高俊峰，黃 婷，劉小敏

(國(guó)糧武漢科學(xué)研究設(shè)計(jì)院有限公司//國(guó)家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(武漢)，湖北 武漢 430079)

丙酸為無色透明液體，屬于一種強(qiáng)極性酸性化合物，易溶于水；丙酸鹽包括丙酸鈉、丙酸鈣、丙酸鉀等[1]。丙酸及丙酸鹽都是酸性防霉劑，具有較廣的抗菌譜，對(duì)霉菌、真菌、酵母菌等都有一定的抑制作用，其毒性很低，是動(dòng)物正常代謝的中間產(chǎn)物，也是飼料工業(yè)中應(yīng)用最廣泛的防霉劑[1]。

飼料中丙酸的提取主要以蒸餾法為主，但由于飼料基質(zhì)復(fù)雜，在水蒸汽蒸餾過程中某些飼料中的高淀粉原料易糊化，因此導(dǎo)致飼料中的丙酸無法完全提取，影響測(cè)定結(jié)果，因此必須優(yōu)化試驗(yàn)的前處理?xiàng)l件。國(guó)內(nèi)外關(guān)于丙酸、丙酸鹽類分析方法的報(bào)道較多，有氣相色譜法(GC)、氣質(zhì)聯(lián)用色譜法(GC-MS)、薄層色譜法、電位滴定法、毛細(xì)管電泳法等[2-6]。薄層色譜法、電位滴定法、毛細(xì)管電泳法由于其靈敏度、精密度以及分析速度均不理想，故很少用于飼料中丙酸(丙酸鹽)的測(cè)定。氣質(zhì)聯(lián)用色譜法雖然特異性高、抗干擾能力強(qiáng)，但使用成本昂貴。因此，本試驗(yàn)采用氣相色譜法作為試驗(yàn)方法。參考GB/T 17815—1999《飼料中丙酸、丙酸鹽的測(cè)定》[7]，發(fā)現(xiàn)該標(biāo)準(zhǔn)制訂年限較早，受當(dāng)時(shí)技術(shù)條件限制，使用的是載量低的玻璃填充柱，方法中無檢出限和定量限。本試驗(yàn)采用目前主流的石英毛細(xì)管柱。通過對(duì)試樣前處理?xiàng)l件、氣相色譜柱的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)該法具有便利性高、靈敏度高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，可滿足不同種類飼料中丙酸的測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Trace1310氣相色譜儀，配氫火焰離子化檢測(cè)器和Chromeleon7數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，美國(guó)賽默飛世爾公司；0.1 mg電子天平，梅特勒托利多公司；純水機(jī)，美國(guó)賽默飛世爾公司；全玻璃蒸餾裝置(具500 ml蒸餾瓶)。

丙酸標(biāo)準(zhǔn)品(CAS號(hào)79-09-4，純度≥97.0%)，北京壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；硅油、優(yōu)級(jí)純磷酸、分析純石英砂、分析純氯化鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；色譜純甲酸，天津科密歐化學(xué)試劑公司；0.45 μm水溶性濾膜，天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；飼料樣品，國(guó)家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(武漢)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取1.031 0 g丙酸標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.1 mg)，以超純水為溶劑，配制成10 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，于4℃保存。移取標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，用超純水稀釋到1 mg/ml作為標(biāo)準(zhǔn)工作液，臨用現(xiàn)配。

1.3 儀器條件

Agilent DB-WAX石英毛細(xì)管柱(柱長(zhǎng)30 m，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚度0.5 μm)，美國(guó)安捷倫科技公司；載氣流速：1 ml/min；進(jìn)樣口溫度：250℃；檢測(cè)器溫度：250℃；柱溫箱溫度：110℃保持5 min，然后以10℃/min的速率升到180℃，保持5 min；分流比：5∶1；進(jìn)樣量：1 μl。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理的優(yōu)化

針對(duì)某些飼料在水蒸汽蒸餾過程中易糊化的缺點(diǎn)，本試驗(yàn)加入過量的氯化鈉、適量的石英砂防止飼料結(jié)塊，從而提高蒸餾效率和結(jié)果的準(zhǔn)確性。

準(zhǔn)確移取10 mg丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液置于蒸餾裝置中，進(jìn)行水蒸汽蒸餾并測(cè)定回收率，以此來比較不同條件下的蒸餾提取效果。結(jié)果見表1。

表1 不同蒸餾條件對(duì)丙酸回收率的影響

同時(shí)，研究了蒸餾餾出液體積對(duì)測(cè)定的影響，按本次試驗(yàn)規(guī)定的條件進(jìn)行水蒸汽蒸餾，測(cè)定回收率，結(jié)果見圖1。

圖1 蒸餾體積對(duì)丙酸回收率影響

由表1和圖1最終確認(rèn)前處理優(yōu)化步驟如下：準(zhǔn)確稱取50 g試樣(精確至0.1 g)置于500 ml的蒸餾瓶中，迅速加入200 ml水，80 g氯化鈉，10 ml 50%磷酸溶液，10 g石英砂及2～3滴硅油，立即進(jìn)行水蒸汽蒸餾；將250 ml容量瓶置于冰水浴中作為吸收液裝置，放置直至餾出液接近240 ml。在室溫下放置30 min，加1.0 ml 2%甲酸溶液，充分搖勻后定容,用0.45 μm濾膜過濾待測(cè)。

2.2 方法的線性范圍

丙酸溶液標(biāo)準(zhǔn)氣相色譜圖見圖2。

圖2 丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液氣相色譜圖(c=100 μg/ml)

采用空白基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)溶液提取法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別取1.2中適量的標(biāo)準(zhǔn)工作液置于500 ml蒸餾瓶中，按照2.1優(yōu)化后的前處理?xiàng)l件進(jìn)行蒸餾提取，得到質(zhì)量濃度分別為5.0、10.0、20.0、40.0、100.0、200.0、400.0 μg/ml的丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。以丙酸濃度為橫坐標(biāo)，丙酸色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在質(zhì)量濃度5.0～400.0 μg/ml時(shí)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.999。

2.3 方法的檢出限與定量限

根據(jù)GB/T 27417—2017《合格評(píng)審化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》關(guān)于檢出限和定量限描述[8]，本試驗(yàn)中丙酸的可視最低檢出濃度為5.0 μg/ml，可視可靠最低檢出濃度為20.0 μg/ml。依據(jù)2.1中的稱樣量和稀釋體積得出檢出限為30 mg/kg，定量限為100 mg/kg。

2.4 方法的加標(biāo)回收試驗(yàn)

不同種類飼料丙酸的添加回收率見表2。

表2 不同種類飼料丙酸的添加回收率(n=5)

選用谷物類原料(玉米、小麥)、發(fā)酵類(DDGS)、蛋白類(豆粕、肉粉、魚粉)、配合飼料(豬、雞、魚配合飼料)、濃縮飼料(豬濃縮飼料)為測(cè)試對(duì)象，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每批次內(nèi)同一濃度做5次平行試驗(yàn)。

從表2數(shù)據(jù)中可以看出，丙酸加標(biāo)平均回收率為84.3%～99.81%，RSD為0.62%～4.81%。該法能適應(yīng)飼料原料、植物蛋白飼料、配合飼料、濃縮飼料等各種飼料中丙酸的測(cè)定。

2.5 方法的重復(fù)性試驗(yàn)

為考察方法重復(fù)性，選用谷物類原料(玉米)、蛋白類(豆粕)、配合飼料(豬配合飼料)、濃縮飼料(豬濃縮飼料)為測(cè)試對(duì)象，不同實(shí)驗(yàn)室用同一樣品進(jìn)行試驗(yàn)，每批次同一濃度做5次平行試驗(yàn)，以此來考察方法的重復(fù)性，結(jié)果見表3。

表3 不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)同批次不同丙酸添加水平測(cè)定結(jié)果的統(tǒng)計(jì)

通過分析不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)不同丙酸含量測(cè)試結(jié)果，方法的重復(fù)性≤10%，再現(xiàn)性≤15%，方法精密度滿足要求。

2.6 方法的應(yīng)用

從市場(chǎng)上抽取添加商品名為“露保西鹽”的防霉劑飼料樣品若干，利用上述方法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果見表4。

表4 商品飼料中丙酸的測(cè)定結(jié)果

“露保西鹽”主要成分是丙酸鈣，其標(biāo)簽中注明丙酸含量為60%左右，從表4的結(jié)果可以看出，檢測(cè)值與標(biāo)簽值測(cè)定結(jié)果在誤差范圍內(nèi)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)為飼料中丙酸的測(cè)定提供了一種新的思路，通過對(duì)前處理?xiàng)l件和色譜柱的優(yōu)化，達(dá)到了操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏度高的目的，具有一定的實(shí)用推廣價(jià)值。