馬欣雨，徐 非，龔蕾蕾，程蕊棠，繆孫涵，朱雨薇，蔡維維，侯 豹，邱麗穎

(江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院, 江蘇 無錫 214122)

1 前言

動(dòng)脈粥樣硬化是一種常見的心血管疾病，發(fā)病率高、致死率高，極易發(fā)展成腦卒中、冠心病等心血管病變，嚴(yán)重威脅人類健康，導(dǎo)致其病發(fā)的危險(xiǎn)因素復(fù)雜多樣包括性別、年齡、血壓等[1-2]。纖維和脂肪的堆積是動(dòng)脈粥樣硬化的主要表現(xiàn)，可使動(dòng)脈管腔變窄、彈性降低，一旦發(fā)展到阻塞動(dòng)脈管腔，則可導(dǎo)致該動(dòng)脈供應(yīng)的組織或器官缺血、壞死，嚴(yán)重影響機(jī)體功能。動(dòng)脈粥樣硬化病理機(jī)制復(fù)雜，但其主要原因之一是血管內(nèi)皮受損[3-4]。因此，治療動(dòng)脈粥樣硬化的靶點(diǎn)之一可能是改善內(nèi)皮功能。實(shí)驗(yàn)室多年的研究發(fā)現(xiàn)，王不留行黃酮苷(vaccarin)能夠改善高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[5]，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，從而發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮的作用[6]。此外，其對(duì)心血管重構(gòu)、腎病以及腎性高血壓大鼠的血壓具有改善作用[7]。既往的研究結(jié)果表明vaccarin在改善心血管功能中的重要作用，因此本研究將進(jìn)一步探究vaccarin在小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型中的作用及相關(guān)分子機(jī)制。

2 材料和方法

2.1 主要藥品與試劑王不留行黃酮苷(上海士峰科技有限公司)；高脂飼料(南通特洛菲飼料科技有限公司)； 油紅O染料，DCFH-DA探針試劑盒(上海索萊寶科技有限公司)；Masson染色試劑盒，總膽固醇試劑盒，甘油三酯試劑盒，高密度脂蛋白膽固醇試劑盒，低密度脂蛋白膽固醇試劑盒，蘇木素伊紅染色試劑盒(南京建成生物有限公司)；小鼠MCP-1、IL-6、ICAM-1、VCAM-1 ELISA試劑盒、Caspase-3活性檢測試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；兔抗p38 MAPK抗體，兔抗p65-NFkB抗體，兔抗SM22a抗體，兔抗β-actin抗體，羊抗兔IgGH&L (Alexa Fluor@ 488)抗體，鼠抗Bcl-2抗體，兔抗Caspase-3抗體，兔抗Bax抗體(英國Abcam公司)。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本實(shí)驗(yàn)所用小鼠，購自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，為雄性6-8周齡的AopE-/-和C57BL/6J小鼠?？瞻讓?duì)照組(WT)與王不留行黃酮苷對(duì)照組(WT+Vaccarin)選取C57BL/6J小鼠，正常飼料喂養(yǎng)20周；動(dòng)脈粥樣硬化模型組(ApoE-/-+HFD)組與王不留行黃酮苷治療組(ApoE-/-+HFD+Vaccarin)則選取AopE-/-小鼠聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)20周構(gòu)建小鼠模型。在第16周時(shí)ApoE-/-+HFD+Vaccarin組與WT+Vaccarin組每日腹腔注射vaccarin(1 mg·kg-1)，持續(xù)4周；另外兩組則注射等量生理鹽水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是在江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物委員會(huì)的批準(zhǔn)下進(jìn)行，動(dòng)物倫理編號(hào)：JN.No 20201130t1280301[327]。

2.3 血清脂質(zhì)含量測定小鼠禁食不禁水12 h后，戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)腹腔注射，麻醉小鼠后眼球取血，2 500 r·min-1離心20 min后吸取上層血清。按一定比例稀釋血清后，檢測TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量。

2.4 油紅O染色檢測血管脂質(zhì)沉積小鼠處死后，取血管以及主動(dòng)脈根部制作冰凍切片后使用冷凍切片機(jī)切片，厚度為10 μm。根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行油紅O染色。

2.5 ELISA法測定血清炎癥因子水平取小鼠血清，檢測炎癥因子IL-6，ICAM-1，MCP-1和VCAM-1的水平，按照ELISA試劑盒說明，將稀釋好的樣品以及標(biāo)準(zhǔn)品加入酶標(biāo)板中，并設(shè)空白孔進(jìn)行對(duì)照，加入抗體孵育、洗滌后加入顯色液進(jìn)行反應(yīng)20 min后加入終止液，采用酶標(biāo)儀檢測OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品濃度。

3 結(jié)果

3.1 王不留行黃酮苷對(duì)ApoE-/-小鼠血糖、血壓、體質(zhì)量的影響與WT小鼠相比，ApoE-/-+HFD小鼠血糖、血壓以及體質(zhì)量均明顯上升而腹腔注射vaccarin后，升高的血糖、血壓、體質(zhì)量，出現(xiàn)顯著降低現(xiàn)象。另外，WT+Vaccarin組與WT小鼠相比沒有血糖、血壓和體質(zhì)量的改變(Tab 1)。上述結(jié)果表明，腹腔注射vaccarin可以改善動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠血糖、血壓以及體質(zhì)量。

3.2 王不留行黃酮苷改善ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈的粥樣硬化斑塊及纖維化的形成油紅O染色檢測結(jié)果表明，WT+Vaccarin組小鼠與WT組相比，主動(dòng)脈及其根部處無斑塊形成。ApoE-/-+HFD+Vaccarin組小鼠與ApoE-/-+HFD組小鼠相比，主動(dòng)脈斑塊面積明顯減少，而主動(dòng)脈根部斑塊面積無改變(Fig 1 A, B, D)。另外，Masson染色表明，WT +Vaccarin組與WT組小鼠主動(dòng)脈均無病變，而ApoE-/-+HFD小鼠主動(dòng)脈斑塊纖維化顯著增多，而vaccarin則可緩解纖維化程度(Fig 1 C,D)。Western blot結(jié)果同樣表明，WT+Vaccarin組與WT組的小鼠相比SM22α的表達(dá)無明顯變化；而ApoE-/-+HFD組表達(dá)明顯增加，vaccarin治療后可明顯降低SM22α的表達(dá)(Fig 1 E, F)。以上表明，vaccarin可降低ApoE-/-+HFD小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的纖維化程度。

3.3 王不留行黃酮苷改善ApoE-/-小鼠血脂代謝及主動(dòng)脈炎癥脂代謝障礙是動(dòng)脈粥樣硬化的重要原因，主要表現(xiàn)為血脂膽固醇含量的升高[8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與WT組相比，ApoE-/-+HFD組小鼠血清中TG、TC、LDL-C的水平明顯升高，HDL-C明顯降低。ApoE-/-+HFD+Vaccarin組與ApoE-/-+HFD組小鼠相比，TG、TC、LDL-C的水平明顯降低，HDL-C明顯升高(Fig 2A)。此外，主動(dòng)脈內(nèi)皮炎癥作為血管內(nèi)皮損傷的因素之一，在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用[9]。因此，我們深入探究了vaccarin對(duì)ApoE-/-小鼠炎癥的影響。小鼠主動(dòng)脈qRT-PCR結(jié)果顯示，IL-6，MCP-1，ICAM-1和VCAM-1 mRNA水平在WT+Vaccarin組小鼠的主動(dòng)脈內(nèi)無明顯變化。在高脂飼料喂養(yǎng)的ApoE-/-+HFD小鼠體內(nèi)則明顯上升，此基礎(chǔ)上，注射vaccarin后，IL-6，MCP-1，ICAM-1和VCAM-1 mRNA水平可出現(xiàn)明顯下降(Fig 2 B)。同樣，ELISA 結(jié)果顯示，vaccarin抑制ApoE-/-+HFD小鼠黏附因子水平的升高(Fig 2 C)。免疫印跡結(jié)果顯示，ApoE-/-+HFD小鼠胞核NFκB p65可見明顯升高。ApoE-/-+HFD+Vaccarin組中，胞核NFκB p65可見明顯下降(Fig 2 D, E)。以上表明，vaccarin可改善動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的炎癥水平。

3.4 王不留行黃酮苷影響ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡Caspase-3活性檢測顯示，與WT小鼠相比，WT+Vaccarin組小鼠caspase-3活性沒有改變，ApoE-/-+HFD組小鼠caspase-3活性明顯升高而vaccarin干預(yù)后明顯降低(Fig 3 C)。免疫印跡結(jié)果同樣表明，與WT相比，WT+Vaccarin組小鼠caspase-3的切割(c-caspasse-3)、Bcl-2及Bax蛋白水平無明顯變化。ApoE-/-+HFD組小鼠的c-caspasse-3及Bcl-2的表達(dá)水平升高，抑凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平下降。Vaccarin干預(yù)后，則觀察到相反的現(xiàn)象(Fig 3 A, B)。上述結(jié)果表明，vaccarin可改善ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。

Fig 3 Effect of Vaccarin on apoptosis in ApoE-/-+HFDmice fed with high-fat diet n=3)

3.5 王不留行黃酮苷對(duì)ApoE-/-小鼠血管內(nèi)皮損傷減輕的機(jī)制ROS、p38 MAPK參與內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及巨噬細(xì)胞泡沫化過程，是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成進(jìn)展中的重要機(jī)制[10]。為了檢測小鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，我們利用DCFH-DA探針來標(biāo)記ROS。結(jié)果顯示，ApoE-/-+HFD組的ROS水平可見明顯升高，而ApoE-/-+HFD+Vaccarin組中，ROS水平則明顯下降(Fig 4 A, B)。免疫印跡結(jié)果顯示，ApoE-/-+HFD組中，p38 MAPK磷酸化水平明顯上升，而vaccarin則可逆轉(zhuǎn)p38 MAPK的磷酸化表達(dá)(Fig 4 C, D)。上述結(jié)果表明，vaccarin抑制了動(dòng)脈粥樣硬化小鼠ROS/p38 MAPK信號(hào)通路的活化。

4 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是一種發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的慢性血管炎性疾病，血管內(nèi)皮損傷及功能障礙在其發(fā)生發(fā)展過程中，發(fā)揮著重要作用[11]。血管內(nèi)皮損傷可由多種刺激引起，如內(nèi)皮細(xì)胞纖維化、內(nèi)皮細(xì)胞炎癥及凋亡等[12]。作為一個(gè)中藥活性單體，vaccarin可降低高血壓大鼠的血壓、改善心血管重構(gòu)、抑制高糖刺激的血管內(nèi)皮功能障礙[7]，這揭示vaccarin在心血管系統(tǒng)中的重要作用。本文主要探討的是vaccarin對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化的影響及其分子機(jī)制。動(dòng)脈粥樣硬化受累動(dòng)脈病變始于內(nèi)膜，表現(xiàn)為內(nèi)膜炎癥、纖維化以及脂質(zhì)沉積。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊纖維化的形成主要由于脂質(zhì)積聚，黏附因子增加導(dǎo)致平滑肌遷移至脂質(zhì)沉積部位后發(fā)生壞死，引起細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，形成纖維帽，最終可進(jìn)一步導(dǎo)致動(dòng)脈血管硬化[13]。我們的結(jié)果顯示，與ApoE-/-+HFD組小鼠相比，ApoE-/-+HFD+Vaccarin組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的纖維化水平降低，表明vaccarin可以改善動(dòng)脈硬化斑塊纖維化病變。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展與血管內(nèi)皮炎癥及凋亡密切相關(guān)[14]。在本次實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)與ApoE-/-+HFD組小鼠相比，ApoE-/-+HFD+Vaccarin組小鼠IL-6、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)明顯降低，同樣vaccarin抑制了NFκB p65蛋白的核轉(zhuǎn)移；以及改善了抑凋亡蛋白Bcl-2的下調(diào)和促凋亡蛋白Bax, c-caspase-3的上調(diào)。以上結(jié)果說明，vaccarin或許可以通過改善血管內(nèi)皮炎癥以及凋亡來達(dá)到改善動(dòng)脈粥樣硬化病變的效果?；钚匝?ROS)在細(xì)胞凋亡以及炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用[15]，與動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[16]。另外，ROS在多種病理生理信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，如p38 MAPK、NFκB p65的激活[18]。p38 MAPK也被證明作為內(nèi)皮細(xì)胞炎癥及凋亡的關(guān)鍵靶點(diǎn)參與動(dòng)脈粥樣硬化過程[17]。我們此次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，vaccarin可抑制ApoE-/-+HFD組小鼠主動(dòng)脈ROS的產(chǎn)生以及p38 MAPK蛋白的磷酸化程度。這進(jìn)一步說明vaccarin通過抑制ROS/p38 MAPK信號(hào)通路活化改善動(dòng)脈粥樣硬化。我們的研究成果表明，vaccarin或可作為治療與動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷相關(guān)的心血管疾病的潛在藥物。