喬紅梅，周佳文，張宜輝，李慶順*

(1.廈門大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院，濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，福建 廈門 361102;2.廈門大學(xué)嘉庚學(xué)院，河口生態(tài)安全與環(huán)境健康福建省高校重點實驗室，福建 漳州 363105)

互花米草(SpartinaalternifloraLoisel)為禾本科(Poaceae)米草屬(Spartina)的六倍體(2n=62)多年生草本植物[1]，起源于美洲大西洋沿岸和墨西哥灣的潮間帶[1]，目前已在全球范圍入侵，包括美國的太平洋沿岸、歐洲的大西洋沿岸以及亞洲的東部地區(qū)，其中中國是最大的入侵區(qū)域[1-3].1979年，南京大學(xué)的研究人員從美國佐治亞州(Georgia)的薩佩洛島(Sapelo Island)、北卡羅來納州(North Carolina)的莫爾黑德城(Morehead City)以及佛羅里達州(Florida)的坦帕灣(Tampa Bay)收集3種生態(tài)型的互花米草，分別被稱為G型、N型和F型，到我國福建省羅源灣試種，隨后人工收集種子引種到我國沿海的其他地區(qū)[1-2，4].由于其生長和繁殖速度快，很快向種植地南北兩個方向入侵，現(xiàn)已遍布于南起廣東北至遼寧的整個沿海地區(qū)，成為我國首批16種入侵物種之一[5]，極大地影響了濱海濕地的養(yǎng)殖業(yè)與生態(tài)安全.

互花米草成功入侵的重要原因之一是它的生殖方式，包括有性生殖和無性生殖兩種.無性生殖以地下的根狀莖為繁殖器官，通過分蘗的方式向外擴大種群斑塊；有性生殖所產(chǎn)生的種子，是其遠距離擴張的主要方式[1-2，4].有性生殖過程主要通過風(fēng)媒傳播，由于柱頭具有捕捉花粉的特性，花柱伸出先于花粉囊裂，所以授粉方式主要以異花傳粉和異交結(jié)實為主[6].早期入侵到美國舊金山灣的互花米草開花但結(jié)實很少甚至不結(jié)實，研究發(fā)現(xiàn)這主要是由于自交不親和，自交的胚胎因無法正常生長而敗育，尤其在對營養(yǎng)等競爭激烈的環(huán)境中，這種近交衰退程度達到最高[7].隨后互花米草和當(dāng)?shù)匚锓N葉米草發(fā)生雜交，形成了雜交種群，而這些雜交種群在初期能夠自花授粉并形成幼苗[8].Liu等[9-10]研究發(fā)現(xiàn)，入侵到中國的互花米草，其結(jié)實率在野外呈現(xiàn)隨緯度梯度變化的趨勢，即高緯度地區(qū)種群的結(jié)實率顯著高于低緯度地區(qū)種群.隨后Qiao等[11]發(fā)現(xiàn)：互花米草自引入中國后發(fā)生了種群間的遺傳混合，使得一些優(yōu)勢基因相互組合形成超級基因型，具體表現(xiàn)為不僅有很強的分蘗能力還具有很高的結(jié)實率，這些性狀在高緯度地區(qū)受到自然選擇進而形成了很強的入侵能力；不僅如此，移栽到溫室環(huán)境中的種群也表現(xiàn)出相同的趨勢，推測北方的種群可能發(fā)生了自交進化.然而導(dǎo)致結(jié)實這一性狀南北差異的影響因素目前還不得而知.

種子結(jié)實是一個受多基因調(diào)控的數(shù)量性狀.目前，有關(guān)育性基因的研究在水稻中多有報道.其中雌性不育基因PollenTubeBlocked1(PTB1)具有E3泛素化的特性，可以通過泛素化作用抑制下游對花粉管生長有抑制作用的負調(diào)控因子，促進花粉管生長，進而影響受精過程，是影響結(jié)實率的一個主效基因[12].在水稻中PTB1基因定位于第5號染色體的短臂上，實時熒光定量PCR(RT-qPCR)發(fā)現(xiàn)不同株系的結(jié)實率與該基因的表達量呈正相關(guān)，同時過表達PTB1基因會使得結(jié)實率高于野生型，證明其對結(jié)實具有重要作用[12-13].

互花米草與水稻同為禾本科植物，針對其結(jié)實率這一性狀的南北差異現(xiàn)象，提出兩個待解決的科學(xué)問題：1) 不同種群的結(jié)實率差異是否與SaPTB1的變異及表達情況有關(guān)？2) 入侵中國的互花米草是否發(fā)生了自交進化現(xiàn)象？為此，本研究選取種植于溫室的8個互花米草種群，克隆SaPTB1并進行測序，尋找單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點，同時比較該基因在不同種群的表達情況，并采取套袋實驗統(tǒng)計自交結(jié)實率.

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料準備

在2013年9月—2014年10月期間，沿中國海岸線，南北跨越2 000 km，在北緯39.05°(天津)～20.90°(廣東)的地區(qū)，按照緯度梯度從南至北采集互花米草的種子，每個緯度梯度采集一個種群，每個種群包括10個個體，共10個種群[1-2，4].為了避免采集到相同克隆斑塊的樣本，不同個體的間隔大于30 m，將種子帶回廈門大學(xué)翔安校區(qū)的同質(zhì)園(24.62° N，118.31° E)進行種植，隨后每年用根狀莖進行繁殖培育以確保植株連續(xù)生長.相同植株的根狀莖培育而來的幼苗分盆形成克隆植株，得到和原種群遺傳背景完全相同的一批克隆植株.其中克隆種群用來采集雌蕊，原種群供套袋實驗以收集種子(圖1).

圖1 實驗設(shè)計示意圖

2018年6—9月(開花季)進行雌蕊采集.為了保證樣品的一致性，每次采樣都在上午9:00—10:00進行.由于臺風(fēng)和物候等原因，10個種群中只采集到8個種群的樣品(表1)，每個種群3個個體，共24個樣品.采集好的雌蕊放置于液氮保存以供后續(xù)的RNA提取.為了檢測植株的自交結(jié)實情況，原種群于開花季將植株的花序用孔徑0.5 mm的網(wǎng)袋套住以防止異花授粉(互花米草作為風(fēng)媒傳粉的植物, 在溫室中幾乎無風(fēng)的條件下，套袋可以更加有效地減少異花授粉的概率).同年11月統(tǒng)計種子結(jié)實情況，為了保持樣品的一致性，選取和采集雌蕊相同的種群計算結(jié)實率：結(jié)實率=飽滿的種子數(shù)/種子總數(shù)×100%.

表1 互花米草樣品采集信息

1.2 定量驗證與基因型檢測

用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN)提取互花米草雌蕊的總RNA.提取的RNA分別用NanoDrop 2000(Thermo)和凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)檢測其純度和完整性.用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海麥克林生化科技有限公司)將質(zhì)檢合格的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，過程如下：RNA 600 ng，AccuRT Reaction Mix(4×) 2 μL，加焦碳酸二乙酯處理的水(DEPC H2O)至8 μL，42 ℃孵育2 min；加AccuRT Reaction Stopper(5×) 2 μL，All-In-One RT MasterMix(5×) 4 μL，無核酸酶H2O 6 μL，充分混勻；先后在25 ℃ 孵育10 min，42 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 min；放置于冰上，加入180 μL無核酸酶H2O，制成cDNA原液，將原液稀釋10倍，制成cDNA工作液.在熒光定量PCR儀(CFX96,Bio-Rad)中進行RT-qPCR，反應(yīng)體系如下：SYBR Green Mix(Roche,Switzerland)10 μL，正/反向(F/R)引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，DEPC H2O 8 μL.反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40個循環(huán)；95 ℃ 10 s.原液送至廈門閩博生物技術(shù)有限公司測序.SaPTB1的基因序列信息源于前人的研究[14]，在該基因的兩端設(shè)計引物PTB1-F/PTB1-R，內(nèi)參Tubulin基因的引物為Tubulin-F/Tubulin-R，參考Baisakh等[15]對互花米草耐鹽性基因的定量擴增實驗(表2).以上兩對引物均由賽默飛世爾科技(中國)有限公司合成.

表2 用于RT-qPCR分析的引物

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，SaPTB1的相對表達水平和結(jié)實率用種群的平均值±標準差表示，兩組數(shù)據(jù)的相關(guān)性用皮爾森(Pearson)相關(guān)系數(shù)表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)實率統(tǒng)計

實驗發(fā)現(xiàn)套袋自交的互花米草可以觀察到結(jié)實現(xiàn)象，不是絕對的“自交不親和”，但空殼比例很高，各種群的結(jié)實率都處于較低水平(圖2).最高緯度地區(qū)的東營種群結(jié)實率最高，為22.22%；最低緯度地區(qū)的雷州種群結(jié)實率次之，為8.98%；剩余6個中緯度和低緯度地區(qū)種群的結(jié)實率都很低，只有1.49%～3.08%.

云霄種群沒有收集到數(shù)據(jù).

2.2 PTB1表達情況

對24個樣品中23個樣本(有一個樣本因未得到高質(zhì)量RNA而舍棄)的SaPTB1表達情況進行RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)，該基因在8個種群中的表達水平都相對較低，相對表達水平為0.92～1.97，無顯著差異(p>0.05).東營(1.80)與雷州(1.97)種群的平均表達水平相對較高，而鹽城(1.02)、崇明(0.99)、樂清(0.96)、羅源(1.19)、云霄(1.12)和珠海(0.92)種群的平均表達水平普遍較低(圖3).相關(guān)性分析結(jié)果顯示SaPTB1的相對表達水平和結(jié)實率呈正相關(guān)，兩組數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)高達0.80(p=0.03).

圖3 互花米草SaPTB1基因在不同種群中的相對表達水平

2.3 SaPTB1單倍體劃分

對互花米草24個樣品的SaPTB1編碼序列進行雙端測序后，最終成功獲得21個樣品的數(shù)據(jù)，再用Bio-Edit軟件將正向和反向序列進行拼接獲得完整的基因序列.所有序列進行比對尋找SNP位點，再根據(jù)雙端的測序峰圖進行校正，最終獲得2個SNP位點：第1個是C/T的替換，第2個是A/G的替換，共組合成3種類型(C…A、C…G和T…G)(圖4(a))；系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示21個樣品共聚為3組，與堿基替換的分類結(jié)果一致(圖4(b)).將核酸序列翻譯成蛋白質(zhì)序列后發(fā)現(xiàn)：C/T為同義突變，堿基的替換不會改變所編碼的氨基酸，密碼子CTC和CTT均編碼亮氨酸(L)；A/G的替換會導(dǎo)致氨基酸的不同，密碼子GAC編碼天冬氨酸(D)而替換后的AAC則編碼天冬酰胺(N)(圖4(a)).把SNP位點為G，翻譯成天冬氨酸的樣品劃分為單倍型1(Haplotype 1,Hap.1)；把SNP位點為A，翻譯成天冬酰胺的樣品劃分為單倍型2(Haplotype 2,Hap.2)(圖4(c)).21個樣品中有8個(DY1、YC3、YQ1、YQ2、LY3、YX1、YX2和LZ2)為Hap.1，占總樣品的38%；剩余的13個(62%)為Hap.2(圖4(c)).對兩種單倍型的種源地進行追溯，發(fā)現(xiàn)在南北均有分布，并未呈現(xiàn)區(qū)域性變異的規(guī)律(圖4(d)).

(a)綠色和灰色表示堿基變異位點信息，括號中為相應(yīng)的氨基酸；(b)節(jié)點數(shù)值代表自展值，下方比例尺為距離標尺；(c～d)綠色和灰色表示兩種不同的單倍型，其中(d)中紅色、橙色、黃色分別表示高緯度、中緯度以及低緯度地區(qū)的種群，DY3、YQ3和ZH2沒有得到數(shù)據(jù).

3 討論與結(jié)論

互花米草中SaPTB1基因的編碼區(qū)發(fā)生了同義和非同義位點突變，這種有意義的突變意味著該基因可能受到很強的自然選擇.然而本研究中兩種單倍型沒有表現(xiàn)出像結(jié)實率那樣隨緯度梯度而變化的現(xiàn)象，說明SaPTB1基因的序列變異與結(jié)實率沒有顯著的相關(guān)性.相反，這可能是由引種歷史造成的：3種生態(tài)型同時被引種到羅源灣試種后，收集到的種子又被帶到山東、江蘇、浙江和福建省其他地區(qū)，因此3種生態(tài)型便分布到全國各地，如同本研究中的兩種單倍型的分布一樣.

SaPTB1基因在各種群的表達水平與其自交結(jié)實能力密切相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為0.80,p=0.03)，雖然SaPTB1基因的表達水平在各種群中都很低，這可能是由于在開花季節(jié)(6—9月)溫室的溫度偏高造成的，SaPTB1基因的表達受到溫度的調(diào)控，高溫會顯著抑制其表達[12].盡管如此，除了雷州種群外，高緯度地區(qū)東營種群的平均表達水平仍高于其他地區(qū)，研究結(jié)果顯示表達水平最高的這兩個種群的自交結(jié)實率也是最高的，分別為22.22%和8.98%，說明SaPTB1基因的表達水平可能對自交結(jié)實能力具有重要影響.此外，本研究發(fā)現(xiàn)位于最低緯度地區(qū)的雷州種群也具有較高的自交結(jié)實能力，其因種群面積小，處于一個競爭相對較弱的環(huán)境[3]，有利于自交結(jié)實，因此推測低緯度地區(qū)種群的結(jié)實主要得益于自交結(jié)實.在互花米草生活史特點的研究中，Davis等[16]發(fā)現(xiàn)若植物入侵初期把較多的能量投入到生殖中，會導(dǎo)致其更易死亡，生存力和生殖力間存在一定平衡.雷州種群作為一個低密度地區(qū)的種群[3]，很容易經(jīng)歷環(huán)境影響帶來的瓶頸效應(yīng)和花粉限制造成的“阿利效應(yīng)”(Allee effect)[17]，最終造成生殖失敗；而自交結(jié)實可以幫助種群突破低密度制約，從一定程度上減輕“阿利效應(yīng)”的影響，實現(xiàn)以自交結(jié)實繁殖而形成入侵斑塊[18]，這樣的繁殖策略在舊金山灣入侵的互花米草種群中取得了成功.引種到中國的互花米草在早期發(fā)生雜交后，雜交種群通過自交結(jié)實克服了“阿利效應(yīng)”.早期的生殖成功不僅保證了種群的存活，更為以后的快速入侵奠定了基礎(chǔ).本研究結(jié)果顯示SaPTB1基因在中緯度地區(qū)種群中的表達水平較低，自交結(jié)實率也是最低的，可能是由于中緯度地區(qū)的種群對空間和營養(yǎng)的競爭激烈，自交衰退嚴重[7]，結(jié)實主要來自于異交結(jié)實.而Liu等[9-10]的研究中所統(tǒng)計的結(jié)實率包括自交結(jié)實和異交結(jié)實，高緯度地區(qū)種群較高的結(jié)實率來自較高的自交和異交結(jié)實的總和，中緯度地區(qū)種群的結(jié)實率主要來自異交結(jié)實，低緯度地區(qū)種群的結(jié)實率則主要來自自交結(jié)實.互花米草是一種以異交結(jié)實為主的植物，其異交結(jié)實率遠高于自交結(jié)實，因此結(jié)實率總體呈現(xiàn)出高緯度(異交+自交)、中緯度(異交)和低緯度(自交)逐漸降低的趨勢.

綜上所述，本研究證實引種到中國的互花米草具有自交結(jié)實能力，并且SaPTB1基因發(fā)生了位點變異；同時，該基因的表達與其自交結(jié)實能力呈現(xiàn)正相關(guān)性.本研究初步探究了互花米草結(jié)實差異的內(nèi)在遺傳機制，為預(yù)防和控制互花米草入侵提供了新的理論參考.由于實驗條件的限制，種植于溫室的互花米草開花的樣本有限，今后還需要進一步開展大樣本量的分析.