徐英杰，尹羽薇，趙海燕*，付新，董清平，孫羽佳，張宇馳

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生為主要病理特征的慢性骨關(guān)節(jié)疾病，本病沒(méi)有明顯的種族和地域差異，在超過(guò)50歲以上人群中，僅次于心血管疾病排名第二[1]。本病是老年人膝關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)不便的主要原因之一，隨著社會(huì)老齡化進(jìn)程不斷加劇，本病的發(fā)病率及發(fā)病絕對(duì)人數(shù)與日俱增[2]。在前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)中藥貼膜能夠有效治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的基礎(chǔ)上[3]，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化和Western blot兩種方法，檢測(cè)運(yùn)用不同方法治療兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型后關(guān)節(jié)軟骨下骨BMP-2含量表達(dá)的變化，以期進(jìn)一步揭示中藥貼膜干預(yù)膝骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)退變的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年新西蘭兔50只，3～4月齡，體質(zhì)量2.5～3 kg，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK黑2015-003。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

中藥貼膜主要成分為元胡、川芎、骨碎補(bǔ)、續(xù)斷、冰片等，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心在原中藥超微粉[4]基礎(chǔ)上制備而成。玻璃酸鈉注射液：上海景峰制藥股份有限公司生產(chǎn)(國(guó)藥準(zhǔn)字 H20000643)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型制備

將白兔普通飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境，并經(jīng)過(guò)一般觀察無(wú)異常后，采用Hulht法，建立兔右膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型[5]。

1.3.2 動(dòng)物分組及給藥方法

將造模成功的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為中藥貼膜組、玻璃酸鈉組、傳統(tǒng)中藥組、模型對(duì)照組，每組10只，另取10只健康白兔作為空白對(duì)照組。按照分組采用如下方法治療：①空白對(duì)照組給予正常飼養(yǎng)不做治療；②中藥貼膜組給予中藥貼膜外敷治療，1次/日，12 h/次，共治療6周；③玻璃酸鈉組于術(shù)后1周開(kāi)始行右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)玻璃酸鈉注射治療，劑量為0.25 mL/次，1次/周，連續(xù)治療5周；④傳統(tǒng)中藥組采用普通粉碎方法粉碎中藥(藥物組成與中藥貼膜組相同)加入促透劑外敷治療，1次/日，12 h/次，共治療6周；⑤模型組給予醫(yī)用橡皮膏外敷治療，1次/日，12 h/次，共治療6周。

1.3.3 免疫組化觀察關(guān)節(jié)軟骨下骨中 BMP-2含量

治療結(jié)束后，所有動(dòng)物采用空氣栓塞法處死，無(wú)菌條件下取股骨內(nèi)側(cè)切口打開(kāi)膝關(guān)節(jié)腔，切取右膝關(guān)節(jié)上下各1cm 厚軟骨下骨質(zhì)的標(biāo)本。采用免疫組織化學(xué)法觀察各組標(biāo)本關(guān)節(jié)軟骨下骨中BMP-2，具體操作步驟如下：①石蠟切片常規(guī)脫水，二甲苯脫蠟，酒精梯度水化；②3% H2O2去離子水孵育5～10 min；③PBS 2 min內(nèi)3次沖洗；④滴加一抗，37 ℃孵育1～2 h，PBS 2 min內(nèi)3次沖洗；⑤按照一抗的來(lái)源，分別滴加BMP-2血清單克隆抗體，37 ℃孵育30 min，PBS 2 min內(nèi)3次沖洗；⑥D(zhuǎn)AB染色，蒸餾水充分沖洗；⑦酒精脫水,二甲苯透明，封片劑封片。

1.3.4 Western blot測(cè)定關(guān)節(jié)軟骨下骨中 BMP-2含量表達(dá)

將各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物右膝關(guān)節(jié)軟骨下骨組織取出后迅速放入液氮中冷凍，按以下步驟操作：

①提取組織總蛋白:解凍標(biāo)本，放入研缽，將其研碎。將研碎的骨組織放入勻漿器中，按照每20 mg組織加入100 μL RIPA裂解液。RIPA裂解液在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使其終濃度為1 mmol/L。在冰上勻漿，直至充分裂解。充分裂解后，4 ℃，14 000 r/min離心5 min，取上清保存于-70 ℃冰箱中。②蛋白質(zhì)的定量:加2 μL超純水于超微量紫外分光光度儀上，進(jìn)行調(diào)零。擦去超純水，加提取的蛋白質(zhì)樣品取2 μL，測(cè)出蛋白質(zhì)濃度。③蛋白質(zhì)電泳:配置10%分離膠。沿玻片用吸管加入模具中，等待凝膠聚合。加濃縮膠于分離膠之上，待濃縮膠聚合約30 min后，放置在電泳槽內(nèi)，加入電泳液。按照4∶1比例(加樣緩沖液)混合樣品，在100 ℃條件下加熱約10 min，短暫離心。連接電源，100 V約90 min，至溴酚蘭到達(dá)分離膠底部。卸下玻板，小心撬開(kāi)玻板，取出凝膠。④轉(zhuǎn)印:浸潤(rùn)PVDF膜，切比PVDF膜略小的濾紙40張，潤(rùn)濕濾紙，移開(kāi)轉(zhuǎn)移裝置安全蓋和陰極，按順序鋪潤(rùn)濕濾紙20張，鋪PVDF膜，鋪凝膠，鋪潤(rùn)濕濾紙20張，放置好陰極，安裝轉(zhuǎn)印裝置，連好連接線，打開(kāi)電源，25 V轉(zhuǎn)印2.5～3 h，轉(zhuǎn)膜后小心取出PVDF膜。⑤免疫檢測(cè):在放有轉(zhuǎn)印后PVDF膜的表面皿中加封閉液，液面必須過(guò)膜，搖床上輕搖60 min，棄去封閉液，TBST洗膜3次，每次5 min，棄去TBST，搖床上溫和搖動(dòng)2 h后，4 ℃過(guò)夜，棄去一抗，TBST洗3次，每次5 min，棄去TBST，將膜放入一個(gè)可封口的塑料袋中加二抗，搖床上溫和搖動(dòng)4 h，棄去二抗，TBST洗3次，共30 min，按照DAB顯色試劑盒說(shuō)明配置好顯色液，將PVDF膜放入顯色液中顯色，待條帶顯色清晰后用蒸餾水終止反應(yīng)。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

免疫組化結(jié)果參照前期實(shí)驗(yàn)所用的形態(tài)計(jì)量學(xué)研究方法研究[6]，BMP-2的表達(dá)量用細(xì)胞分?jǐn)?shù)表示。蛋白印跡結(jié)果用凝膠成像分析系統(tǒng)取圖，并分析密度，結(jié)果以目標(biāo)條帶的密度與內(nèi)參條帶的密度之比表示。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 免疫組化測(cè)定兔膝關(guān)節(jié)軟骨下骨BMP-2表達(dá)結(jié)果

表1 免疫組化測(cè)定兔膝關(guān)節(jié)軟骨下骨BMP-2表達(dá)結(jié)果

結(jié)果顯示，空白對(duì)照組膝關(guān)節(jié)軟骨下骨中BMP-2表達(dá)較高，模型組膝關(guān)節(jié)軟骨下骨中BMP-2表達(dá)明顯減低，與空白對(duì)照組性比較，P<0.01。玻璃酸鈉組BMP-2表達(dá)較模型組高(P<0.01)，但低于傳統(tǒng)中藥組和中藥貼膜組(P<0.01)。中藥貼膜組BMP-2表達(dá)量在各治療組中相對(duì)最高，與空白對(duì)照組接近。

2.2 Western blot測(cè)定兔膝關(guān)節(jié)軟骨下骨BMP-2蛋白表達(dá)結(jié)果

表2 Western blot測(cè)定兔膝關(guān)節(jié)軟骨下骨BMP-2蛋白表達(dá)結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組BMP-2蛋白表達(dá)量在各組中最高，模型組BMP-2蛋白表達(dá)量較空白對(duì)照組明顯降低(P<0.01)，為空白對(duì)照組的0.29倍，玻璃酸組BMP-2蛋白表達(dá)量為空白對(duì)照組的0.42倍，較模型組增高(P<0.01)。傳統(tǒng)中藥組及中藥貼膜組BMP-2蛋白表達(dá)量均較玻璃酸鈉組高(P<0.05)。

3 討論

中藥貼膜由骨碎補(bǔ)、續(xù)斷、元胡、川芎、冰片等各等分組成。方中以骨碎補(bǔ)為君，活血續(xù)傷，補(bǔ)腎強(qiáng)骨，《開(kāi)寶本草》謂其“主破血止血，補(bǔ)傷折”。續(xù)斷補(bǔ)腎強(qiáng)筋，療傷續(xù)折為臣藥，以助骨碎補(bǔ)補(bǔ)腎續(xù)傷之力?！侗静輩R言》曰：“續(xù)斷，補(bǔ)續(xù)血脈之藥也。大抵所斷之血脈非此不續(xù)；所傷之筋骨非此不養(yǎng)；所滯之關(guān)節(jié)非此不利”。元胡活血，行氣，止痛?！侗静菥V目》言元胡“能行血中氣滯，氣中血滯，故專(zhuān)治一身上下諸痛”；川芎活血行氣，祛風(fēng)止痛?！侗静輩R言》曰:“川芎味辛性陽(yáng)，氣善走竄而無(wú)陰凝粘滯之態(tài)，隨入血分，有能去一切風(fēng)，調(diào)一切氣之功”；冰片開(kāi)竅通絡(luò)，《醫(yī)林纂要》曰“能透骨熱”，“亦能生肌止痛”。以上3味共為佐藥。方中諸藥合用，共奏補(bǔ)腎通絡(luò)，續(xù)筋強(qiáng)骨，祛風(fēng)活血之功。

現(xiàn)代研究證實(shí)延胡索提取物中延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丑素都有明顯的止痛作用[7]；川芎提取物中川芎嗪可促進(jìn)骨折患者的骨折愈合和血腫的吸收[8]；骨碎補(bǔ)提取物中主要成分柚皮苷在骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型治療過(guò)程中，具有抑制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡作用[9]；續(xù)斷皂苷為續(xù)斷提取物，其中含有使骨損傷愈合作用的活性組分，具有促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的作用，從而起到增強(qiáng)骨痂形成，改善骨小梁局部微觀結(jié)構(gòu)，促進(jìn)骨形成的作用[10]；冰片為近乎純粹的右旋龍腦具有良好的抗炎和透皮吸收作用[11]。

關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨在骨性關(guān)節(jié)炎病變過(guò)程中存在既相互獨(dú)立，又相互作用的關(guān)系。治療骨性關(guān)節(jié)炎時(shí)即要注重關(guān)節(jié)軟骨退變，同時(shí)也應(yīng)該預(yù)防軟骨下骨的發(fā)病，調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨與軟骨下骨的相互生物力學(xué)作用機(jī)制，糾正關(guān)節(jié)軟骨的整體生物化學(xué)環(huán)境和代謝條件。RADIN等[12]認(rèn)為，軟骨下骨異常在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的引發(fā)重要作用，較薄的關(guān)節(jié)軟骨層使其不能再分散下肢所受的應(yīng)力，能量的沖擊負(fù)荷應(yīng)力致使軟骨下骨骨小梁發(fā)生微骨折。這些骨折的修復(fù)繼而會(huì)導(dǎo)致骨硬度的增加，致使關(guān)節(jié)局部吸收肢體傳導(dǎo)沖擊能力的減弱，關(guān)節(jié)軟骨表面暴露的應(yīng)力增大。FLOREA等[13]通過(guò)建立兔骨性關(guān)節(jié)炎模型并通過(guò)CT評(píng)估造模成功后膝關(guān)節(jié)軟骨下骨結(jié)構(gòu)改變，發(fā)現(xiàn)骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型軟骨下骨變薄，骨小梁數(shù)量減少，蛋白聚合含量降低。

目前軟骨下骨與骨性關(guān)節(jié)炎的微觀結(jié)構(gòu)變化的詳細(xì)發(fā)病機(jī)制雖然還沒(méi)有完全明確，但因?yàn)檐浌窍鹿桥c關(guān)節(jié)軟骨之間的密切解剖關(guān)系，決定了關(guān)節(jié)的軟骨下骨在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程中起重要作用。研究顯示發(fā)生骨性關(guān)節(jié)炎病理改變時(shí)，軟骨下骨處于高轉(zhuǎn)化狀態(tài)、局部代謝加強(qiáng)、局部骨質(zhì)疏松形成，極易發(fā)生軟骨下骨微損傷，且微損傷的修復(fù)作用降低，關(guān)節(jié)異常負(fù)荷使軟骨下骨發(fā)生形變以緩沖所增加的應(yīng)力，同時(shí)亦導(dǎo)致骨小梁微細(xì)骨折。反復(fù)微損傷啟動(dòng)骨重塑過(guò)程加快，最終導(dǎo)致的軟骨下骨增厚和密度增高，軟骨下骨質(zhì)變硬，使軟骨和軟骨下骨硬度差增大，此時(shí)局部外力作用異常會(huì)使關(guān)節(jié)軟骨所受的應(yīng)力作用變大，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變[14]。因此，調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨下骨的代謝速度，改善軟骨下骨的病變，應(yīng)納為治療骨性關(guān)節(jié)炎的重要目標(biāo)，并可能成為治療骨性關(guān)節(jié)炎的新的途徑。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨下骨中BMP-2蛋白表達(dá)含量明顯降低，成為早期骨性關(guān)節(jié)炎軟骨下骨生成能力下降的原因，軟骨下骨新骨生成能力下降導(dǎo)致早期骨性關(guān)節(jié)炎軟骨下骨的局限性骨質(zhì)疏松，增大了關(guān)節(jié)軟骨的負(fù)荷應(yīng)力，從而加重了關(guān)節(jié)軟骨的退變。各治療組經(jīng)過(guò)治療后，都在提高關(guān)節(jié)軟骨下骨BMP-2蛋白表達(dá)起到了一定的作用，其中臨床常用的玻璃酸鈉對(duì)關(guān)節(jié)軟骨下骨BMP-2生成能力雖有一定的提高，但低于傳統(tǒng)中藥組和中藥貼膜組，表明我們所采用的中藥組方在促進(jìn)軟骨下骨新骨生成能力優(yōu)于玻璃酸鈉。中藥貼膜組促進(jìn)BMP-2能力較傳統(tǒng)中藥組強(qiáng)，證實(shí)應(yīng)用提取的中藥成分制備成貼膜后，可以對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨下骨退變干預(yù)作用起到更好的效果。因此，中藥貼膜在早期骨性關(guān)節(jié)炎治療過(guò)程中，對(duì)提高關(guān)節(jié)軟骨下骨BMP-2表達(dá)起到良好的干預(yù)作用，在避免早期骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨下骨退變起到積極作用，繼而從另一方面達(dá)到對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用。