關(guān) 瑩 薛繼鵬 薛 敏 謝曉澤 吳秀峰 鄭銀樺 梁曉芳*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，國(guó)家水產(chǎn)飼料安全評(píng)價(jià)基地，北京 100081；2.大連海洋大學(xué)，遼寧省北方魚類應(yīng)用生物學(xué)與增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116023；3.廣州市博仕奧生化技術(shù)研究有限公司，廣州 511356)

大口黑鱸(Micropterussalmoides)，又名加州鱸，隸屬鱸形目(Perciforme)，太陽(yáng)魚科(Ceutrarchidac)，黑鱸屬(Micropterus)。由于其生長(zhǎng)速度快、肉質(zhì)鮮美和較高的市場(chǎng)價(jià)值，2019年在我國(guó)產(chǎn)量達(dá)到47.78萬(wàn)t，已成為我國(guó)重要的商業(yè)養(yǎng)殖品種之一[1-2]。作為典型的肉食性魚類，傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式下以飼喂冰鮮餌料為主[3]。近年來(lái)，隨著環(huán)保壓力的增加，在由冰鮮魚向人工配合飼料轉(zhuǎn)型的過(guò)程中，魚粉和其他動(dòng)物蛋白質(zhì)仍是其主要蛋白質(zhì)源，尤其對(duì)魚粉的依賴程度較高，商業(yè)配方中魚粉含量高達(dá)30%以上[4-5]。盡管魚粉具有不可替代的優(yōu)勢(shì)，但是其較高的成本價(jià)格已經(jīng)成為制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的限制性因素。因此，尋找新型蛋白質(zhì)源來(lái)減少大口黑鱸配方中魚粉的用量，提高非魚粉蛋白利用率，降低氮磷排放，開(kāi)發(fā)環(huán)境友好型飼料，是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展亟需解決的重要問(wèn)題[6-7]。

植物蛋白質(zhì)源價(jià)格低于魚粉，來(lái)源廣泛，一直是魚粉替代研究的熱點(diǎn)。但植物蛋白質(zhì)源本身含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子、氨基酸不平衡及適口性差等問(wèn)題，對(duì)于需求高蛋白質(zhì)的養(yǎng)殖魚類，尤其是在肉食性魚類中利用率相對(duì)偏低[8-9]。棉籽濃縮蛋白(cottonseed protein concentration, CPC)與傳統(tǒng)的棉籽粕原料相比，采用軟化軋胚、低溫烘干等工藝取代了高溫蒸炒/膨化過(guò)程，可以有效降低蛋白質(zhì)的熱變性程度，使其更好地被動(dòng)物消化吸收，作為魚粉替代蛋白質(zhì)源在水產(chǎn)動(dòng)物中應(yīng)用日益廣泛[10-11]。此外，近年來(lái)研究表明可通過(guò)一些非抗生素類飼料添加劑來(lái)減少環(huán)境污染和改善水產(chǎn)動(dòng)物健康減少植物蛋白質(zhì)的潛在不利影響，以改善水生動(dòng)物的肝腸健康和對(duì)植物蛋白質(zhì)的利用率。例如，在飼糧中添加酶制劑可以有效消除這些抗?fàn)I養(yǎng)因子的不良影響，提高水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)性能、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率和腸道消化酶活性，改善腸道功能，降低飼料系數(shù)，減少磷的排放量，從而減輕環(huán)境污染等[12-15]。此外，植物蛋白質(zhì)源常存在一些非淀粉多糖、果膠、纖維素聚合物等，這些物質(zhì)使水產(chǎn)動(dòng)物消化道內(nèi)容物的黏度增加，影響水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)有效營(yíng)養(yǎng)成分的消化和吸收，而在飼料中添加酶制劑，可有效去除非淀粉多糖等[16-17]。蛋白酶是催化分解肽鍵的一類酶的總稱，能將蛋白質(zhì)降解為小分子的蛋白胨、肽和氨基酸，從而提高蛋白質(zhì)的消化利用率[18-20]。

大口黑鱸作為典型肉食性魚類，對(duì)配合飼料中淀粉利用能力較差，易引起肝臟組織糖原積累、糖、脂代謝紊亂和代謝性肝病[21-22]，而淀粉作為膨脹劑和黏合劑，在膨化浮性飼料的加工中至關(guān)重要[23]，低淀粉會(huì)給膨化浮性飼料的加工帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)，限制了大口黑鱸產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，大口黑鱸對(duì)糖的不耐受所引發(fā)糖、脂代謝異常和營(yíng)養(yǎng)性肝病是限制人工配合飼料應(yīng)用的重要原因。目前為止，蛋白酶在水產(chǎn)動(dòng)物中的研究主要集中在生長(zhǎng)性能、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率和腸道健康等方面[24-25]，而在高比例植物蛋白質(zhì)替代魚粉后對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)性能、蛋白質(zhì)和糖、脂代謝的影響未見(jiàn)報(bào)道。

因此，本試驗(yàn)旨在通過(guò)采用CPC替代配方中40%魚粉蛋白，并在此基礎(chǔ)上添加不同劑量蛋白酶，研究CPC替代以及蛋白酶對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)性能、肝功能、消化酶活性以及蛋白質(zhì)和糖、脂代謝的影響，進(jìn)而確定蛋白酶在大口黑鱸飼料中的適宜添加量。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚

試驗(yàn)用水產(chǎn)動(dòng)物為大口黑鱸，于2019年5月購(gòu)買于天津玉清水產(chǎn)科技發(fā)展公司。試驗(yàn)正式開(kāi)始前，試驗(yàn)魚在養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)1周，暫養(yǎng)期間投喂魚粉含量為50%的飼料(HFM)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼料

試驗(yàn)將初始體重為(31.39±0.05) g的大口黑鱸幼魚240尾，隨機(jī)分為2個(gè)對(duì)照組和2個(gè)試驗(yàn)組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20尾魚。采用HFM為正對(duì)照飼料(HFM組)，采用CPC替代40%魚粉蛋白的飼料(LFM，魚粉含量為30%)為基礎(chǔ)對(duì)照飼料(LFM組)，在LFM基礎(chǔ)上分別添加300、500 mL/t的中性蛋白酶配制試驗(yàn)飼料，在40 ℃、pH 7.0～7.5條件下，蛋白酶的活性為15 000 U/mL。將2種試驗(yàn)飼料分別命名為L(zhǎng)FM+E4500和LFM+E7500(LFM+E4500組和LFM+E7500組)。LFM、LFM+E4500和LFM+E7500組飼料中分別添加蛋氨酸、蘇氨酸和魚油來(lái)平衡必需氨基酸和必需脂肪酸，以磷酸二氫鈣補(bǔ)充有效磷，各組飼料等氮等能。物料經(jīng)超微粉碎過(guò)80目篩并均勻混合后，使用雙螺桿擠壓膨化機(jī)(洋工機(jī)械TSE65)擠壓膨化，制成粒徑為3 mm的顆粒飼料，自然晾干后于-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩ｏ暳辖M成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在國(guó)家水產(chǎn)飼料安全評(píng)價(jià)基地(北京，南口)室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行，水源為曝氣井水，流量為9.64 L/min。用2%食鹽水消毒試驗(yàn)魚及養(yǎng)殖系統(tǒng)后，隨機(jī)挑選體質(zhì)健康、個(gè)體均勻的大口黑鱸[平均初始體重為(31.39±0.05) g]，分配到容積為0.26 m3的圓錐形養(yǎng)殖桶中。養(yǎng)殖周期為65 d，每天表觀飽食投喂2次，投喂時(shí)間分別為08:00和17:00，并記錄死魚和收集殘餌。定期檢測(cè)水質(zhì)，水質(zhì)條件保持在溶氧(DO)濃度>7.0 mg/L，總氨氮濃度<0.3 mg/L，pH =7.5～8.5，水溫24.0～27.5 ℃。

1.4 樣品采集

生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)束并禁食24 h后分別對(duì)各桶魚稱重，用于計(jì)算生長(zhǎng)指標(biāo)。每組隨機(jī)取12尾魚(每桶4尾魚)，用三氯叔丁醇麻醉后測(cè)量體長(zhǎng)、體重及內(nèi)臟、肝臟和腹脂重量，用于計(jì)算形體指標(biāo)；用含有氟化鈉草酸鉀抗凝劑的注射器從麻醉魚的尾靜脈抽取血液，在4 ℃、4 000 r/min的條件下離心10 min，取上層血漿備用。血漿、肝臟、腹脂、腸道和全魚等樣品均在-80 ℃條件下保存。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分

分別采用105 ℃常壓干燥法(GB/T 6435—2006)、凱氏定氮法(GB/T 6432—1994)、酸水解粗脂肪法(GB/T 6433—2006)、550 ℃灼燒法(GB/T 6438—2007)測(cè)定原料、飼料和魚體的水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分含量；總能的檢測(cè)方法參照ISO 9831:1998，采用氧彈儀測(cè)定；飼料中氨基酸含量采用GB/T 18246—2000中方法進(jìn)行測(cè)定。

1.5.2 生長(zhǎng)指標(biāo)

各指標(biāo)計(jì)算公式如下：

存活率(SR，%)=100×Nt/N0；增重率(WGR，%)=100×
(Wt-W0+Wd)/W0；特定生長(zhǎng)率(SGR，%/d)=
100×(lnWt-lnW0)/t；飼料系數(shù)(FCR)=C/
(Wt+Wd-W0)；攝食率(FR，%/d)=100×C/
{[(W0+Wt+Wd)/2]/t}；蛋白質(zhì)沉積率(PPV，%)=
100×(Wt×Wtp-W0×W0p)/(Wf×Wfp)。

式中：N0為初始魚數(shù)量(尾)；Nt為終末魚數(shù)量(尾)；W0為初始魚體總重(g)；Wt為終末魚體總重(g)；Wd為死亡魚體總重(g)；C為攝食量(g)；Wtp為終末全魚粗蛋白質(zhì)含量(%)；W0p為初始全魚粗蛋白質(zhì)含量(%)；Wf為飼料投喂量(g)；Wfp為飼料粗蛋白質(zhì)含量(%)；t為試驗(yàn)天數(shù)(d)。

1.5.3 形體指標(biāo)

各指標(biāo)計(jì)算公式如下：

肥滿度(CF，g/cm3)=
平均體重/平均體長(zhǎng)3；肝體比(HSI，%)=100×肝臟重/體重；臟體比(VSI，%)=100×內(nèi)臟重/體重；腹脂率(VAI，%)=
100×腹脂重/體重。

1.5.4 血漿和肝臟、腸道組織勻漿生理生化指標(biāo)

血漿中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、總蛋白(TP)、總膽汁酸(TBA)含量，堿性磷酸酶(AKP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性，總抗氧化能力(T-AOC)和肝臟TG、糖原(GLY)含量等指標(biāo)均按照南京建成生物工程研究所的試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定；血漿葡萄糖(GLU)含量按照上海榮盛藥業(yè)有限公司的試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定；肝臟環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、腸道蛋白酶含量及葡萄糖激酶(GK)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)、甘油三酯脂肪酶(ATGL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)、單酰甘油脂肪酶(MGL)活性按照江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司的試劑盒說(shuō)明書，使用酶標(biāo)儀(Bio-Tek，Burlington，美國(guó))進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.5 肝臟和腹腔脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)

用RNAiso Plus試劑(日本TaKaRa)從肝組織中提取總RNA，用NanoDrop 2000(美國(guó)Thermo)分光光度法定量，并在1%變性瓊脂糖凝膠上電泳以評(píng)估RNA完整性，采用gDNA Eraser處理1.0 μg總RNA以去除基因組DNA污染物，然后使用PrimeScript RT試劑盒(日本TaKaKa)在20 μL體積內(nèi)通過(guò)反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行cDNA合成。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±均值標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，所有數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan氏多重比較法檢驗(yàn)差異顯著性，顯著性水平為P<0.05。圖形由GraphPad Prism 8.0(GraphPad，美國(guó))繪制。

2 結(jié) 果

2.1 生長(zhǎng)性能和形體指標(biāo)

由表3可知，飼料中以CPC替代40%魚粉蛋白后，與HFM組相比，大口黑鱸終末體重、增重率和特定生長(zhǎng)率顯著提高(P<0.05)。添加4 500 U/kg蛋白酶后，生長(zhǎng)性能與LFM組無(wú)顯著差異(P>0.05)；添加7 500 U/kg蛋白酶后，與LFM組相比，飼料系數(shù)顯著升高(P<0.05)，魚體蛋白質(zhì)沉積率顯著降低(P<0.05)。各組間存活率均無(wú)顯著差異(P>0.05)，但LFM+E4500和LFM+E7500組的存活率較LFM組有一定程度的提高。

CPC替代40%魚粉蛋白后，與HFM組相比，大口黑鱸肝體比顯著升高(P<0.05)，添加7 500 U/kg蛋白酶顯著降低肝體比和臟體比(P<0.05)，但各組肝體比均未高于2，屬于正常范圍。變化最為顯著的是蛋白酶對(duì)大口黑鱸腹脂率的影響，與LFM組相比，2組腹脂率均顯著降低(P<0.05)。

表3 飼料中添加蛋白酶對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)性能和形體指標(biāo)的影響

2.2 血漿肝功能和抗氧化指標(biāo)

由表4可知，CPC替代40%魚粉蛋白后，血漿ALT、AST活性較HFM組顯著升高(P<0.05)，AKP活性無(wú)顯著差異(P>0.05)；添加蛋白酶后，血漿ALT、AST活性較LFM組顯著下降(P<0.05)，AKP活性與LFM組無(wú)顯著差異(P>0.05)。各組間血漿TP、TBA含量和T-AOC均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表4 飼料中添加蛋白酶對(duì)大口黑鱸血漿肝功能和抗氧化指標(biāo)的影響

2.3 全魚體成分

由表5可見(jiàn)，CPC替代40%魚粉蛋白后，全魚體成分與HFM組無(wú)顯著差異(P>0.05)。與LFM組相比，添加4 500 U/kg蛋白酶后，魚體水分含量顯著上調(diào)(P<0.05)，粗脂肪含量顯著下調(diào)(P<0.05)；添加7 500 U/kg蛋白酶后，魚體水分含量顯著上調(diào)(P<0.05)。各組間魚體粗灰分、粗蛋白質(zhì)和肝脂含量均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.4 腸道蛋白酶含量

由表6可知，CPC替代40%魚粉蛋白后，前、中、后腸蛋白酶含量與HFM組均無(wú)顯著差異(P>0.05)；與LFM組相比，添加蛋白酶后，顯著提高大口黑鱸前、后腸蛋白酶含量(P<0.05)。各組間中腸蛋白酶含量均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.5 糖代謝過(guò)程

由圖1-A可見(jiàn)，CPC替代40%魚粉蛋白后，肝臟GLY含量顯著增加(P<0.05)；與LFM組相比，添加蛋白酶后，LFM+E4500組空腹血漿葡萄糖含量顯著升高(P<0.05)，LFM+E4500和LFM+E7500組GLY含量顯著減少(P<0.05)，但均與HFM組無(wú)顯著差異(P>0.05)。糖代謝相關(guān)酶活性如圖1-B，在餐后24 h，CPC替代40%魚粉蛋白后，與HFM組相比，肝臟糖酵解酶GK活性顯著下調(diào)(P<0.05)。添加4 500 U/kg蛋白酶后，肝臟糖酵解酶GK和糖異生酶PEPCK、G6Pase活性較LFM組顯著提高(P<0.05)；添加7 500 U/kg蛋白酶后，肝臟糖代謝相關(guān)酶活性與LFM組無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表5 飼料中添加蛋白酶對(duì)大口黑鱸體成分的影響

表6 飼料中添加蛋白酶對(duì)大口黑鱸腸道蛋白酶含量的影響

GLU:葡萄糖 glucose; GLY:糖原 glycogen; GK:葡萄糖激酶 glucokinase; PK:丙酮酸激酶 pyruvate kinase; PEPCE:磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 phosphoenolpyruvate carboxykinase; G6Pase:葡萄糖-6-磷酸酶 glucose-6-phosphatase.

2.6 脂代謝過(guò)程

由圖2-A可見(jiàn)，CPC替代40%魚粉蛋白后，與HFM組相比，血漿TC、TG含量顯著增加(P<0.05)，肝臟TG含量顯著減少(P<0.05)；添加蛋白酶后，LFM+E4500和LFM+E7500組血漿TG含量較LFM組顯著減少(P<0.05)；由圖2-B可見(jiàn)，CPC替代40%魚粉蛋白后，與HFM組相比，肝臟中脂肪合成基因PPARγ、脂肪分解基因ATGL和β氧化相關(guān)基因PPARαmRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.05)，脂肪分解基因HSLmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)。與LFM組相比，添加蛋白酶后，LFM+E4500組肝臟中ATGLmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)，HSLmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)，PPARαmRNA相對(duì)表達(dá)量保持高表達(dá)；LFM+E7500組肝臟中PPARγ、ATGL和PPARαmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)，HSLmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)。由圖2-C可知，CPC替代40%魚粉蛋白質(zhì)后，肝臟酶活性與HFM組無(wú)顯著差異(P>0.05)；添加蛋白酶后，LFM+E4500組肝臟ATGL和MGL活性較LFM組顯著上調(diào)(P<0.05)；LFM+E7500組肝臟ATGL和MGL活性與LFM組無(wú)顯著差異(P>0.05)。

由圖2-D可知，CPC替代40%魚粉蛋白后，腹脂β氧化基因PPARαmRNA相對(duì)表達(dá)量較HFM組顯著上調(diào)(P<0.05)。添加蛋白酶后，2個(gè)試驗(yàn)組腹脂脂肪分解基因ATGL和HSLmRNA相對(duì)表達(dá)量較LFM組顯著上調(diào)(P<0.05)，β氧化相關(guān)基因PPARαmRNA相對(duì)表達(dá)量較LFM組顯著下調(diào)(P<0.05)，但仍然較HFM組顯著上調(diào)(P<0.05)。

TC:膽固醇 cholesterol; TG:甘油三酯 triglyceride; ACC1:乙酰輔酶A羧化酶1 acetyl CoA carboxylase 1; FASN:脂肪酸合成酶 fatty acid synthetase; PPARγ:過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ peroxisome proliferator-activated receptor γ; ATGL:脂肪甘油三酯脂肪酶 adipose triacylglyceride lipase; HSL:激素敏感性脂肪酶 hormone-sensitive triglyceride lipase; CPT1A:肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A carnitine palmitoyltransferase 1A; PPARα:過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α peroxisome proliferator-activated receptor α; MGL:單酰甘油脂肪酶 monoacylglycerol lipase.

2.7 基礎(chǔ)能量代謝水平

CPC替代40%魚粉蛋白后，肝臟cAMP含量較HFM組顯著降低(P<0.05)(圖3-A)；添加蛋白酶后，2個(gè)試驗(yàn)組肝臟cAMP含量和肝臟CREBmRNA相對(duì)表達(dá)量均較LFM組顯著增加(P<0.05)(圖3-B)。

cAMP:環(huán)磷酸腺苷 cyclic adenosine monophosphate; CREB:環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白 cAMP-response element binding protein。

2.8 蛋白質(zhì)合成

由圖4可知，CPC替代40%魚粉蛋白后，肝臟蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因TOR和IGF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量較HFM組顯著上調(diào)(P<0.05)。添加蛋白酶后，LFM+E4500組肝臟TOR和IGF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與LFM組無(wú)顯著差異(P>0.05)；但LFM+E7500組肝臟TOR和IGF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量較LFM組顯著下調(diào)(P<0.05)。

3 討 論

酶制劑作為一種綠色飼料添加劑，其在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用已有廣泛研究，但在生產(chǎn)實(shí)踐中受熱敏性限制，并未被廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，隨著真空后噴涂技術(shù)在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用，使得液體酶制劑在水產(chǎn)膨化飼料中的應(yīng)用成為可能[26]。董穎超等[27]對(duì)植酸酶的研究表明，真空后噴涂技術(shù)可以顯著提高膨化飼料中酶活性的保存率，避免酶制劑中有效成分的損失，為酶制劑在水產(chǎn)飼料中的實(shí)踐應(yīng)用提供有力支撐。

已有研究表明，CPC是一種在水產(chǎn)飼料行業(yè)具備優(yōu)秀潛力，且氨基酸均衡、蛋白質(zhì)變性小、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、適口性好的非糧蛋白質(zhì)源[28-30]。本研究顯示，飼料中以CPC替代40%的魚粉蛋白后，生長(zhǎng)性能反而顯著升高。本試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明平衡必需營(yíng)養(yǎng)素后，大口黑鱸飼料中適當(dāng)降低魚粉用量(30%)是可行的，同時(shí)說(shuō)明CPC作為一種低抗?fàn)I養(yǎng)因子的植物蛋白質(zhì)源，在大口黑鱸膨化飼料中具有較好的應(yīng)用前景。目前，中性蛋白酶在水產(chǎn)動(dòng)物配合飼料中的應(yīng)用研究還比較少。有研究表明，飼料中添加適量蛋白酶可以顯著提高蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率，從而提高生長(zhǎng)性能[31-32]。在對(duì)羅非魚[13]、吉富羅非魚[18]、鯉魚[33-34]、凡納濱對(duì)蝦[35]和虹鱒[36]的研究中表明，飼料中添加蛋白酶可以顯著提高水生動(dòng)物的生長(zhǎng)性能。以上對(duì)羅非魚[13]、吉富羅非魚[18]、鯉魚[33-34]、凡納濱對(duì)蝦[35]和虹鱒[36]的研究是在魚粉含量(0、5%、6%、10%等)偏低而植物蛋白質(zhì)含量較高的基礎(chǔ)飼料中添加外源蛋白酶，可以降低植物蛋白質(zhì)中抗胰蛋白酶的作用，從而使魚類能更好地利用植物蛋白質(zhì)，提高生長(zhǎng)性能。本研究在LFM(魚粉含量為30%)基礎(chǔ)上添加4 500 U/kg蛋白酶對(duì)生長(zhǎng)性能沒(méi)有顯著影響，與上述研究結(jié)果不同，可能與基礎(chǔ)飼料魚粉含量較高有關(guān)。本研究顯示，飼料中添加7 500 U/kg蛋白酶顯著降低大口黑鱸魚體蛋白質(zhì)沉積率，并提高飼料系數(shù)，降低飼料利用率。這說(shuō)明酶制劑在水產(chǎn)飼料中的使用需精準(zhǔn)添加，添加量要與飼料配方底物中的量相適應(yīng)，否則會(huì)影響水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)性能并降低飼料利用率。

TOR:雷帕霉素靶蛋白 target of rapamycin; IGF-1:類胰島素生長(zhǎng)因子-1 insulin-like growth factors-1。

血液指標(biāo)是衡量魚類健康狀態(tài)的一個(gè)重要指標(biāo)[37]。AST和ALT主要存在于心臟和肝臟組織中，其活性高低可以反映出動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)合成和分解的能力，同時(shí)AST和ALT是反映動(dòng)物肝臟運(yùn)作狀態(tài)的重要代謝酶，其活性較高時(shí)可作為衡量肝臟的損傷與否及損傷程度的指標(biāo)[38-40]。石澤[41]、Ndazigaruye等[42]研究表明，飼料中添加蛋白酶對(duì)建鯉和肉雞的血清ALT、AST活性無(wú)顯著影響。本研究顯示，添加蛋白酶后血清AST、ALT活性顯著下降，與建鯉和肉雞的研究結(jié)果不同，可能與蛋白酶理化性質(zhì)不同和物種不同有關(guān)。本研究說(shuō)明添加蛋白酶對(duì)大口黑鱸肝功能有一定保護(hù)作用。LFM和LFM+E4500組血漿AKP活性較高，但各組血漿TBA含量沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明各組并未顯示明顯膽汁淤積癥表型。

蛋白酶是蛋白質(zhì)代謝過(guò)程中非常重要的一類消化酶，能催化分解肽鍵，將大分子的蛋白質(zhì)降解為蛋白胨、肽和氨基酸等小分子的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的消化，提高動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的消化率和飼料利用率[43]。在對(duì)中華草龜[44]、虹鱒[45]、吉富羅非魚[18]和鯉魚[33]等的研究表明，飼料中添加中性蛋白酶可以顯著提高腸道蛋白酶活性。本研究顯示，飼料中添加4 500和7 500 U/kg蛋白酶可以顯著提高大口黑鱸前、后腸蛋白酶含量，與上述研究結(jié)果一致。其作用機(jī)理可能是飼料中添加外源性蛋白酶可以水解蛋白質(zhì)類抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高蛋白質(zhì)的消化率[46-47]，并且能促進(jìn)魚體內(nèi)源性蛋白酶的分泌，從而提高大口黑鱸腸道蛋白酶活性，內(nèi)外協(xié)同提高魚體對(duì)蛋白質(zhì)的消化吸收能力[22]。

與魚粉相比，植物蛋白質(zhì)中不但缺乏必需氨基酸、必需脂肪酸和有效磷，并且其碳水化合物含量也較高[48]。大口黑鱸作為一種肉食性魚類，對(duì)碳水化合物的利用能力和對(duì)糖代謝穩(wěn)態(tài)的控制能力都比較差[49]。飼料中添加蛋白酶可以顯著提高大口黑鱸腸道蛋白酶活性，從而可以將蛋白質(zhì)更高效地分解成氨基酸等小分子物質(zhì)，提供底物來(lái)促進(jìn)肝臟糖異生作用[50]。目前為止，蛋白酶對(duì)大口黑鱸糖、脂代謝方面的影響研究較少。對(duì)建鯉[51]和黃顙魚[52]的研究表明，飼料中添加蛋白酶對(duì)血漿GLU含量均無(wú)顯著影響。本研究結(jié)果顯示，在餐后24 h，CPC替代40%魚粉蛋白后，糖代謝過(guò)程與HFM組無(wú)顯著差異。添加4 500 U/kg蛋白酶后，對(duì)空腹糖異生有明顯的促進(jìn)作用，顯示蛋白酶添加有助于大口黑鱸在空腹?fàn)顟B(tài)時(shí)相關(guān)酶的正常表達(dá)。LFM+E4500組空腹血漿GLU含量顯著升高，可能與其糖異生作用增加有關(guān)。魚類的內(nèi)臟、肝臟和肌肉中分布著大量的脂肪細(xì)胞。魚類腹部脂肪蓄積后會(huì)導(dǎo)致機(jī)體營(yíng)養(yǎng)代謝紊亂，從而使抗病力抗應(yīng)激能力下降，以至于在受到外界環(huán)境刺激后容易爆發(fā)疾病甚至大部分死亡[53]。對(duì)異育銀鯽[41]和黃顙魚[52]的研究表明，飼料中添加蛋白酶對(duì)血漿TG含量均無(wú)顯著影響。本研究結(jié)果顯示，CPC替代40%魚粉蛋白后，LFM組大口黑鱸肝臟脂代謝循環(huán)上調(diào)；添加蛋白酶后，可以明顯加速肝臟和腹部脂肪分解過(guò)程，減少大口黑鱸肝臟和腹部脂肪積聚，可以使魚體可食用部分增加，極大地提高了大口黑鱸的商業(yè)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。

cAMP是由糖酵解和三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的三磷酸腺苷合成的第二信使分子，cAMP/CREB途徑可以上調(diào)脂解/β氧化的基因表達(dá)，提高基礎(chǔ)能量代謝水平，從而保護(hù)肝臟組織免受脂質(zhì)積聚[54-55]。脂肪脂解作用上調(diào)后，產(chǎn)生的甘油和游離脂肪酸可分別通過(guò)磷酸化和β氧化途徑轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿岫u丙酮和草酰乙酸，作為糖異生的底物來(lái)促進(jìn)肝臟糖異生[56]。本研究中，CPC部分替代魚粉后，LFM組肝臟cAMP含量顯著降低；添加4 500 U/kg蛋白酶后，肝臟cAMP含量顯著提高到與HFM組無(wú)顯著差異的水平，表明蛋白酶可以提高大口黑鱸的基礎(chǔ)能量代謝水平，建議在添加蛋白酶的飼料中要適當(dāng)提高飼料能量水平，并且活化的cAMP通過(guò)上調(diào)CREB表達(dá)量，上調(diào)脂解/β-氧化的基因(HSL、PPARα)表達(dá)和肝臟脂解關(guān)鍵酶ATGL、MGL活性，從而保護(hù)肝臟組織免受脂質(zhì)積聚，并進(jìn)一步增強(qiáng)大口黑鱸的肝臟糖異生作用。TOR是一種存在于胞漿中的蛋白激酶，胰島素樣生長(zhǎng)因子IGF-1可通過(guò)激活TOR的表達(dá)量來(lái)促進(jìn)機(jī)體蛋白質(zhì)的合成[57-58]。本研究顯示，飼料中添加7 500 U/kg蛋白酶后，肝臟中IGF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)，從而使TORmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)，抑制大口黑鱸機(jī)體蛋白質(zhì)的合成，并且LFM+E7500組的基礎(chǔ)能量代謝水平與LFM+E4500組同樣保持高表達(dá)，從而顯著降低魚體蛋白質(zhì)沉積率。

4 結(jié) 論

綜上所述，飼料中CPC替代40%魚粉蛋白(魚粉用量由50%降低到30%)后，大口黑鱸生長(zhǎng)性能反而升高。在低魚粉基礎(chǔ)飼料中添加4 500 U/kg的蛋白酶，可進(jìn)一步提高大口黑鱸的基礎(chǔ)能量代謝水平和前、后腸蛋白酶含量，促進(jìn)空腹?fàn)顟B(tài)下糖代謝關(guān)鍵酶的正常表達(dá)，并可以減少肝臟和魚體脂質(zhì)積累，但過(guò)量添加(7 500 U/kg)蛋白酶會(huì)降低魚體蛋白質(zhì)沉積率，提高飼料系數(shù)，從而降低飼料利用率。