陳 晗，張 爭，陳向東，王 勇，王琦宏 ，曾念開▲

(1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；2教育部熱帶轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室-海南省熱帶藥用植物研究開發(fā)重點實驗室-海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 ?？?571199；3白沙天瑞達(dá)實業(yè)有限公司，海南 白沙 572800)

赤芝GanodermalingzhiSheng H.Wu，Y.Cao & Y.C.Dai在分類上隸屬于多孔菌目Polyporales靈芝科Ganodermataceae[1]，是一種傳統(tǒng)的藥用真菌，具有補(bǔ)氣安神，止咳平喘的功效，用于心神不寧，失眠心悸，肺虛咳喘，虛勞短氣，不思飲食[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，靈芝具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抑菌、保肝護(hù)肝等多種作用[3]。靈芝含有400多種生物活性化合物，包括多糖、三萜、核苷酸、甾體、甾醇、脂肪酸和多肽等[4]。靈芝多糖多提取于靈芝的子實體、菌絲體、孢子中，是靈芝的主要活性成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、 降血糖、神經(jīng)保護(hù)、抗衰老、抗疲勞、抗炎等功能特性[4]。靈芝所含有的靈芝酸，為植物所沒有，各種靈芝中分離得到的靈芝酸已達(dá)100多種[4]。靈芝酸為保護(hù)肝功能的主要成分，具有護(hù)肝、解毒和止痛等藥理活性[4]。如靈芝酸H和靈芝酸A能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖[4，5]，靈芝酸B，A和C能抑制人白血病細(xì)胞HL-60的生長[4，6]。

海南地處熱帶，分布有赤芝等眾多的靈芝科真菌[1]。但近年來，由于人們在海南對野生靈芝科真菌進(jìn)行過度采集，包括赤芝在內(nèi)的野生靈芝逐年減少[7]。因此在保護(hù)野生靈芝種質(zhì)資源的基礎(chǔ)上，對赤芝等進(jìn)行人工栽培已經(jīng)成了當(dāng)務(wù)之急。同時，為了滿足人們追求綠色健康產(chǎn)品的需求，進(jìn)行仿野生栽培已經(jīng)成了一種重要的栽培方式。在海南，人工栽培的橡膠樹Heveabrasiliensis(Willd.ex A.Juss.)Muell.Arg.占據(jù)了海南很大的面積，具有大量的林下空間。為了充分利用橡膠樹林下的閑置空間，我們進(jìn)行了橡膠樹林下赤芝的栽培。此外，我們在橡膠樹林下采用不同的栽培方式，并檢測不同栽培模式下赤芝子實體多糖和靈芝酸的含量，為橡膠-赤芝復(fù)合栽培模式的構(gòu)建提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 栽培場地

海南省白沙縣元門鄉(xiāng)紅茂村委會方什村人工栽培橡膠樹林下；安徽省霍山縣野生闊葉林下。

2 赤芝栽培方法

以栓皮櫟QuercusvariabilisBlume的莖為菌材，采用段木栽培方法，具體方法和步驟參見蘭進(jìn)等[8]。

3 材料與方法

3.1 實驗材料、主要試劑與儀器

3.1.1 實驗材料

赤芝菌種“瓊2號”為海南野生赤芝子實體分離獲得；測量多糖和靈芝酸的赤芝子實體為海南橡膠林下仿野生栽培、成熟狀態(tài)的子實體，同時以安徽省霍山縣闊葉林下、采用埋土方式、仿野生栽培的成熟子實體為對照。憑證標(biāo)本保存于海南醫(yī)學(xué)院真菌標(biāo)本館(FHMU)。

3.1.2 主要試劑

硫酸(分析純)、蒽酮(分析純)、乙醇(分析純)、磷酸(分析純)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)，無水葡萄糖、靈芝酸等對照品購自成都普斯生物科技有限公司。

3.1.3 主要儀器

T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，AL104精密電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，DHG-9076A電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司)，HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市億能實驗儀器廠)，KQ-100V型超聲波清洗器(上海錦玟儀器設(shè)備有限公司)，TGL-16G高速臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器有限公司)，KDC-4 低速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司)，LC-2030高效液相色譜儀(日本島津公司)。

3.2 紫外可見分光光度法測定赤芝多糖的含量

3.2.1 赤芝多糖的提取

取赤芝子實體粉末1.0 g，精確稱定，于100 mL具塞錐形瓶中加入20 mL蒸餾水，超聲30 min。抽濾樣品，用5 mL蒸餾水沖洗瓶中殘余藥渣及濾紙，總濾液約25 mL于蒸發(fā)皿中水浴80 ℃蒸干/烘箱100 ℃烘干。向蒸發(fā)皿中殘余物加4 mL蒸餾水，將粗多糖溶解移至50 mL離心管中，再加入1 mL蒸餾水繼續(xù)溶解轉(zhuǎn)移粗多糖，共得到5 mL多糖溶液。向50 mL離心管中加入乙醇至47.5 mL，4 ℃靜置12 h以上，5000 rpm 離心15 min后棄上清液，將離心管開蓋水浴蒸干得到赤芝粗多糖樣品。

3.2.2 赤芝多糖含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制120 μg/mL的無水葡萄糖對照品溶液，精密量取對照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，分別置具塞試管中，加蒸餾水至2.0 mL，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液(精密量取蒽酮0.1 g，加硫酸100 mL使之溶解，搖勻)6 mL，立即搖勻，放置15 min后，立刻冰浴15 min，取出，以相應(yīng)試劑為空白，在625 nm波長處測定吸光度值。以吸光度值為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算回歸方程為Y=0.0012X-0.0013，R2=0.9993，線性范圍0.00～735 μg/mL。

3.2.3 赤芝粗多糖供試品溶液的制備

向裝有赤芝粗多糖的離心管中加入5 mL蒸餾水，超聲5 min使其溶解，將溶液連同沉淀物轉(zhuǎn)移至10 mL離心管，充分搖勻使沉淀物分散，離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的10 mL離心管，得到多糖溶液，-20 ℃保存。取1 mL多糖溶液，定容于10 mL容量瓶作為供試品溶液。

3.2.4 赤芝多糖的含量測定

用移液槍取供試品溶液1 mL于具塞試管中，加入1 mL蒸餾水，使用10 mL移液管迅速加入6 mL硫酸蒽酮溶液，立刻搖勻，放置15 min后立刻置于冰浴中冷卻15 min，取出，以2 mL蒸餾水加6 mL硫酸蒽酮溶液為空白，使用紫外可見分光光度計在625 nm波長處測定吸光度。

3.3 HPLC法測定赤芝中靈芝酸的含量

3.3.1 供試品溶液的制備

取干燥的赤芝子實體粉末2.0 g，精密稱定，置150 mL具塞錐形瓶中，用移液管準(zhǔn)確加入40 mL乙醇，超聲20 min后搖勻抽濾，收集濾液，藥渣再次加40 mL乙醇超聲20 min，收集合并兩次濾液，將濾液38 ℃真空干燥，用色譜甲醇定容至5 mL，過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液即得。

3.3.2 靈芝酸含量測定的色譜條件

測定波長：257 nm；色譜柱：安捷倫Angilant PromosilC18(2.1 mm× 15 cm，5 μm)；柱溫：25 ℃；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL。梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedures

3.3.3 靈芝酸A 的含量測定線性方程

分別取靈芝酸A溶液(1.0 mg/mL)200 μL、300 μL、400 μL、500 μL于1 mL容量瓶中，用甲醇(HPLC級)定容至刻度得0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL靈芝酸A溶液，分別HPLC進(jìn)樣5 μL，制作靈芝酸A標(biāo)準(zhǔn)曲線，靈芝酸A標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=14299X-7543.3，R2=0.9961，線性范圍0～500 μL。取適量靈芝酸A標(biāo)準(zhǔn)品，加HPLC甲醇配制為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，4 ℃保存，作為每次進(jìn)樣時的對照品。

3.3.4 靈芝酸的含量測定

使用島津LC-2030高效液相色譜儀測定10種靈芝酸，各靈芝酸對照品相對靈芝酸A的近似相對保留時間如表2所示。

表2 靈芝酸對照品相對靈芝酸A的近似相對保留時間Tab.2 The approximate relative retention time of each ganoderic acid compared with that of ganoderic acid A

圖1 靈芝酸A標(biāo)準(zhǔn)品及赤芝樣品中各靈芝酸HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of ganoderic acid A and each ganoderic acid in G.lingzhi sample

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品靈芝酸A(峰6)的保留時間與其他9種靈芝酸的相對保留時間，指認(rèn)峰1，2，3，4，5，6，7，8，10分別為靈芝烯酸C，靈芝酸C2，靈芝酸G，靈芝烯酸B，靈芝酸B，靈芝酸A，靈芝酸H，靈芝烯酸D，靈芝酸F。靈芝酸D出峰時間在34.2 min，所有樣品中靈芝酸D含量都小于0.04%，峰無法顯示。分別計算赤芝子實體中每種靈芝酸的百分比：含量測定結(jié)果=(ru/rs)×Cs×(V/W)×F×100%。ru=樣品溶液中相關(guān)分析物的峰面積，rs=標(biāo)準(zhǔn)溶液A中的靈芝酸A的峰面積，Cs=標(biāo)準(zhǔn)溶液A中靈芝酸A標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(mg/mL)，V=樣品溶液的體積(mL)，W=用于制備樣品溶液的靈芝子實體的重量(mg)，F(xiàn)=相對于靈芝酸A的相對響應(yīng)因子。

4 結(jié)果

海南橡膠林下不同栽培方式獲得的赤芝子實體，其多糖含量如表3所示。與對照即安徽闊葉林下埋土栽培的赤芝子實體中多糖的含量相比，海南橡膠林下不同栽培方式獲得的赤芝子實體的多糖含量均較高，且和對照均有明顯差異。另外，海南橡膠林下三種栽培方式對赤芝子實體中多糖含量的影響無明顯差異。

表3 海南橡膠林下不同栽培方式赤芝子實體的多糖含量Tab.3 The content of total polysaccharides in the fruit body of G.lingzhi cultivated by different methods under artificial forests of H.brasiliensis in s.d.，n=3)

海南橡膠林下不同栽培方式中赤芝子實體的靈芝酸含量如表4所示。對照即安徽闊葉林下埋土栽培的赤芝子實體，其靈芝酸G、靈芝烯酸B、靈芝酸A、靈芝酸H、靈芝烯酸D、靈芝酸F、總靈芝酸含量均高于海南橡膠林下三種栽培方式的赤芝子實體，且具有顯著性差異。海南橡膠林下埋土栽培方式獲得的赤芝子實體靈芝酸C2含量最高；埋土及半埋土栽培方式的赤芝子實體中靈芝酸B含量較高；不埋土和半埋土栽培方式獲得的子實體，其靈芝烯酸C2較高。

表4 海南橡膠林下不同栽培方式赤芝子實體的靈芝酸含量Tab.4 The content of ganoderic acids in the fruit body of G.lingzhi cultivated by different methods under artificial forests of H.brasiliensis in s.d.，n=3)

5 討論

海南是中國最大的天然橡膠主產(chǎn)區(qū)和種植基地[8]，具有豐富的橡膠林下空間，那么如何利用這些空間，使其獲得更好的林農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效益，是當(dāng)下要解決的一個重要問題。目前，橡膠林復(fù)合種植模式被認(rèn)為是解決這些問題的有效手段[9]。國內(nèi)，橡膠林下有橡膠-大葉千斤拔、橡膠-茶葉、橡膠-益智、橡膠-可可等多種復(fù)合種植模式[9]。雖然也有橡膠-靈芝的復(fù)合種植模式，但卻沒有受到足夠重視，且缺少深入的研究[10]。本研究采用赤芝段木菌棒不埋土、半埋土、全埋土三種不同的栽培方式，并對其多糖和靈芝酸含量進(jìn)行測定。研究結(jié)果表明，栽培方式對赤芝子實體多糖含量沒有顯著影響(表3)，但海南橡膠林下三種栽培方式獲得的子實體多糖含量均比對照即安徽闊葉林下埋土栽培的赤芝子實體多糖含量高，且具有顯著性差異(表3)。這說明橡膠林下適合栽培對多糖含量要求高的赤芝子實體。此外，在2020年版《中華人民共和國藥典》中規(guī)定紫外分光光度法檢測的總多糖含量不得少于干重的0.9%，本研究中各種不同栽培方法下，其多糖的含量均達(dá)到了《中國藥典》規(guī)定的量。

靈芝酸結(jié)構(gòu)和種類多樣，具有多種藥理作用。日本對靈芝商品及靈芝制品中的靈芝酸非常重視，是鑒定商品質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為三萜類靈芝酸含量越高，靈芝產(chǎn)品質(zhì)量越好。因此對各種靈芝酸的含量測定具有重要的意義。本論文中，海南橡膠林下不埋土和半埋土栽培方式獲得的子實體，其靈芝烯酸C較高；全埋土栽培方式獲得的子實體，其靈芝酸C2最高；半埋土和全埋土栽培方式獲得的子實體，其靈芝酸B較高(表4)；三種不同栽培方式對總靈芝酸的含量均沒有顯著影響(表4)。此外，《美國藥典》規(guī)定通過HPLC法檢測靈芝酸不得少于干重的0.3%，本研究中海南橡膠林下各種不同栽培方法獲得的子實體，其總靈芝酸的含量均達(dá)到了《美國藥典》規(guī)定的量。

在中國，各地因地制宜，采用合適的模式進(jìn)行赤芝的栽培。本論文采用的橡膠林下赤芝仿野生栽培，不僅符合海南省生態(tài)文明建設(shè)的需求，而且品質(zhì)優(yōu)良，其有效成分多糖和靈芝酸均達(dá)到或超過相關(guān)規(guī)定要求的量。此外，由于海南常年無冬，在全年的大部分時間段，赤芝都可以栽培和采收，而不像國內(nèi)其他地區(qū)，一年只能進(jìn)行一次栽培和一次采收。因此，綜合以上來看，在海南構(gòu)建橡膠-赤芝復(fù)合栽培模式是完全可行的。