù)既往研究，我們選擇了兩種劑量(5、10 μmol·L-1)進行測試。通過檢測Compound C對HepG2細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果表明，5 μmol·L-1Compound C對HCC細(xì)胞的毒性作用較小，因此我們將此濃度作為下一步實驗的給藥濃度(Fig 6A)。與單獨用藥相比，阿司匹林聯(lián)合5 μmol·L-1Compound C治療HepG2細(xì)胞，HepG2細(xì)胞的存活數(shù)量明顯減少(Fig 6B)。此外，阿司匹林與Compound C聯(lián)用對HCC細(xì)胞克隆形成的抑制作用更加明顯(Fig 6C，D)。

Fig 6 Cell growth and clone formationsynergistically inhibited by co-treatment of aspirin and AMPK inhibitor Compound C (CC) n=3)

2.7 阿司匹林與Compound C聯(lián)合對HepG2細(xì)胞凋亡的影響接下來，我們觀察了阿司匹林與Compound C聯(lián)合對HepG2細(xì)胞凋亡的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在阿司匹林濃度低至2.5mmol·L-1時，聯(lián)合治療也可明顯增加肝癌細(xì)胞凋亡(Fig 7A-D)。凋亡蛋白caspase-3的表達也證明了這個結(jié)果(Fig 7E-F)。這些數(shù)據(jù)表明阿司匹林和AMPK抑制劑聯(lián)合治療HCC比單獨使用阿司匹林療效更好。

Fig 7 Apoptosis induced by aspirin and Compound C on HCC cells n=3)*P<0.05, **P<0.01 vs control group.

3 討論

長期小劑量服用阿司匹林可以明顯降低癌癥發(fā)病率，特別是胃腸道腫瘤[16]。一項超過26年的隨訪研究報告指出，長期規(guī)律服用小劑量阿司匹林與患HCC呈劑量依賴性降低，服用阿司匹林5年以上其療效明顯增加[17]。在本項研究中，我們發(fā)現(xiàn)阿司匹林可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生AMPK相關(guān)的自噬，從而對抗其對肝癌細(xì)胞的生長起到保護作用。采用阿司匹林聯(lián)合AMPK抑制劑可協(xié)同抑制HCC細(xì)胞增殖和單細(xì)胞克隆形成。

本研究采用DEN誘導(dǎo)的大鼠肝癌模型。我們發(fā)現(xiàn)，DEN組大鼠肝臟/體質(zhì)量比明顯升高，而在阿司匹林組中大鼠的肝/體質(zhì)量比沒有明顯差異(Fig 1A)。同時，阿司匹林治療組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高，AMPK表達增加。這些數(shù)據(jù)表明，阿司匹林可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬的產(chǎn)生。

自噬的主要調(diào)節(jié)蛋白是AMPK和mTOR，它促進細(xì)胞器和蛋白質(zhì)的循環(huán)和/或降解，以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[18]。自噬在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中如何積極調(diào)節(jié)細(xì)胞存活或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡仍有爭議。有報道指出，自噬促進肝癌細(xì)胞死亡[14],相反，另一些研究顯示，自噬可以維持肝癌細(xì)胞的存活[6, 9]。因此，自噬激活對肝癌細(xì)胞增殖和存活的影響可能與環(huán)境有關(guān)。前期研究表明，AMPK信號通路可調(diào)節(jié)阿司匹林的作用[9]。阿司匹林通過AMPK激活、mTORC1抑制和自噬誘導(dǎo)，抑制PIK3CA突變型乳腺癌細(xì)胞的活力和生長。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)阿司匹林誘導(dǎo)的自噬通過AMPK-mTOR信號通路促進HCC細(xì)胞存活。AMPK是細(xì)胞生存所必需的，其表達降低會降低前列腺癌細(xì)胞活力。因此，AMPK的激活對細(xì)胞增殖和存活的影響可能與環(huán)境有關(guān)。我們證明，在阿司匹林治療中，AMPK的激活可能通過上調(diào)自噬促進肝癌細(xì)胞增殖、克隆和存活。AMPK抑制劑Compound C明顯增強阿司匹林對細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和細(xì)胞克隆形成的抑制作用。這些結(jié)果表明AMPK/mTOR信號通路誘導(dǎo)的自噬削弱阿司匹林對肝癌細(xì)胞的抑制作用。

綜上，阿司匹林可通過激活A(yù)MPK誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬，而自噬的發(fā)生削弱了其抗癌作用。與單藥相比，阿司匹林聯(lián)合AMPK抑制劑可明顯降低腫瘤增殖和細(xì)胞克隆形成，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。阿司匹林聯(lián)合AMPK抑制劑可能是肝癌的有效治療方法。本研究為肝癌的臨床治療提供了新的思路。