余鳳玉，唐慶華，朱 輝，宋薇薇，牛曉慶，楊德潔

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所/院士團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新中心/椰子國(guó)家工程研究中心，海南文昌，571339)

奇異根串珠霉菌Ceratocystisparadoxa屬于根串珠霉屬，在熱帶地區(qū)分布極為廣泛，可侵染為害大部分棕櫚科植物，是影響棕櫚科植物建康發(fā)展的重要病原菌[1-2]。該菌可為害椰子CocosnuciferaL.、布迪椰子Butiacapitata(Mart.) Becc.、三角椰子Dypsisdecaryi(Jum.) Beentje & J.Dransf.、棍棒椰子HyophorbeverschaffeltiiH.Wendl.、油棕ElaeisguineensisJacq.、椰棗PhoenixdactyliferaL.等棕櫚植物，引起莖干瀉血、莖干腐爛、冠腐、芽腐、葉片焦枯、果腐等癥狀，嚴(yán)重的整株死亡[3-9]。目前，在海南省椰子種植區(qū)普遍發(fā)生由奇異根串珠霉菌為害引起的棕櫚植物病害，其中以為害椰子引起莖干瀉血和莖干腐爛最為嚴(yán)重，發(fā)病率40%以上，死亡率超過(guò)5%[8，10]；至今尚無(wú)十分有效的防治方法，給海南省椰子等棕櫚植物的生產(chǎn)及推廣應(yīng)用造成嚴(yán)重威脅和損失，已成為棕櫚科植物生產(chǎn)及推廣應(yīng)用急需解決的問(wèn)題。

奇異根串珠霉菌為土壤習(xí)居菌，其厚垣孢子可在土壤中長(zhǎng)期存活并廣泛傳播。自1906年首次在斯里蘭卡發(fā)現(xiàn)奇異根串珠霉菌引起椰子瀉血病以來(lái)，已有110多年的歷史，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在奇異根串珠霉菌引起棕櫚植物病害的發(fā)生分布[4，8-10]、化學(xué)藥劑篩選、生物防治[5，11-18]等多方面進(jìn)行了卓有成效的研究，取得了積極進(jìn)展。但由于不了解病原菌致病性分化情況，影響了人們對(duì)該病原菌侵染條件及為害情況的認(rèn)識(shí)，制約了對(duì)該病原菌引起病害的防治、預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)和寄主抗病性等方面的研究，至今尚未找到十分有效的奇異根串珠霉菌病害防治方法。因此，本研究對(duì)椰子樹不同部位分離到的3株菌落特征差異顯著的分離株進(jìn)行其生物學(xué)特性研究，以便為研究闡明奇異根串珠霉菌致病力和遺傳多樣性，及病害防治策略制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株的采集、分離

從海南省文昌市椰子樹上表現(xiàn)心部腐爛、莖干腐爛和樹冠基部腐爛的部位采集病樣，按常規(guī)組織塊分離法[19]分離病原菌，獲得單菌落后保存菌種，選擇在PDA培養(yǎng)基平板上菌落特征差異明顯的3株分離株BR2、TR924和GF924作為研究對(duì)象。

1.2 培養(yǎng)性狀觀察

將分離株BR2、TR924和GF924用打孔器(直徑5mm)從菌落邊緣取菌碟，無(wú)菌條件下移入PDA培養(yǎng)基平板中央置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d后觀察記錄菌落形狀、顏色、氣味及氣生菌絲生長(zhǎng)情況。

1.3 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

將分離株BR2、TR924和GF924在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d后，用打孔器(直徑5 mm)從菌落邊緣取菌碟，無(wú)菌條件下移入PDA培養(yǎng)基平板上，分別置于5、10、15、20、25、30、35和40 ℃恒溫條件下培養(yǎng)，2 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑；7 d后分別用30 mL無(wú)菌水洗滌平板，制成孢子懸浮液，然后在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)量孢子濃度。每處理重復(fù)6次。

1.4 碳氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

以查彼克培養(yǎng)基(Czapek)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將分離株BR2、TR924和GF924置于不同碳源和氮源培養(yǎng)基，即分別以等量的D-果糖、甘露醇、D-半乳糖、可溶性淀粉、葡萄糖、海藻糖置換其中的蔗糖，以等量的硝酸鉀、脲、硫酸銨、磷酸二氫銨、硝酸銨、氯化銨置換其中的硝酸鈉，以Czapek培養(yǎng)基為對(duì)照，不加碳源和不加氮源為空白對(duì)照，每處理重復(fù)6次，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照1.3的方法測(cè)量菌落直徑和計(jì)算孢子數(shù)。

1.5 pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

分別用HCl 1 mol/L和NaOH 1 mol/L溶液在無(wú)菌條件下將PDA培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)到4、5、6、7、8、9、10、11共8個(gè)處理，將直徑5 mm菌碟接種于不同pH值平板中央培養(yǎng)，25 ℃下恒溫培養(yǎng)，每處理重復(fù)6次。按照1.3的方法測(cè)量菌落直徑和計(jì)算孢子數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)性狀

分離得到的3個(gè)菌株在PDA培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)迅速，2 d后均長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿(直徑90 mm)，氣生菌絲發(fā)達(dá)，有濃郁的水果香味。初期菌絲體白色，稀疏放射狀，后從中央開始隨著厚垣孢子的產(chǎn)生而呈黑色。生長(zhǎng)7 d后發(fā)現(xiàn)存在3個(gè)菌落特征差異明顯的菌株BR2、TR924和GF924。其中分離株BR2氣生菌絲茂盛松軟，厚，棉絮狀；分離株TR924氣生菌絲茂盛，較松軟，羽絨狀；分離株GF924氣生菌絲較為致密，絨毛狀(見圖1)。

圖1 奇異根串珠霉菌Ceratocystis paradoxa3株分離株P(guān)DA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后的培養(yǎng)性狀

2.2 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

從圖2可以看出，分離株BR2、TR924和GF924的菌絲15～35 ℃均可以生長(zhǎng)，30 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)速率下降。BR2和GF924最適生長(zhǎng)溫度為25～30 ℃，TR924菌絲最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃。3株分離株在20～30 ℃范圍內(nèi)生長(zhǎng)速率存在差異，GF924的生長(zhǎng)速率極顯著低于另2株分離株。

圖2 溫度對(duì)奇異根串珠霉菌Ceratocystis paradoxa 3株分離株菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

分離株BR2、TR924和GF924在10～35 ℃范圍內(nèi)均可以產(chǎn)孢。10～25 ℃，分離株TR924和GF924產(chǎn)孢量均呈上升趨勢(shì)。分離株BR2在20 ℃時(shí)的產(chǎn)孢量顯著低于15 ℃，10～25 ℃范圍內(nèi)其產(chǎn)孢量呈先升后降再升的趨勢(shì)；10～30 ℃范圍內(nèi)BR2的產(chǎn)孢量均極顯著高于另外2株分離菌。

2.3 碳氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

從表1可以看出，3株分離株均可在查彼克培養(yǎng)基(對(duì)照)上生長(zhǎng)，在可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快。3株分離株在供試培養(yǎng)基上均可以產(chǎn)孢，其中，分離株BR2和GF924在可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大，而分離株TR924在甘露醇為碳源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大。綜合菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量可知，分離株BR2和GF924菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的最適碳源均是可溶性淀粉；分離株TR924菌絲生長(zhǎng)最適碳源是可溶性淀粉，最適產(chǎn)孢碳源是甘露醇。

表1 碳氮源對(duì)奇異根串珠霉菌Ceratocystis paradoxa 3株分離株菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

分離株BR2、TR924和GF924在無(wú)氮源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)和產(chǎn)孢。供試氮源中，菌絲生長(zhǎng)的最適氮源均為氯化銨，生長(zhǎng)速率顯著高于其他供試氮源。分離株BR2最適產(chǎn)孢氮源是硝酸鉀，TR924和GF924在查彼克培養(yǎng)基(對(duì)照)上產(chǎn)孢量最大。3株分離株在脲為氮源的培養(yǎng)基上均不能產(chǎn)孢。氯化銨雖然最適合TR924菌絲生長(zhǎng)，但卻不能使其產(chǎn)孢。

2.4 pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

從表3可以看出，在pH值4～11范圍內(nèi)，分離株BR2、TR924和GF924均能很好地生長(zhǎng)和產(chǎn)孢。其中，分離株BR2菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的最適pH值分別是5和6，產(chǎn)孢量達(dá)到(40.83±6.12)×107/皿；分離株TR924菌絲生長(zhǎng)最適pH值為5～7，最適產(chǎn)孢pH值為6；分離株GF924菌絲生長(zhǎng)最適pH值為6，最適產(chǎn)孢pH值是10～11。

表3 pH值對(duì)奇異根串珠霉菌Ceratocystis paradoxa 3株分離株菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

3 結(jié)論與討論

本文從椰子不同部位分離獲得3株奇異根串珠霉菌分離株。試驗(yàn)結(jié)果表明，3株分離株菌絲在15～35 ℃范圍均可以生長(zhǎng)，但分離株TR924在30 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)速率開始下降，說(shuō)明該分離株對(duì)高溫的耐受性較差，這與其引起的海南椰子樹莖干腐爛病只在冬春季流行相吻合，說(shuō)明溫度是影響椰子樹莖干腐爛病流行暴發(fā)的關(guān)鍵生態(tài)因子。研究結(jié)果表明，分離株BR2和GF924菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的最適碳源均是可溶性淀粉；分離株TR924菌絲生長(zhǎng)最適碳源是可溶性淀粉，最適產(chǎn)孢碳源是甘露醇。菌絲生長(zhǎng)的最適氮源均為氯化銨，生長(zhǎng)速率顯著高于其他供試氮源。分離株BR2最適產(chǎn)孢氮源是硝酸鉀，TR924和GF924在查彼克培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大。3株分離株在無(wú)氮培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，說(shuō)明這3株分離株有高效的氮代謝途徑[20]。碳氮源是病原菌生長(zhǎng)的基本物質(zhì)，研究不同碳氮源對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響，是系統(tǒng)研究病害發(fā)生規(guī)律的重要內(nèi)容之一，對(duì)病害防控有指導(dǎo)意義[21-22]。3株分離株在pH值4～11的范圍內(nèi)均能很好地生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，但不同分離株間存在差異。菌絲生長(zhǎng)最適pH值均為弱酸性，而產(chǎn)孢對(duì)酸堿性適應(yīng)性差異顯著，GF924在強(qiáng)堿性條件下產(chǎn)孢量最大，弱酸性最適合另2株分離株產(chǎn)孢，說(shuō)明從不同部位分離獲得的分離株有性繁殖對(duì)酸堿性的適應(yīng)性不一樣。奇異根串珠霉菌是土壤習(xí)居菌，土壤pH值環(huán)境影響其定殖和侵染。本文研究結(jié)果顯示奇異根串珠霉菌在pH值4～11的范圍內(nèi)均能很好地生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，但對(duì)其致病力還有待進(jìn)一步研究，以期通過(guò)改良土壤pH值來(lái)防控奇異根串珠霉菌引起的病害。