陳鈺龍，王華啟，張莉蓉

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1.藥學(xué)部、2.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，3.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450000)

肺腺癌是非小細胞肺癌最常見的組織學(xué)類型，目前盡管臨床對其治療取得一定進展，但晚期患者預(yù)后仍較差，病死率高[1]。以順鉑為主藥物化療為肺腺癌主要治療手段之一，但也較易復(fù)發(fā)，腫瘤細胞對順鉑藥物耐藥性已逐漸成為影響患者化療效果及預(yù)后的關(guān)鍵因素，目前尚無可逆轉(zhuǎn)化療多藥耐藥有效方法[2]。甘草為中醫(yī)常用藥材之一，其活性成分甘草素能對腫瘤細胞血管生成進行抑制，阻滯細胞周期，影響腫瘤細胞凋亡、增殖基因調(diào)控，具有潛在藥用價值[3]。研究還發(fā)現(xiàn)[4]，甘草素可經(jīng)調(diào)節(jié)鼻咽癌CNE-2細胞自噬，增強放療敏感性。王勇等[5]還提出，甘草素抑制肺癌細胞增殖、調(diào)節(jié)細胞凋亡、增強放療敏感性的機制可能與調(diào)控WIG-1基因表達有關(guān)，但就其他機制尚未具體明確。微小RNA(microRNA，miR)-216b-5p為miR-216家族成員之一，是一種腫瘤抑制因子，在多種腫瘤組織中表達降低，且參與相應(yīng)腫瘤細胞增殖、分化、凋亡等過程，目前臨床就其在肺腺癌腫瘤細胞增殖凋亡以及化療敏感性中作用研究較少。基于此，本研究開展實驗，重點分析了甘草素對肺腺癌細胞增殖凋亡及化療敏感性的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人肺腺癌H1299細胞株購自上海通派生物科技公司。

1.1.2主要試劑、儀器 甘草素(美國Sigma公司，批號：S05167)，順鉑(碧云天生物技術(shù)研究所，批號：181026)，10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素(美國Invitrogen公司，批號：R6081)，DMEM培養(yǎng)基(美國Sigma公司，批號：S10262)，Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)，甲基噻唑基四唑(Methylthiazolyltetrazolium，MTT)比色法試劑盒(美國BioVision公司)，微小核糖核酸-216b-5p(microRNA-216b-5p，miR-126b-5p)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)試劑盒(湖北武漢富鑫遠科技有限公司)，兔抗人mTOR、磷酸化-mTOR(phosphorylated-mTOR，p-mTOR)、Bcl-2、β-actin一抗及山羊抗兔IgG二抗(美國Abcam公司)。ELx800型酶標儀(美國Bio-Tek公司)，AS-90型流式細胞儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)，BX43顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)，數(shù)字圖像分析系統(tǒng)(美國通用公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)、分組及干預(yù) 人肺腺癌H1299細胞株置于含10%胎牛血清、1%青霉素及1%鏈霉素DMEM培養(yǎng)基，放置在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度37 ℃，體積分數(shù)5%，每隔2 d，以0.25%胰蛋白酶消化傳代一次。取對數(shù)生長期H1299細胞，細胞濃度調(diào)至1.0×107個·L-1，在96孔板內(nèi)接種，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁，去除舊培養(yǎng)液。甘草素使用前以生理鹽水溶解成終濃度10.0 mg·L-1溶液。甘草素設(shè)10、20、40、60、80 mg·L-15個濃度組，另設(shè)對照組(加50 μL/孔，不含甘草素培養(yǎng)液)，處理24 h后收集全部細胞。

1.2.2化療敏感性檢測 采用CCK-8法檢測。取1.2.1中各組細胞，96孔板內(nèi)接種，各組復(fù)孔數(shù)均為5。待細胞貼壁，以不同濃度(0.625、1.25、2.5、5、10 mg·L-1)順鉑干預(yù)各組細胞，另設(shè)空白孔，僅加200 μL培養(yǎng)液。各組細胞處理24 h后，加5 μL CCK-8，放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，共4 h。各孔加含0.1% DMSO的DMEM溶液，振蕩10 min。觀察結(jié)晶溶解后，置于酶標儀檢測。記錄酶標儀570 nm波長處吸光度(absorbance，A)值，計算藥物半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)=(實驗孔A值/空白孔A值)×100%，評估化療敏感性。

1.2.3細胞增殖活性檢測 采用MTT比色法檢測。取“1.2.1”中各組細胞，接種于96孔板，觀察細胞貼壁后，以最接近IC50值濃度2.5 mg·L-1順鉑干預(yù)各組細胞24 h。各孔加5 g·L-1MTT液20 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)。完成培養(yǎng)后，800 r·min-1離心，離心半徑10 cm，10 min，棄上清液。分別在各孔加標準濃度DMSO溶液200 μL，震蕩10 min，混勻。觀察細胞內(nèi)紫藍色結(jié)晶溶解后，置于酶標儀檢測。記錄酶標儀570 nm波長處A值，評估細胞增殖活性。

1.2.4細胞凋亡檢測 采用流式細胞術(shù)檢測。取“1.2.1”中各組細胞，接種于96孔板，觀察細胞貼壁后，以2.5 mg·L-1順鉑干預(yù)各組細胞24 h。各孔加不含EDTA胰酶消化，細胞以EP管收集，磷酸鹽緩沖液沖洗2次。各管加1× binding buffer 200 μL，重懸細胞，再以Annexin V-PE 5 μL加入細胞重懸液內(nèi)，混勻，室溫，避光孵育10 min。各管加7-AAD 5 μL，吹打，混勻。4 h內(nèi)，以流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率/%=(凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%。

1.2.5miR-216b-5p、mTOR、Bcl-2 mRNA相對表達量檢測 采用RT-qPCR法檢測。取“1.2.1”中各組細胞，接種于96孔板，觀察細胞貼壁后，以2.5 mg·L-1順鉑干預(yù)24 h，開始實驗。以TRIzol試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。嚴格按照說明書進行RT-qPCR擴增，引物序列見Tab 1。反應(yīng)條件：94 ℃，5 min，預(yù)變性；94 ℃，35 s，變性；58 ℃，35 s，退火；72 ℃，35 s，延伸，共35次循環(huán)。以2-△△CT法計算miR-216b-5p、mTOR、Bcl-2 mRNA相對表達量。

1.2.6mTOR、p-mTOR、Bcl-2蛋白相對表達量檢測 采用蛋白質(zhì)印跡法檢測。取“1.2.1”中各組細胞，接種于96孔板，觀察細胞貼壁后，以2.5 mg·L-1順鉑干預(yù)24 h，開始實驗。各組加100 μL細胞裂解液，冰上裂解，提取細胞總蛋白。4 ℃，12 000 r·min-1離心，離心半徑10 cm，10 min，取上清液。BCA蛋白試劑定量檢測蛋白，沸水浴變性10 min，冰上冷卻10 min。各泳道分別加20 μL總蛋白樣品，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。加mTOR、p-mTOR、Bcl-2、β-actin(1 ∶1 000)一抗，搖床孵育過夜。TBST液清洗，重復(fù)3次，每次10 min。加二抗(1 ∶3 000)，室溫孵育2 h。TBST液清洗，重復(fù)3次，每次10 min。加ECL試劑顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照。目的蛋白相對表達量以目的蛋白與內(nèi)參條帶灰度值比值表示。

2 結(jié)果

2.1 化療敏感性各組IC50值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，甘草素10、20、40、60、80 mg·L-1組IC50值降低，且甘草素80 mg·L-1組<甘草素60 mg·L-1組<甘草素40 mg·L-1組<甘草素20 mg·L-1組<甘草素10 mg·L-1組(P<0.05)。見Tab 2。

Tab 2 Comparison of IC50 values in each group

2.2 細胞增殖能力各組MTT實驗細胞增殖活性比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，甘草素10、20、40、60、80 mg·L-1組MTT實驗細胞增殖活性升高，且甘草素10 mg·L-1組<甘草素20 mg·L-1組<甘草素40 mg·L-1組<甘草素60 mg·L-1組<甘草素80 mg·L-1組(P<0.05)。見Tab 3。

Tab 3 Comparison of experimental A MTT cells in each group

2.3 細胞凋亡各組細胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，甘草素10、20、40、60、80 mg·L-1組細胞凋亡率升高，且甘草素10 mg·L-1組<甘草素20 mg·L-1組<甘草素40 mg·L-1組<甘草素60 mg·L-1組<甘草素80 mg·L-1組(P<0.05)。見Fig 1、Tab 4。

Fig 1 Comparison of apoptosis in each group detected by flow cytometry

Tab 4 Comparison of apoptotic rate in each group

2.4 miR-216b-5p、mTOR、Bcl-2 mRNA相對表達量各組miR-216b-5p、Bcl-2 mRNA相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；各組mTOR mRNA相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組比較，甘草素10、20、40、60、80 mg·L-1組miR-216b-5p mRNA相對表達量升高，Bcl-2 mRNA相對表達量降低，且miR-216b-5p mRNA相對表達量，甘草素10 mg·L-1組<甘草素20 mg·L-1組<甘草素40 mg·L-1組<甘草素60 mg·L-1組<甘草素80 mg·L-1組，Bcl-2 mRNA相對表達量，甘草素80 mg·L-1組<甘草素60 mg·L-1組<甘草素40 mg·L-1組<甘草素20 mg·L-1組<甘草素10 mg·L-1組(P<0.05)。見Tab 5。

2.5 mTOR、p-mTOR、Bcl-2蛋白相對表達量各組p-mTOR、Bcl-2蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；各組mTOR蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組比較，甘草素10、20、40、60、80 mg·L-1組p-mTOR、Bcl-2蛋白相對表達量降低，且甘草素80 mg·L-1組<甘草素60 mg·L-1組<甘草素40 mg·L-1組<甘草素20 mg·L-1組<甘草素10 mg·L-1組(P<0.05)。見Fig 2、Tab 6。

Fig 2 Protein expression of mTOR, p-mTOR and Bcl-2 in each group

Tab 6 Comparison of relative expression of mTOR, p-mTOR and Bcl-2 protein in each group

3 討論

肺腺癌在臨床上較為常見，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，化療、放療及綜合治療等保守治療仍無法有效挽救生命，而腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性是保守治療無效主要原因之一。肺腺癌細胞對化療藥物耐藥的機制較為復(fù)雜，包括細胞異常凋亡、細胞膜內(nèi)酶系統(tǒng)異常、DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)增強、細胞自噬等[6]。因此，臨床采取有效措施提升肺腺癌患者化療敏感性，以控制病情，改善治療效果、預(yù)后，具有重要意義。近年來，單味中藥及中藥活性成分的應(yīng)用已逐漸成為抗腫瘤研究領(lǐng)域熱點之一，在腫瘤治療方面具有多途徑、多靶點及多效性特點，前景廣闊[7]。

甘草為常見中草藥之一，具有平陽秘、旺氣血、寬經(jīng)脈等作用，其有效成分甘草素還具有抗腫瘤的藥理作用[8]。報道顯示[9]，甘草素且可經(jīng)細胞色素C、Bcl-2家族等多種途徑，參與腫瘤細胞凋亡、自噬過程。王宇[10]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，甘草素能對人肺腺癌A549細胞遷移進行抑制，且作用機制可能與阻礙磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B通路有關(guān)。但目前，臨床就甘草素對肺腺癌細胞增殖凋亡及化療敏感性影響及機制尚無明確定論。本研究結(jié)果顯示，隨甘草素應(yīng)用濃度增加，人肺腺癌H1299細胞MTT實驗A值升高，這提示甘草素對人肺腺癌H1299細胞增殖有一定抑制作用，且抑制作用隨濃度增加而逐漸增強。另外，甘草素應(yīng)用后H1299細胞凋亡率升高，IC50值降低，這提示甘草素還可促進H1299細胞凋亡，提升化療敏感性，效果呈劑量依賴性。

miRNA是一種短鏈非編碼RNA分子，可經(jīng)由結(jié)合靶基因mRNA的3′端非編碼區(qū)一些特異性序列，對靶基因mRNA進行降解，調(diào)控基因表達[11]。其中，miR-216可抑制非小細胞肺癌的細胞增殖、侵襲能力[12]。秦巧紅等[13]研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織中miR-216b-5p存在低表達，且能對腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲能力進行抑制，可能成為腫瘤治療潛在靶點。還有學(xué)者提出[14]，miR-216b-5p表達上調(diào)可逆轉(zhuǎn)人前列腺癌細胞對紫杉醇耐藥性，提升化療敏感性。另外，miR-216b-5p可介導(dǎo)mTOR通路，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及治療過程[15]。mTOR是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與調(diào)控細胞生長、生殖、凋亡及血管內(nèi)皮再生等生理過程。報道顯示[16]，多種腫瘤細胞中存在抑癌基因磷酸酶與張力蛋白同源基因突變、缺失，可最終導(dǎo)致mTOR信號通路激活，促進腫瘤細胞增殖、遷移，增加腫瘤細胞抗凋亡效應(yīng)，在邏輯上促進腫瘤細胞耐藥發(fā)生。Bcl-2是一種凋亡調(diào)節(jié)因子，在細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用。研究還發(fā)現(xiàn)[17]，Bcl-2在TP53野生型膠質(zhì)母細胞瘤細胞中可對mTORC1/2抑制劑耐藥。張艷等[18]也發(fā)現(xiàn)，抑制mTOR通路可增強宮頸癌紫杉醇耐藥株對紫杉醇敏感性。這些研究均提示，miR-216b-5p介導(dǎo)的mTOR信號通路可能在肺腺癌疾病控制中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，甘草素應(yīng)用后miR-216b-5p mRNA相對表達量提升，Bcl-2 mRNA相對表達量及p-mTOR、Bcl-2蛋白相對表達量降低，且呈劑量依賴性，提示甘草素可上調(diào)miR-216b-5p表達，抑制mTOR信號通路，這可能是甘草素發(fā)揮抑制肺腺癌細胞增殖、促進細胞凋亡及提升化療敏感性的重要作用機制之一。

綜上所述，甘草素可抑制人肺腺癌H1299細胞增殖，促進細胞凋亡，提升化療敏感性，作用機制可能與上調(diào)miR-216b-5p表達、抑制mTOR信號通路有關(guān)。本研究不足之處在于僅分析了甘草素經(jīng)調(diào)控miR-216b-5p表達介導(dǎo)mTOR信號通路的作用，未就其他途徑進行分析，而甘草素影響肺腺癌細胞增殖凋亡及化療敏感性途徑較多，故今后仍需進一步分析。