張敏杰，李 磊，杜洪志，王先菊，陳 贇，呂 麗，吳昭會(huì)，高玉梅

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550002)

苗藥土人參為馬齒莧科植物土人參Talinumpaniculatum(Jacq.)Gaertn的根，其味甜，性熱，入冷經(jīng)。具有補(bǔ)虛健脾、潤(rùn)肺止咳、調(diào)經(jīng)之功。主治病后、產(chǎn)后虛弱，脾胃不健，月經(jīng)不調(diào)，虛熱咳嗽，無名毒瘡，自汗，盜汗，帶下等癥。貴州黔東南地區(qū)稱其為“窩阿笨(vob eb bens)”，因其無毒，運(yùn)用廣泛，為貴州苗族地區(qū)常用的特色藥材[1]。土人參主要含有多糖、黃酮、微量元素、β-谷甾醇、蔗糖[2]。此外尚含香豆素類、揮發(fā)油等[3]。其中多糖具有較好的免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、保肝、抗衰老、降血脂、抗凝血等活性[4-5]。黃酮類化合物具有較好的抗氧化作用，是良好的天然抗氧化劑[6]。在苗醫(yī)藥的使用中，將土人參作為一種天然的藥、食兼用蔬菜，可鮮用，也可蒸熟干燥備用[7]。

通過資料研究發(fā)現(xiàn)，《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2003版)收載的加工方法為：秋季采挖，洗凈，曬干或烘干；《中華本草(苗藥卷)》收載加工方法為：8、9月采，洗凈，除去細(xì)根，曬干或刮去表皮，蒸熟曬干；《貴州省中藥飲片炮制規(guī)范》(2005版)的炮制方法為：取原藥材，洗凈，除去雜質(zhì)及須根，刮除外皮，蒸透，切厚片或段，干燥；《常用中草藥匯編 原植物彩色圖鑒 下》中炮制方法為：取原藥材，除去須根、蘆頭及雜質(zhì)，洗凈，潤(rùn)透，切薄片，干燥，篩去碎屑。胡靜靜[8]等采用紫外分光光度法、苯酚-濃硫酸比色法測(cè)得土人參多糖含量為9.30%(n=3)。黃禮德等人采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲法提取土人參多糖，結(jié)果表明，超聲波強(qiáng)化提取土人參多糖省時(shí)高效[9]。植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)包括維生素C、黃酮、綠原酸等抗氧化成分和SOD等抗氧化酶系統(tǒng)，是保健和藥用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。土人參黃酮類化合物具有清除羥自由基、超氧離子自由基和抗油脂氧化的作用，其抗氧化性明顯[6]。熊漢洲[10]采用火焰原子吸收光譜法對(duì)苗藥土人參中的Fe、Cu、Zn、Mn、Li、Sr、Cd七種微量元素進(jìn)行含量測(cè)定。

綜上所述，目前尚未見土人參有關(guān)加工工藝的報(bào)道，土人參收載的炮制方法中，僅有“蒸透”“切厚片或段”“干燥”等模糊的加工工藝[11]。此外，其蒸制時(shí)間和火力、切制片型、干燥溫度等具體炮制技術(shù)參數(shù)不明確，工藝考核指標(biāo)未有規(guī)定，不能有效保證飲片的內(nèi)在質(zhì)量，從而影響臨床療效?；诖耍驹囼?yàn)采用紫外可見分光光度法、苯酚-濃硫酸法測(cè)定總多糖、亞硝酸鈉-硝酸鋁法測(cè)定總黃酮，并以總多糖、總黃酮和浸出物含量做評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交優(yōu)化試驗(yàn)優(yōu)選最佳蒸制工藝，為苗藥土人參的蒸制工藝確定技術(shù)參數(shù)，為飲片的均一性和穩(wěn)定性提供重要保證，進(jìn)一步確保臨床療效。

1 材料

1.1 儀器

UV-5900型紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；ME204E型萬分之一電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；TG16-W微量臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；SK8200LHC型超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；DK-98-Ⅱ型恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試藥

無水葡萄糖(批號(hào)：20080421，天津市巴斯夫化工有限公司)；蘆丁(批號(hào)：153-18-4，貴州迪大科技有限公司)；蒸餾水為實(shí)驗(yàn)室自制；乙醇、苯酚、濃硫酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等為分析純。土人參采自貴州省黔西南，由貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室魏升華教授鑒定為馬齒莧科植物土人參Talinumpaniculatum(Jacq.)Gaertn根。

2 方法

2.1 樣品處理

取土人參，除去地上部分，洗凈，照L9(34)正交設(shè)計(jì)蒸制處理，粉碎，過二號(hào)篩，即得。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液

精密稱取蘆丁、無水葡萄糖對(duì)照品適量， 蘆丁加70%乙醇定容至10 mL，配制成濃度為0.9889 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。無水葡萄糖加蒸餾水制成質(zhì)量濃度為1.0012 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.2 供試品溶液

精密稱取土人參粗粉0.25 g，置具塞錐形瓶中，精密加入5 mL蒸餾水，于超聲機(jī)中超聲(35 kHz，500 W)提取80 min，放冷，補(bǔ)重，以5000 r/min，離心5 min，精密吸取上清液0.2 mL 至50 mL容量瓶?jī)?nèi)，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得總多糖供試液。另精密稱取土人參粗粉0.25 g至具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇10 mL，回流提取30 min，冷卻至室溫，補(bǔ)重，濾過，得總黃酮供試液，備用。

2.2.3 顯色條件

精密吸取總多糖供試液2 mL于具塞試管中，精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入7 mL濃硫酸，混勻，置于80 ℃熱水浴10 min，取出，置于冰水浴中5 min。精密吸取3 mL總黃酮供試液至25 mL容量瓶中，精密加入5%的亞硝酸鈉0.5 mL，搖勻，放置6 min后，精密加入10%的硝酸鋁0.5 mL，搖勻，放置9 min，精密加入4%氫氧化鈉7 mL，搖勻顯色，用70%乙醇定容至刻度，搖勻靜置10 min，測(cè)定。

2.2.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

精密量取2 mL蒸餾水于具塞試管中、3 mL蒸餾水于25 mL容量瓶中，照“2.2.3”項(xiàng)進(jìn)行顯色，得總多糖、總黃酮空白對(duì)照組。取經(jīng)顯色后的對(duì)照品溶液和供試品溶液分別于200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果顯示，總多糖在488 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，總黃酮在495 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，故總多糖測(cè)定選擇488 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)；總黃酮含量測(cè)定選擇495 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2.5 總多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖適量，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解，并稀釋至刻度，即得對(duì)照品溶液。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL，分別置于50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度。按“2.2.3”項(xiàng)下方法顯色，于488 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A，以質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，得回歸方程：Y=13.131X-0.0034，r=0.9991(n=7)。線性范圍0.0100～0.0701 mg/mL具有良好的線性關(guān)系。

2.2.6 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取0 mL、0.3 mL、0.6 mL、0.9 mL、1.2 mL、1.5 mL、1.7 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于25 mL容量瓶中。按“2.2.3”項(xiàng)下方法顯色，495 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A，以質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)得回歸方程：Y=12.052X-0.0096，r=0.9999(n=7)。線性范圍0.0117～0.0700 mg/mL具有良好的線性關(guān)系。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)

精密稱取土人參粗粉0.25 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，“2.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色反應(yīng)，總多糖供試液在488 nm波長(zhǎng)處連續(xù)測(cè)定吸光度6次，RSD= 0.42%(n=6)，總黃酮供試液在495 nm波長(zhǎng)處連續(xù)測(cè)定吸光度6次，RSD= 0.76%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取土人參粗粉0.25 g，平行3份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，“2.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色反應(yīng)，總多糖供試液分別于0 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min時(shí)，在488 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，RSD=1.40%，表明供試品溶液在180 min內(nèi)穩(wěn)定?？傸S酮供試液于0 min、15 min、30 min、60 min、90 min、120 min時(shí)，在495 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，RSD=1.68%，表明供試品溶液在120 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取土人參粉末0.25 g，平行6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，“2.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色反應(yīng)，總多糖供試液在488 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，RSD=1.24%(n=6)，總黃酮供試液在495 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，RSD=1.29%(n=6)，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.4 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取土人參粉末0.125 g，平行6份，精密加入5.95 mg/mL葡萄糖對(duì)照溶液、1.31 mg/mL蘆丁對(duì)照溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，“2.2.3”項(xiàng)下進(jìn)行顯色，總多糖供試液在488 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，RSD=0.68%(n=6)，總黃酮供試液在495 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，RSD=1.24%(n=6)，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.4 提取工藝優(yōu)選

以總多糖、總黃酮為指標(biāo)，分別對(duì)提取溶劑種類、提取方法、提取溶劑濃度、提取時(shí)間、料液比進(jìn)行考察，平行3份樣，按照“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行總多糖和總黃酮的含量測(cè)定。①提取溶劑的種類：蒸餾水、70%乙醇；②提取方法：回流提取法、超聲提取法；③提取溶劑濃度：50%、60%、70%、80%、90%的乙醇；④提取時(shí)間：30 min、45 min、60 min、80 min、100 min；⑤料液比：1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60。

試驗(yàn)結(jié)果：總多糖最佳提取工藝為：蒸餾水，料液比1∶20(g ∶mL)，超聲提取80 min ；總黃酮最佳提取工藝為：70%乙醇，料液比1∶40(g ∶ mL)，回流提取45 min。

2.5 顯色條件優(yōu)選

2.5.1 總多糖顯色條件

以總多糖為指標(biāo)，分別對(duì)5%苯酚溶液用量、濃硫酸溶液用量、水浴溫度、水浴時(shí)間進(jìn)行考察，平行3份樣，按照“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行總多糖含量測(cè)定。①5%苯酚溶液用量：0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL；②濃硫酸溶液用量：5.0 mL、7.0 mL、9.0 mL、12.0 mL；③水浴溫度：20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃；④水浴時(shí)間：10 min、20 min、30 min、40 min；⑤冰水浴時(shí)間：5 min、10 min、15 min、20 min。

總多糖最佳顯色條件為：加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，加入濃硫酸溶液7.0 mL，水浴溫度為80 ℃，水浴時(shí)間為10 min，冰水浴5 min。

2.5.2 總黃酮顯色條件

以總黃酮為指標(biāo)，分別對(duì)提取溶劑種類、提取方法、提取溶劑濃度、提取時(shí)間、料液比進(jìn)行考察，平行3份樣，按照“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行總多糖和總黃酮的含量測(cè)定。①5%亞硝酸鈉溶液用量：0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL、0.7 mL、1.0 mL、1.5 mL；②10%的硝酸鋁溶液用量：0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL、0.7 mL、1.0 mL、1.5 mL；③4%氫氧化鈉溶液用量：1.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、7.0 mL、9.0 mL、10.0 mL、15.0 mL；④顯色時(shí)間：1 min、3 min、6 min、9 min、12 min、15 min、20 min；⑤靜置時(shí)間：1 min、5 min、10 min、15 min、20 min、30 min。

總黃酮最佳顯色條件為：5%的亞硝酸鈉0.5 mL搖勻，放置6 min后，精密加入10%的硝酸鋁0.5 mL，搖勻，放置9 min，精密加入4%氫氧化鈉7 mL，搖勻顯色，用70%乙醇定容至刻度，搖勻靜置10 min。

2.6 浸出物測(cè)定

按《中國(guó)藥典》2020年版第四部附錄2201浸出物測(cè)定法中的水浸出物(熱浸法)測(cè)定法和醇浸出物(熱浸法)測(cè)定法測(cè)定，每試驗(yàn)號(hào)測(cè)3次，取平均值。

2.7 水分測(cè)定

按《中國(guó)藥典》2020年版第四部通則0832水分測(cè)定法中的第二法(烘干法)測(cè)定法測(cè)定，土人參生品水分含量為7.59%，炮制品的水分含量為5.31%～6.92%。

2.8 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以蒸法炮制，選取蒸制時(shí)間、蒸制火力、切制片型和干燥溫度作為考察因素，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)考察，檢測(cè)指標(biāo)為總多糖、總黃酮和浸出物，按照“2.2”項(xiàng)和“2.4”項(xiàng)含量測(cè)定項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，因素水平見表1。對(duì)蒸土人參的炮制工藝進(jìn)行研究。

表1 因素水平表Tab.1 Factor levels

3 結(jié)果與分析

采用多指標(biāo)綜合評(píng)分法處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，以蒸制時(shí)間、蒸制火力、切制片型和干燥溫度為考察因素，總多糖、總黃酮、水溶性浸出物和醇溶性浸出物為評(píng)價(jià)指標(biāo)，給予不同的加權(quán)系數(shù)，根據(jù)各成分在藥材中的重要性，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)資料，總多糖給予0.4的加權(quán)系數(shù)，總黃酮給予0.3的加權(quán)系數(shù)，水浸出物和醇浸出物各給予0.15的加權(quán)系數(shù)，求出綜合評(píng)分值Y[12]。Yi=[各樣品總多糖含量/總多糖的最高含量]*0.4*100+[各樣品總黃酮含量/總黃酮的最高含量]*0.3*100+[各樣品水溶性浸出物/水溶性浸出物最高值+各樣品醇溶性浸出物/醇溶性浸出物最高值]*0.15*100，i=1，2，3……9。試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2，方差分析采用SPSS 26.0軟件處理，分析結(jié)果見表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與直觀分析Tab.2 Orthogonal test results and direct analysis

表3 方差分析Tab.3 Variance analysis

評(píng)分結(jié)果及方差分析見表2，表3。由試驗(yàn)結(jié)果直觀分析可知，各因素對(duì)綜合得分影響大小依次為B>A>D>C，即蒸制火力>蒸制時(shí)間>干燥溫度>切制片型。由此得出，初步確定蒸法制土人參的最佳炮制工藝為A3B2C1D3，即以中火蒸制3 h，切成薄片，于90 ℃烘干。方差分析結(jié)果表明，蒸制時(shí)間A、蒸制火力B和干燥溫度D的P值均<0.01，表明蒸制時(shí)間、蒸制火力和干燥溫度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有極顯著性差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，切制片型C的P值<0.05，表明切制片型對(duì)結(jié)果有顯著性差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)論與討論

4.1 結(jié)論

以蒸制時(shí)間、蒸制火力、切制片型、干燥溫度為考察因素進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以總多糖、總黃酮、浸出物含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選土人參生品最佳蒸制工藝，得出土人參生品最佳炮制工藝為：取土人參生品，洗凈，除去雜質(zhì)，蒸制火力為中火，蒸制3 h，切成薄片，在90 ℃下干燥。

4.2 討論

經(jīng)苯酚-濃硫酸顯色，多糖在濃硫酸作用下先水解為單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚縮合成橙黃色化合物，且顏色穩(wěn)定，此法操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，不要求特殊條件，幾乎用于任何糖類及其衍生物的測(cè)定[13]。亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法是利用黃酮類成分在亞硝酸鈉的條件下可以鋁鹽生成螯合物，再精密加入氫氧化鈉呈紅橙色。姚姝鳳[14]等人利用此法測(cè)定苗藥土人參根總黃酮表明此方法可行、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好。

基于提取工藝優(yōu)選中多糖料液比得到土人參的水提取液較少，過濾耗時(shí)較長(zhǎng)，損失較大且所得的上清液渾濁，對(duì)含量測(cè)定有一定的影響，故選擇對(duì)提取液進(jìn)行離心處理，其操作效率高，提取液澄清，含量測(cè)定穩(wěn)定。

土人參為我國(guó)西南部少數(shù)民族常用民間藥，在貴州為苗族地區(qū)常用藥。此外，土人參還是一種藥食兼用植物，其根、葉均可入藥，又可作蔬菜食用[15]，在貴州地區(qū)使用廣泛，葉、根可涼拌、炒、做湯、燉等。廣泛分布于貴州貴陽、凱里、畢節(jié)、榕江、雷山、松桃、羅甸、獨(dú)山、都勻等苗鄉(xiāng)，資源分布較廣且蘊(yùn)藏量較大，具有開發(fā)價(jià)值。藥物炮制是一門傳統(tǒng)的特色制藥技術(shù)，藥材必須經(jīng)過炮制成飲片后才能入藥是中醫(yī)藥臨床用藥的一大特色，炮制后的熟品，產(chǎn)生與生品不同的功效，達(dá)到不同的臨床治療效果。土人參的研究領(lǐng)域多在于其栽培技術(shù)方向，對(duì)其炮制加工工藝涉及較少，基于相關(guān)文獻(xiàn)土人參的炮制基礎(chǔ)，采用蒸制炮制工藝，通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以總多糖、總黃酮和浸出物為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用綜合評(píng)分的方法優(yōu)選出土人參蒸制的最佳工藝參數(shù)，為土人參的加工工藝提供客觀的技術(shù)參考。