和耀威，李 鵬，向 準(zhǔn)，熊 雪，楊 玲，楊彝華

(貴州省生物研究所，貴州 貴陽 550009)

0 引言

毛木耳Auriculariacornea屬木耳科木耳屬Auricularia[1]，屬于典型的白腐真菌，其有較強(qiáng)的產(chǎn)生木質(zhì)素酶的能力[2]，能夠降解較多木質(zhì)素。生長范圍廣泛，山間、田間都有分布，主要生長在闊葉樹的腐木上。毛木耳主要用來食用，入口脆而滑，涼拌食用更爽口[3]。

木質(zhì)纖維素中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量分別為40%～50%、25%～30%、20%～25%[4]。降解木質(zhì)素的主要成分有放線菌和細(xì)菌，還有真菌，其中真菌(褐腐真菌、白腐真菌等)降解能力在3種成分中最強(qiáng)[5]。木質(zhì)素所需的降解酶有漆酶，有過氧化物酶，還有錳過氧化物酶。漆酶的另一名稱為苯二醇氧化還原酶，是一種含有銅的多酚氧化酶[6]，它主要來自生漆和真菌之中。真菌漆酶屬于一種蛋白質(zhì)，能催化和氧化較多的酚類以及非酚類的化合物[7]，降解木質(zhì)素。漆酶在菌類栽培中起著重要作用，它降解培養(yǎng)基質(zhì)中的木質(zhì)素，使原基分化得到促進(jìn)，從而對(duì)子實(shí)體的形態(tài)及生長發(fā)育產(chǎn)生影響[8]。漆酶活力情況與栽培基質(zhì)細(xì)胞壁中木質(zhì)纖維素降解情況一致，降解木質(zhì)纖維素需要真菌，這也表明菌株對(duì)基質(zhì)中木質(zhì)纖維素的降解能力越強(qiáng)，產(chǎn)漆酶的能力也就越強(qiáng)。漆酶活力在食用菌栽培中扮演著重要的角色。目前為止對(duì)于毛木耳的研究，多數(shù)研究的是胞外酶活力影響因素的內(nèi)容，而對(duì)漆酶活力的研究還較少，對(duì)產(chǎn)漆酶活力影響的研究也主要是離子以及濃度[9]，復(fù)合型培養(yǎng)基，還有對(duì)誘導(dǎo)物的粒子孔徑情況等因素[10]，對(duì)于含不同木質(zhì)纖維素的栽培基質(zhì)對(duì)菌株產(chǎn)漆酶活力的研究還較少，因此本研究以毛木耳781菌株作為研究對(duì)象，探索4種栽培基質(zhì)誘導(dǎo)對(duì)其產(chǎn)漆酶能力的影響，篩選優(yōu)化出高產(chǎn)漆酶的木質(zhì)纖維素栽培基質(zhì)，從而為提高和改善毛木耳781的產(chǎn)量和品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試毛木耳781菌株，由貴州省食用菌工程技術(shù)研究中心提供。生物工程(上海)有限公司購買了Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒。

1.2 培養(yǎng)基

麥芽浸粉瓊脂培養(yǎng)基(MEA)：葡萄糖10 g、麥芽浸粉20 g、KH2PO43 g、瓊脂20 g，恒定體積至1 L，121 ℃下殺菌30 min。

基本培養(yǎng)基(BM)：葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、MgSO40.5 g、KH2PO41 g，恒定體積至1 L，121 ℃下殺菌30 min。

基本培養(yǎng)基(BM)添加木屑：葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、MgSO40.5 g、KH2PO41 g，恒定體積至1 L，加3 g孔徑為20～60目的青杠樹木屑，121 ℃下殺菌30 min。

基本培養(yǎng)基(BM)添加玉米芯：葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、MgSO40.5 g、KH2PO41 g，固定體積至1 L，加3 g孔徑為20～60目的玉米芯，121 ℃下殺菌30 min。

基本培養(yǎng)基(BM)添加棉籽殼：葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、MgSO40.5 g、KH2PO41 g，固定體積至1 L，加3 g孔徑為20～60目的棉籽殼，121 ℃下殺菌30 min。

基本培養(yǎng)基(BM)添加麥麩：葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、MgSO40.5g、KH2PO41 g，恒定體積至1 L，加3 g孔徑為20～60目的麥麩，121 ℃下殺菌30 min。

1.3 培養(yǎng)方法

將保存的毛木耳接種于固體MEA平板培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)活化8 d。在活化好的平板上，以同心圓在平板邊緣打孔，孔徑大小為5 mm，并在每100 mL基本培養(yǎng)基中接入4個(gè)菌塊，放入溫度為25 ℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，恒定轉(zhuǎn)速為150 r/min。7 d后，用勻漿機(jī)攪拌瓶中的菌絲球30 s，使其變得均勻。向分別含3 g木屑、3 g玉米芯、3 g棉籽殼和3 g麥麩的100 mL基本培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中加入3 mL攪拌均勻的均質(zhì)體，于25 ℃、150 r/min搖床避光培養(yǎng)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 ITS序列分析

用試劑盒提取、分離、純化菌株DNA，并用通用引物(ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采取25 μL的PCR反應(yīng)體系：Template(基因組20～50 ng·μL-1)0.5 μL；10×Buffer(和Mg2+)；dNTP(各2.5 mM)1 μL；Taq0.2 μL；F(10 μM)0.5 μL；R(10 μM)0.5 μL；加雙蒸水至25 μL。反應(yīng)體系在94 ℃預(yù)變性4 min，在94 ℃變性45個(gè)循環(huán)，在55 ℃退火45個(gè)循環(huán)，在72 ℃延長1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延長8 min，在4 ℃終止保存。經(jīng)擴(kuò)增之后得到的PCR產(chǎn)物再通過1.0%的瓊脂糖電泳檢測擴(kuò)增，最后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序后登陸GenBank對(duì)比，通過BLAST對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，下載最相近菌株的ITSrDNA序列，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 酶活測定

發(fā)酵液經(jīng)雙層濾紙抽濾后，并于5 ℃低溫條件下12000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。

漆酶活性測定：1 mL1 mmol/L2，2’-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)[2，2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonicacid)，ABTS]底物、1.9 mL50 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.2)和100 μL適當(dāng)稀釋的酶液，共同構(gòu)成3 mL反應(yīng)體系，在420 nm位置測定5 min范圍內(nèi)吸光值的變化。每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmolABTS所需的酶量則定義為一個(gè)活性單位。420 nm處ABTS摩爾吸光系數(shù)為3.6×104L/(mol·cm)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以上所得數(shù)據(jù)使用SPSSStatistic18.0進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的提取及ITS序列分析

實(shí)驗(yàn)樣品送往生工生物工程(上海)股份有限公司做分子鑒定檢測，經(jīng)PCR擴(kuò)增和序列測定，結(jié)果顯示毛木耳781(ITS781)的rDNAITS區(qū)段長度為607 bp，所得序列進(jìn)行Blast搜索，在Blast擊中結(jié)果中下載e值達(dá)99.8%以上的序列，包含Auriculariapolytricha、Auriculariacornea2種，均為木耳科木耳屬毛木耳[11-12]。再下載8種不同木耳屬菌株(Auriculariafuslosuccinea、Auriculariareticulata、Auriculariadeicata、Auriculariaamericana、Auriculariaheimuer、Auriculariaauricula-judae、Auricularianigricans和Auriculariavillosula)rDNA序列共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。系統(tǒng)發(fā)育樹表明，本試驗(yàn)供試菌株測序結(jié)果同毛木耳相似性高達(dá)98%以上，所以，供試菌株為毛木耳下的一個(gè)分支。

圖1 ITS 序列構(gòu)建的毛木耳系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of Auricularia cornea constructed based on ITS sequence

2.2 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)漆酶活性的影響

通過單因素方差檢驗(yàn)分析得出：毛木耳781菌株在4種培養(yǎng)基中表現(xiàn)出產(chǎn)漆酶能力不同。4種含不同木質(zhì)纖維素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)菌株漆酶活性均有顯著影響。4種不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)毛木耳781菌株漆酶活性影響極顯著(P<0.001)(表1)。

表1 4種誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)毛木耳781漆酶活力的影響(單因素方差檢驗(yàn))Tab.1 Effect of four substrates on the laccase-producing activity of Auricularia cornea 781(one-way ANOVA)

基本培養(yǎng)基(BM)加棉籽殼，在第1天就能檢測到漆酶活力，但活力很低，在4種誘導(dǎo)培養(yǎng)基中最低，為(1.94±0.82)U/L；第2天急劇上升，在第5天時(shí)達(dá)到最大漆酶活力，為(140.22±8.65)U/L(表2)，到第9天時(shí)下降到(72.33±0.39)U/L(圖2)。

表2 毛木耳781在不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基條件下的最大漆酶活力及出現(xiàn)的時(shí)間Tab.2 Maximum laccase-producing activity and appearance time of Auricularia cornea 781 in different substrates

圖2 毛木耳781在含棉籽殼的液體發(fā)酵條件下漆酶活性的變化Fig.2 Changes of laccase-producing activity of Auricularia cornea 781 in cotton seed husk substrate

基本培養(yǎng)基(BM)加麥麩，在第1天就能檢測到漆酶活性，為(2.15±0.56)U/L；第4天急劇上升，第5天時(shí)達(dá)最大漆酶活性，為(355.28±9.01)U/L(表2)，第8天急劇下降，第9天時(shí)降到(54.11±7.51)U/L(圖 3)。

圖3 毛木耳781在含麥麩的液體發(fā)酵條件下漆酶活性的變化Fig.3 Changes of laccase-producing activity of Auricularia cornea 781 in wheat bran substrate

基本培養(yǎng)基(BM)加木屑，第1天漆酶為(3.68±0.50)U/L；第3天出現(xiàn)下降，第4天急劇上升，在第5天時(shí)達(dá)到最大漆酶活性，為(62.50±1.04)U/L(表2)，第7天出現(xiàn)回升后第8天下降，到第9天時(shí)下降到(37.33±1.84)U/L(圖4)。

圖4 毛木耳781在含木屑的液體發(fā)酵條件下漆酶活性的變化Fig.4 Changes of laccase-producing activity of Auricularia cornea 781 in sawdust substrate

基本培養(yǎng)基(BM)加玉米芯，第1天就有漆酶活性，且在4種培養(yǎng)基中最高，為(26.44±0.52)U/L；第3天出現(xiàn)下降后第4天上升，在第5天時(shí)達(dá)到最大漆酶活性，為(79.94±4.13)U/L(表2)，到第9天時(shí)下降到(22.94±1.59)U/L(圖5)。

圖5 毛木耳781在含玉米芯的液體發(fā)酵條件下漆酶活性的變化Fig.5 Changes of laccase-producing activity of Auricularia cornea 781 in corncob substrate

總體而言，4種誘導(dǎo)培養(yǎng)基均能在第1天檢測到漆酶活力，第5天達(dá)到最大漆酶活力，第6天開始下降，整體活力趨勢相似。漆酶活力依次為BM+麥麩>BM+棉籽殼>BM+玉米芯>BM+木屑，基本培養(yǎng)基(BM)加麥麩漆酶活力最大，且遠(yuǎn)高于其他3種誘導(dǎo)培養(yǎng)基，基本培養(yǎng)基(BM)加木屑漆酶活力最小。在4種木質(zhì)纖維素類添加劑中相比，麥麩對(duì)毛木耳781漆酶的誘導(dǎo)作用強(qiáng)于木屑、棉籽殼和玉米芯。

3 結(jié)論與討論

隨著研究真菌和木質(zhì)纖維素兩者間關(guān)系以及真菌降解木質(zhì)纖維素情況的不斷完善，菌株產(chǎn)漆酶等酶類與不同的木質(zhì)纖維素原料的關(guān)系也已有相應(yīng)的結(jié)論，有研究表明通過對(duì)香菇、側(cè)耳的某些種進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得出含有不同的木質(zhì)纖維素基質(zhì)培養(yǎng)菌株，會(huì)對(duì)菌株錳過氧化物酶和漆酶等的產(chǎn)出產(chǎn)生影響[13]。此外有研究發(fā)現(xiàn)，擔(dān)子菌的產(chǎn)酶會(huì)受到不同的木質(zhì)纖維素材料的刺激[14]。以毛木耳781菌株為研究對(duì)象，在液體發(fā)酵過程中添加不同的木質(zhì)纖維素原料進(jìn)行誘變，連續(xù)發(fā)酵后對(duì)其漆酶活性進(jìn)行測定，同一培養(yǎng)條件下毛木耳781菌株漆酶分泌能力差異顯著(p<0.01)。所得結(jié)果與已有的研究一致。

農(nóng)林生產(chǎn)中的廢棄物在現(xiàn)實(shí)生活中較為常見，利用其進(jìn)行食用菌的栽培，一方面減少了環(huán)境的污染，另一方面為食用菌發(fā)展所用，循環(huán)利用，增加產(chǎn)業(yè)收益，助推產(chǎn)業(yè)振興。麥麩、木屑、棉籽殼和玉米芯在農(nóng)林生產(chǎn)中很有代表性，也是食用菌栽培常用添加物，4種原料的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量有一定的差距。玉米芯和棉籽殼中的半纖維素含量為31.9%和34.6%，玉米芯和棉籽殼中木質(zhì)素含量為17.3%和31.7%[15]。此外也有研究結(jié)果表明：用胡桃殼和玉米芯作為誘導(dǎo)物，通過固體發(fā)酵形式對(duì)硬毛粗毛蓋孔菌Funaliatrogii進(jìn)行產(chǎn)漆酶活力研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，兩者漆酶活力分別為2206 U/L和198 U/L，差距很大[16]。本研究中的漆酶活性為棉籽殼高于玉米芯，結(jié)果和前人研究相似。

本研究中，菌株在4種誘導(dǎo)物培養(yǎng)下產(chǎn)漆酶活力的變化規(guī)律為：前期屬于菌株初始生長期，分泌酶較少，漆酶活力較低；中期菌株進(jìn)入快速增長階段，菌絲發(fā)生量快速增長，漆酶活力逐漸增大到達(dá)最大值；后期誘導(dǎo)培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)被消耗，菌絲發(fā)生量逐漸降低，漆酶活力逐漸下降。4種誘導(dǎo)物誘導(dǎo)毛木耳781產(chǎn)漆酶活力的能力分別為：麥麩>棉籽殼>玉米芯>木屑，說明麥麩更適合作為毛木耳781菌株的木質(zhì)纖維素誘導(dǎo)基質(zhì)和栽培基質(zhì)，更有利于菌株生長、提高產(chǎn)量和改善品質(zhì)；為毛木耳品種的引種示范和規(guī)?；?biāo)準(zhǔn)化推廣奠定基礎(chǔ)。