劉靜冰，李靈常，余佳霖，魏國利，姜子瑜，霍介格

（南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結合醫(yī)院腫瘤科，南京 210028）

結直腸癌是我國發(fā)病率和病死率位居第一的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴重威脅居民生命安全。手術、放療、化療和靶向治療是結直腸癌的重要治療手段，中醫(yī)藥在其綜合治療中發(fā)揮著日益重要的作用。復方腸泰系南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結合醫(yī)院腫瘤科治療結腸癌的經(jīng)驗方，已制成院內(nèi)制劑應用于臨床。臨床研究表明[1]：復方腸泰聯(lián)合化療顯著改善腸癌患者臨床癥狀，提高生活質(zhì)量，降低癌胚抗原（CEA）和糖類抗原19-9（CA19-9）水平，提高T 淋巴細胞分型為代表的多項免疫指標，降低白細胞減少發(fā)生率，起到減毒增效作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）模型中，復方腸泰具有顯著抗新生血管生成作用[2]，故本研究以CT26.WT 結腸癌細胞小鼠移植瘤為研究對象，觀察其對結腸癌新生血管生成的影響，并初步探討其作用機制。

1 實驗材料

小鼠結腸癌細胞（CT.26WT）：貨號C3005，上海冠導生物有限公司。雌性ICR 小鼠：代碼201，18 ～20 g，上海斯萊克實驗動物有限責任公司。無血清培養(yǎng)基（SFM）：貨號17705-021，品牌Gibco，規(guī)格500 mL，南京信帆生物。BCA 蛋白定量試劑盒：產(chǎn)品貨號KTD3001，品牌Abbkine，武漢艾美捷科技有限公司。Promega M-MLV 逆轉錄酶：貨號M1701，品 牌 普 洛 麥 格。SYBR? Premix Ex TaqTM ：貨 號DRR081A，品牌TaKaRa。VEGFR2、AKT、p-AKT、HIF-1α 和GAPDH 一抗：貨號分別為#9698、#4691、#4060、#36169 和#5174，品牌Cell signaling。Antirabbit IgG，HRP-linked Antibod 二抗：貨號#7074，品牌Cell signaling。復方腸泰處方：人參10 g，黃芪15 g，藤梨根15 g，薏苡仁20 g，苦參6 g，八月札10 g。加10 倍體積水浸泡30 min 后煮2 h，藥渣加8 倍水再煮2 h，煎煮液100 目篩網(wǎng)過濾，冷卻后2 次濾液經(jīng)蒸發(fā)儀濃縮至220 mL，作為飲片水煎液，生藥濃度2.50 g/mL。加入PBS 于離心機10 000 r/min 離心10 min后取上清液，根據(jù)不同濃度需要加入一定量的PBS 稀釋，使用濾器過濾除菌，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 實驗方法

2.1 建立小鼠結腸癌模型及分組 將小鼠結腸癌細胞CT26.WT 從液氮儲存罐中復蘇后，37 ℃下溶解，于RPMI 1640 培養(yǎng)基（含10 %的胎牛血清、100 U/mL 的青霉素和100 U/mL 的鏈霉素）中穩(wěn)定生長。按2 ×107/mL 的濃度在20 只ICR 小鼠皮下注射0.2 mL 細胞懸液，構建小鼠結腸癌模型。待瘤體生長至100 mm3～150 mm3隨機分組，共分4 組，每組5 只。參考課題組既往實驗數(shù)據(jù)[3]，對照組用生理鹽水灌胃，低劑量組復方腸泰13.90 g/kg 灌胃，中劑量組復方腸泰27.80 g/kg 灌胃，高劑量組復方腸泰55.60 g/kg 灌胃。

2.2 測量轉移瘤體積變化 生理鹽水將復方腸泰稀釋成不同濃度，小鼠每天灌胃1 次，每次0.2 mL，持續(xù)給藥13 d。給藥開始計為d 1，隔日記錄各組小鼠移植瘤體積，先測量腫瘤體積再給藥。腫瘤體積計算公式：V = 長徑 × 短徑2 /2。小鼠連續(xù)灌胃13 d 后處死，完整剝離腫瘤組織。

2.3 免疫組化檢測轉移瘤微血管密度（microvessel density, MVD） 小鼠腫瘤組織制片后使用CD34 抗體標記血管內(nèi)皮，反映MVD。MVD 測定參照Weidner的微血管計數(shù)方法：首先于低倍鏡（× 40）下觀察全部視野，選擇3 個高密度的血管組織的“熱點”區(qū)，即棕黃染色密度最高的區(qū)域；然后在高倍鏡（× 400）下雙盲法計數(shù)微血管。呈現(xiàn)單個或聚集在一起的數(shù)個被染為棕黃色或棕褐色的內(nèi)皮細胞，獨立于鄰近的微血管、腫瘤細胞或其他結締組織，作為1個微血管計數(shù)，計數(shù)3 個視野，取其均值作為MVD。管腔大于8 個紅細胞直徑或管壁帶有肌層的大血管不作為新生血管計數(shù)。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清VEGF、CD44v6 和MMP-2 的濃度 小鼠尾靜脈取血，使用ELISA 檢測試劑盒檢測小鼠血清內(nèi)皮生長因子（VEGF）、細胞表面分化抗原44v6（CD44v6）和金屬基質(zhì)蛋白酶-2（MMP-2）濃度。

2.5 聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測腫瘤組織VEGFR2和HIF-1α mRNA 的轉錄水平 使用TRIzol 試劑提取小鼠瘤組織中的總RNA，設計上下游引物擴增（引物序列見表1），取2 μg RNA 運用Promega MMLV 逆轉錄酶及相關試劑進行逆轉錄反應，反應體系為20 μL。取0.5 μL RT產(chǎn)物運用SYBR?Premix Ex TaqTM（TaKaRa）進行RT-PCR 反應。反應條件如下：PCR 程序設置為：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 60 s，72 ℃ 40 s 共40 個循環(huán)。GADPH 作為內(nèi)參，用2-△△Ct法測定RNA 含量。

表1 目標基因的引物序列

2.6 蛋 白 印 跡（Western Blot） 檢 測 腫 瘤 組 織VEGFR2、HIF-1α、AKT 和p-AKT 的表達 皮下移植瘤標本用PBS 洗滌后，使用超聲粉碎機粉碎，于6 000 r/min 離心5 min 后提取蛋白，BCA 蛋白分析試劑盒測定蛋白含量。SDS-PAGE 凝膠電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶中封閉50 min。加入一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌3 次后，室溫加入二抗孵育50 min。使用ECL 發(fā)光劑與膜反應曝光，掃描捕捉蛋白條帶。

2.7 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用ANOVA 分析。

3 結果

3.1 復方腸泰抑制小鼠移植瘤生長 小鼠予不同劑量復方腸泰灌胃。對照組小鼠瘤體增長迅速，復方腸泰組瘤體增長緩慢，且劑量越高增長越緩慢，呈劑量依賴性（圖1）。小鼠給藥結束后處死，剝離腫瘤，復方腸泰劑量越高，小鼠腫瘤體積越?。▓D2）。

圖2 各組小鼠移植瘤剝離后體積

3.2 復方腸泰降低結腸癌組織MVD MVD 是評價腫瘤血管生成的公認指標，通過免疫組化CD34 染色，可以看到對照組染色最深，復方腸泰組不同程度染色減少，且劑量越高CD34 染色越少（圖3）。說明復方腸泰具有抑制小鼠結腸癌血管生成的作用，且該抑制作用具有劑量依賴性。

圖 1 小鼠移植瘤體積變化曲線

圖3 小鼠移植瘤CD34 免疫組化染色強度

3.3 復方腸泰降低小鼠血清VEGF、CD44v6 和MMP-2 表達 與對照組相比，隨著復方腸泰劑量增加，小鼠血清VEGF、CD44v6 和MMP-2 水平逐漸降低（見表2）。復方腸泰可抑制小鼠血清中VEGF、CD44v6和MMP-2 的表達，抑制作用與劑量有關。

表2 小鼠移植瘤VEGF、CD44v6 和MMP-2 表達 μg/L

3.4 復方腸泰抑制小鼠移植瘤VEGFR2 和HIF-1α mRNA 的轉錄 經(jīng)復方腸泰處理后，小鼠移植瘤中血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR2）和缺氧誘導因子1α（HIF-1α）的mRNA 轉錄水平較對照組均不同程度降低，并呈劑量依賴性關系（見圖4）。

圖4 小鼠移植瘤VEGFR2 和HIF-1α mRNA 水平

3.5 復方腸泰抑制小鼠移植瘤VEGFR2、HIF-1α 和p-AKT 蛋白表達 復方腸泰抑制小鼠移植瘤中VEGFR2、HIF-1α 和p-AKT 蛋白的表達，p-AKT/AKT比值顯著下降，且呈現(xiàn)劑量依賴性（見圖5）。

圖5 小鼠移植瘤VEGFR2、HIF-1α、AKT 和p-AKT 蛋白的表達

4 討論

早在1971 年，哈佛大學醫(yī)學院Folkman 教授首次提出了腫瘤生長依賴于血管生成的觀點[4]，認為腫瘤細胞通過分泌促血管因子，刺激腫瘤產(chǎn)生新生血管，為腫瘤生長供應血液和營養(yǎng)，隨后腫瘤血管新生被認為是腫瘤十大惡性生物學行為之一[5]?！翱鼓[瘤血管生成”已成為晚期惡性腫瘤的重要治療策略，在晚期結直腸癌中尤為重要。一項在晚期結直腸癌患者中比較IFL 化療方案聯(lián)合貝伐珠單抗和單用化療的臨床研究發(fā)現(xiàn)[6]，聯(lián)合組較對照組取得了4.7 個月的生存獲益（20.3 m vs. 15.6 m），抗血管生成藥物也已寫入中國、美國、歐洲等眾多國家和地區(qū)的結直腸癌診療指南中。

現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，很多中藥復方、中藥單體以及中藥注射劑也具有抗腫瘤新生血管生成的作用?；钛鲱惖奶壹t四物湯、血府逐瘀湯，軟堅散結類的鱉甲煎丸等，均通過抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）發(fā)揮抗腫瘤血管生成的作用[7]。中藥單體的研究則更為廣泛而深入。黃芩提取物燈盞花乙素可下調(diào)VEGF，從而抑制腫瘤血管生成，其機制可能與抑制AKT 磷酸化有關[8]。人參皂苷Rg3 在體外和體內(nèi)均有顯著抗血管生成作用，可以抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）的遷移、黏附和小管的形成[9]；Rg3 聯(lián)合索拉非尼可抑制小鼠肝移植瘤生長，其機制可能與調(diào)控血管生成相關因子HIF-1α、VEGF 和VEGFR2 相關[10]。復方腸泰組方包括人參、薏苡仁、白花蛇舌草、莪術、八月札和藤梨根六味中藥，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，復方腸泰對HUVEC 的遷移、增殖和小管形成具有抑制作用，體內(nèi)抑制小鼠matrigel 栓形成，因此推測其對腫瘤組織應該也有抗血管生成作用[2]。

本研究中復方腸泰顯著抑制小鼠皮下移植瘤的生長，降低了腫瘤組織的微血管密度。進一步檢測相關細胞因子和蛋白表達，復方腸泰抑制結腸癌移植瘤小鼠血清中VEGF、CD44v6 和MMP-2 水平，下調(diào)移植瘤中VEGFR2 和HIF-1α 的mRNA 轉錄，抑制移植瘤中VEGFR2、HIF-1α 和p-AKT 蛋白的表達。VEGF 在血管的新生和發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，是關鍵的促血管生成因子，參與了腫瘤的發(fā)展、侵襲和轉移，是結腸癌的重要不良預后因子[11]。MMP-2 和CD44v6與腫瘤細胞的黏附、遷移、侵襲密切相關，MMP-2 水平的升高促進了結腸癌細胞的轉移[12]，CD44v6 在結腸癌組織中高表達且與不良預后相關[13]。HIF-1α 是缺氧環(huán)境下細胞活動的重要調(diào)控因子，缺氧時HIF-1α 被激活，它不僅使VEGF mRNA 穩(wěn)定性增加，而且增加VEGF 的轉錄活性，刺激新生血管生成[14]。AKT 信號通路與結腸癌新生血管生成密切有關，AKT 失活可以抑制結腸癌新生血管的生成，磷酸化的AKT 蛋白p-AKT 是其主要活性形式[15]。

綜上所述，本研究結果表明，復方腸泰可以抑制小鼠結腸癌移植瘤的血管生成，下調(diào)VEGF、CD44v6和MMP-2 等與血管生成相關細胞因子的表達，其作用機制可能與抑制HIF-1α 的表達和AKT 蛋白的磷酸化有關。