張 璋，林 勇，蘇成豪*

(1.廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，福建 廈門 361102；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院，福建 廈門 361015；3.廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院，福建 廈門 361004)

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是肝硬化和肝癌的主要危險(xiǎn)因素.有研究表明乙肝表面抗原(HBsAg)陽(yáng)性者的肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著高于陰性者[1].據(jù)估計(jì)全球約有2.4億慢性HBV感染患者，死亡人數(shù)每年超過(guò)68.6萬(wàn)[2].據(jù)2019年的報(bào)道，我國(guó)HBsAg攜帶者約占總?cè)丝诘?0%，以此計(jì)算約有1.39億HBV攜帶者[3].目前沒(méi)有根除已感染患者體內(nèi)HBV的治療方法，因此仍有大量慢性HBV感染人群，并且有可能出現(xiàn)肝硬化和肝癌等嚴(yán)重并發(fā)癥，迫切需要調(diào)查影響慢性HBV感染患者疾病進(jìn)程的因素，并提供及時(shí)的干預(yù)措施以減少嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生.

以往研究表明，HBV和宿主免疫均與慢性HBV感染后的進(jìn)程和結(jié)局有關(guān)[4-6].一項(xiàng)在中國(guó)漢族人群中進(jìn)行的病例對(duì)照研究顯示，白細(xì)胞介素-10(IL-10)基因多態(tài)性對(duì)感染HBV的風(fēng)險(xiǎn)有顯著影響[7].IL-10可以通過(guò)抑制T淋巴細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞等介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，抑制促炎因子mRNA的表達(dá)，從而抑制促炎因子的合成和釋放，維持體內(nèi)免疫反應(yīng)與炎性反應(yīng)平衡[8].IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)域存在單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)，能改變IL-10基因的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而影響IL-10的合成及分泌.大量研究表明IL-10基因多態(tài)性與多種肝臟疾病相關(guān)，如慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、酒精性肝炎等免疫性肝損傷及部分藥物性肝損傷[9-12]；但I(xiàn)L-10基因多態(tài)性是否與慢性HBV感染后的疾病進(jìn)程相關(guān)有待進(jìn)一步研究.

本研究基于212名劃分為輕度肝炎組(對(duì)照組，151例)和中、重度肝炎組(病例組，61例)的HBV感染者，選取IL-10基因中被研究最多的3個(gè)SNP位點(diǎn)rs1800871、rs1800872和rs1800896[13]進(jìn)行基因分型，分析IL-10基因多態(tài)性與慢性HBV感染后炎癥程度的相關(guān)性，以期從基因?qū)用嫣剿鱄BV感染者疾病的進(jìn)程，為開(kāi)展HBV高危人群的預(yù)防和健康促進(jìn)工作提供科學(xué)理論依據(jù).

1 資料與方法

1.1 資料與數(shù)據(jù)收集

本研究在廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院選取212名慢性HBV感染患者.為排除以往抗病毒治療等因素引起的混雜效應(yīng)，研究對(duì)象的納入標(biāo)準(zhǔn)為患者年齡20～79歲，HBV DNA含量≥107拷貝/mL，既往沒(méi)有抗病毒治療史；排除標(biāo)準(zhǔn)為患者拒絕參與或接受過(guò)抗病毒治療，合并感染丙型肝炎病毒或人類免疫缺陷病毒[14].通過(guò)對(duì)患者肝穿刺活檢，結(jié)合國(guó)際常用的Metavir系統(tǒng)[15]進(jìn)行肝組織纖維化分期和炎癥分級(jí)：將肝組織炎癥活動(dòng)度評(píng)分為A0～A1的患者定義為輕度慢性肝炎患者，作為對(duì)照組；將評(píng)分為A2～A3的患者定義為中度至重度慢性肝炎患者，由于病例數(shù)較少，合并作為病例組.本研究的所有程序均符合《赫爾辛基宣言》要求且患者均已簽署知情同意書.通過(guò)面對(duì)面采訪的方式收集患者的性別、年齡和肝炎家族史等信息，通過(guò)醫(yī)院信息系統(tǒng)查閱電子病例，收集有關(guān)HBV感染的信息.倫理審批號(hào)：xmzsyyky倫審第(2018009)號(hào).

1.2 基因型檢測(cè)

在入選患者進(jìn)入研究當(dāng)日收集其靜脈血樣，并將血液樣品以4 000 r/min離心10 min，分離血清和血細(xì)胞，-78 ℃下儲(chǔ)存.采用Magna Pure LC 2.0試劑盒(德國(guó)Roche Applied Science公司)從血細(xì)胞樣品中提取基因組DNA.利用基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)IL-10基因的3個(gè)SNP位點(diǎn)rs1800871、rs1800872和rs1800896進(jìn)行基因分型，正/反向(F/R)引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1.所有程序嚴(yán)格按照用戶手冊(cè)(Sequenom，美國(guó))進(jìn)行.在基因分型測(cè)定過(guò)程中，采用陰性對(duì)照和參考DNA作為質(zhì)量控制措施.此外，隨機(jī)選擇約5%的樣本重復(fù)進(jìn)行基因分型，作為實(shí)驗(yàn)重復(fù)對(duì)照.根據(jù)平臺(tái)的結(jié)果，基因分型率為100%.

表1 3個(gè)SNP位點(diǎn)的引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 HBV相關(guān)的一般特征

運(yùn)用Metavir系統(tǒng)對(duì)212名研究對(duì)象的肝組織炎癥活動(dòng)度進(jìn)行評(píng)分，并根據(jù)評(píng)分結(jié)果將研究對(duì)象分為對(duì)照組(n=151)和病例組(n=61).HBV相關(guān)的一般特征比較分析表明(表2)：對(duì)照組與病例組在性別分布和HBV家族史上差異顯著(p<0.05)；而年齡和HBV基因型分布在兩組間差異不顯著(p>0.05).

表2 212名慢性HBV感染者的人口學(xué)特征

2.2 IL-10基因各SNP位點(diǎn)的等位基因分布

利用基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)IL-10基因的3個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，各SNP位點(diǎn)的等位基因分布頻率見(jiàn)表3：其中，rs1800871和rs1800872位點(diǎn)的等位基因頻率分布在病例組和對(duì)照組間差異顯著(p<0.05)；而rs1800896位點(diǎn)的等位基因頻率分布在兩組間差異不顯著(p>0.05).這初步說(shuō)明rs1800871和rs1800872位點(diǎn)與HBV感染后炎癥程度相關(guān)，而尚不能認(rèn)為rs1800896位點(diǎn)與炎癥程度相關(guān).

表3 IL-10基因SNP位點(diǎn)的等位基因分布

2.3 IL-10基因各SNP位點(diǎn)的基因型分布

經(jīng)檢驗(yàn)IL-10基因各SNP位點(diǎn)的基因型頻率在病例組和對(duì)照組中均符合Hardy-Weinberg平衡(p>0.05).如表4所示，rs1800871和rs1800872位點(diǎn)的各基因型在病例組和對(duì)照組間分布差異顯著(p<0.05)，rs1800896位點(diǎn)的各基因型在兩組間分布差異不顯著(p>0.05).rs1800871位點(diǎn)上，相較于基因型AA，基因型GG在HBV感染后炎癥重度化風(fēng)險(xiǎn)更高(OR為4.238，p<0.05)；基因型AG同樣提高了炎癥重度化的風(fēng)險(xiǎn)(OR為2.410，p<0.05).rs1800872位點(diǎn)上，與基因型TT相比，基因型GT和GG增加了HBV感染后炎癥重度化的風(fēng)險(xiǎn)，OR分別為2.270和3.202，差異顯著(p<0.05)；而rs1800896位點(diǎn)的各基因型分布差異不顯著(p>0.05).

表4 IL-10基因各SNP位點(diǎn)的基因型分布

2.4 IL-10基因各SNP位點(diǎn)的單倍型分析

運(yùn)用SHEsis在線遺傳分析軟件對(duì)IL-10基因位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析(頻率低于0.03的單倍型不分析其分布的差異)，結(jié)果顯示，rs1800871、rs1800872和rs1800896這3個(gè)SNP位點(diǎn)間存在連鎖不平衡(標(biāo)準(zhǔn)化后各單倍型分布頻率之間的差異D′>0.813，r>0.145).如表5所示，IL-10基因的4個(gè)單倍型A-G-T、A-T-T、G-G-T和G-T-T在病例組和對(duì)照組間的分布差異顯著(p<0.05).其中，單倍型A-G-T、G-G-T和G-T-T均可使HBV感染后炎癥重度化的風(fēng)險(xiǎn)顯著提高，OR分別為8.717，1.670和14.436(p<0.05)；而單倍型A-T-T則顯著降低了炎癥重度化的風(fēng)險(xiǎn)，OR為0.346(p<0.05).

表5 IL-10基因單倍型分布比較

2.5 3種遺傳模型下IL-10基因多態(tài)性與HBV感染發(fā)展的關(guān)聯(lián)

因本研究中3個(gè)SNP位點(diǎn)的純合子突變患者數(shù)量有限，故運(yùn)用顯性模型將純合子突變和雜合子突變歸為一組.以rs1800871為例，基因型AA為對(duì)照組，基因型AG+GG為病例組.如表6所示，病例組和對(duì)照組相比，AG+GG型和AA型的差異顯著(p<0.05)，相較于基因型AA攜帶者，基因型AG+GG攜帶者在HBV感染后炎癥重度化的風(fēng)險(xiǎn)提高(OR為2.734).在顯性、隱性和相加3種遺傳模型下比較各SNP位點(diǎn)在病例組和對(duì)照組中的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果顯示(表6)：除上述rs1800871顯性模型外，rs1800872顯性模型下，與基因型TT攜帶者相比，基因型GT+GG攜帶者在HBV感染后炎癥重度化的風(fēng)險(xiǎn)提高(OR為2.438，p<0.05)；而rs1800871隱性模型下，與基因型GG攜帶者相比，基因型AA+AG攜帶者在HBV感染后炎癥重度化的風(fēng)險(xiǎn)降低(OR為0.357，p<0.05)；其他模型在病例組和對(duì)照組間的差異均不顯著(p>0.05).

表6 顯性、隱性和相加模型下IL-10基因多態(tài)性與HBV感染的關(guān)聯(lián)

3 討論與結(jié)論

宿主免疫系統(tǒng)影響HBV感染后的轉(zhuǎn)歸，而細(xì)胞因子與機(jī)體免疫系統(tǒng)功能狀態(tài)密切相關(guān).以往研究表明，細(xì)胞因子的多態(tài)性會(huì)影響其自身mRNA的表達(dá)水平，因此細(xì)胞因子基因的SNP與多種肝炎相關(guān)疾病的分子機(jī)制密切相關(guān)[13].IL-10被認(rèn)為是一種重要的抗炎介質(zhì)及免疫抑制因子，可抑制促炎介質(zhì)的合成和活性，并與抗炎介質(zhì)有協(xié)同作用[16].

有研究顯示IL-10基因位點(diǎn)的突變會(huì)對(duì)該位點(diǎn)所在區(qū)域與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合造成影響, 從而影響mRNA的轉(zhuǎn)錄，使得IL-10基因在個(gè)體間的表達(dá)水平存在差異[17].而突變對(duì)IL-10基因表達(dá)水平產(chǎn)生的影響尚存在爭(zhēng)議：向瑜等[18]研究發(fā)現(xiàn)rs1800872位點(diǎn)上的突變基因型GG促進(jìn)IL-10基因高表達(dá)，野生基因型TT則引起其低表達(dá).王云英等[19]發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)的基因突變會(huì)顯著降低IL-10基因的表達(dá)水平.王少揚(yáng)等[20]研究發(fā)現(xiàn)，rs1800872位點(diǎn)上的野生型T等位基因與肝功能損害和激發(fā)免疫應(yīng)答反應(yīng)有一定相關(guān)性；而rs1800871位點(diǎn)上的突變型G等位基因則與免疫耐受相關(guān)，提示IL-10基因多態(tài)性可影響 HBV感染者病情發(fā)展.陳望等[21]在深圳地區(qū)進(jìn)行的一項(xiàng)IL-10基因血清表達(dá)水平及其SNP與HBV感染的研究顯示：rs1800872位點(diǎn)上的突變基因型GG和G等位基因可能是該地區(qū)的HBV易感基因，且與IL-10基因表達(dá)水平有關(guān)；rs1800871位點(diǎn)上A被G替換和rs1800872位點(diǎn)上T被G替換，可使IL-10基因在不同個(gè)體間的表達(dá)水平出現(xiàn)差異；IL-10基因的低表達(dá)可能使機(jī)體在HBV感染后炎癥程度加重，而IL-10基因的高表達(dá)可能使HBV感染出現(xiàn)持續(xù)性和慢性化.上述研究結(jié)果間存在差異可能受到研究對(duì)象族群不同和樣本量大小等因素的影響.

本研究探討了IL-10基因SNP與慢性HBV感染后轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性.研究結(jié)果顯示rs1800871和rs1800872位點(diǎn)上的等位基因和基因型在病例組和對(duì)照組間頻率分布差異顯著(p<0.05).在rs1800871位點(diǎn)上，與AA基因型攜帶者相比，AG和GG基因型攜帶者炎癥重度化的風(fēng)險(xiǎn)分別提高至2.410倍和4.238倍；在rs1800872位點(diǎn)上，與TT基因型攜帶者相比，GT和GG基因型攜帶者炎癥重度化的風(fēng)險(xiǎn)分別提高至2.270倍和3.202倍；而在rs1800896位點(diǎn)上，等位基因和基因型在兩組間頻率分布差異不顯著(p>0.05).rs1800871和rs1800872位點(diǎn)顯性模型及rs1800871位點(diǎn)隱形模型在病例組和對(duì)照組間差異均顯著(p<0.05)，AG+GG和GT+GG基因型攜帶者炎癥重度化的風(fēng)險(xiǎn)提高，而AA+AG基因型攜帶者炎癥重度化的風(fēng)險(xiǎn)則降低.A-G-T、G-G-T和G-T-T單倍型攜帶者炎癥重度化的風(fēng)險(xiǎn)分別提高至8.717倍、1.670倍和14.436倍，而A-T-T單倍型攜帶者則降低了炎癥重度化的風(fēng)險(xiǎn)(OR為0.346).

綜上所述，IL-10基因rs1800871和rs1800872位點(diǎn)的SNP與HBV感染后炎癥重度化相關(guān)，而rs1800896位點(diǎn)與炎癥轉(zhuǎn)歸尚不能證明有顯著相關(guān)性，提示IL-10基因多態(tài)性與HBV感染后臨床發(fā)展過(guò)程的相關(guān)性可作為病毒感染后臨床發(fā)展的一個(gè)預(yù)測(cè)因素.本研究樣本量有限，還需要增大樣本量進(jìn)一步深入研究；同時(shí)，將重點(diǎn)關(guān)注IL-10基因SNP對(duì)IL-10基因轉(zhuǎn)錄活性及血清表達(dá)水平的調(diào)控對(duì)乙型肝炎轉(zhuǎn)歸產(chǎn)生影響的機(jī)制.