楊遠(yuǎn)廷， 吳紫倩， 程文科， 李芷晴， 冷淑珍， 陳鏵耀， 舒緒剛*

(1. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院， 廣州 510225； 2. 廣州邁高化學(xué)有限公司， 廣州 510990)

緩釋技術(shù)是通過(guò)不同的包被方法使得包被體系中的藥物能以一定濃度持續(xù)釋放到環(huán)境中的一種控制釋放技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于水處理、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等眾多領(lǐng)域[12-17]. 緩釋技術(shù)的應(yīng)用可提高水處理劑在水質(zhì)凈化和消毒時(shí)的藥劑利用率，增加藥劑穩(wěn)定性. 章秋菊等[18]采用熔融攪拌分散冷凝法制備聚乙烯蠟包覆型高鐵酸鉀，具有較好的緩釋和防潮性能；YUAN等[19]通過(guò)油相分離法微膠囊技術(shù)成功制備包覆型高錳酸鉀，發(fā)現(xiàn)包覆后高錳酸鉀的氧化效率比未包覆K2MnO4水溶液的提高了1.7倍，同時(shí)對(duì)三氯乙烯的去除效果較好；且包被后的藥劑更有利于地下水等特殊水體的修復(fù)和凈化[20]. 然而，目前有關(guān)KHSO5包被的相關(guān)研究報(bào)道不多.

本試驗(yàn)以KHSO5復(fù)合鹽為原料，采用擠出滾圓法制備骨架丸芯，進(jìn)一步包被成微球；以累計(jì)釋放率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化工藝參數(shù)；通過(guò)懸浮定量和定性殺菌試驗(yàn)探究其有效殺菌濃度.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑及儀器

主要試劑：聚乙二醇-2000、聚乙二醇-6000、氯化鋇(BaCl2)、乙酸乙酯、硫代硫酸鈉(Na2S2O3·5H2O)、檸檬酸三乙酯、乙基纖維素、KHSO5復(fù)合鹽、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂和肉湯均為市售，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌取自本單位生化實(shí)驗(yàn)室.

主要儀器：小型中藥制球機(jī)(DZ-20，長(zhǎng)沙中南制藥機(jī)械廠)、掃描電子顯微鏡(S4800，日本日立)、高壓蒸汽滅菌鍋(LX-B50L，北京瑞邦興業(yè)科技有限公司)、生化培養(yǎng)箱(LRH-150，上海一恒科學(xué)儀器有限公司).

1.2 微球的制備

1.2.1 丸芯的制備 取適量聚乙二醇6000溶于100 mL無(wú)水乙醇中，60 ℃下加熱并攪拌，待出現(xiàn)白色顆粒時(shí)，迅速加入預(yù)混勻的KHSO5復(fù)合鹽與玉米淀粉，同時(shí)加入適量阻滯劑及玉米油，使物料混勻?yàn)檐洸模辉俳?jīng)制球機(jī)擠壓、制條、制球等工藝，即可制備出KHSO5丸芯.

1.2.2 脂溶性緩釋膜的合成 取3 g乙基纖維素溶解于100 mL的乙酸乙酯中，加入少許增塑劑檸檬酸三乙酯，于60 ℃下加熱溶解，攪拌30 min. 加入適量致孔劑聚乙二醇-2000，待其均勻分散在脂溶性膜溶液中后停止攪拌，取出備用.

1.2.3 包膜 取制備好的丸芯用乙酸乙酯清洗、晾干，放入脂溶性膜溶液中，經(jīng)攪拌、震蕩和過(guò)濾，即完成一次包膜，放入鼓風(fēng)干燥箱中常溫下干燥至恒定質(zhì)量，常溫干燥保存.

1.3 制備工藝優(yōu)化

對(duì)聚乙二醇-6000、KHSO5復(fù)合鹽、阻滯劑和致孔劑的質(zhì)量濃度以及脂溶性膜的層數(shù)等工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)：(1)以KHSO5復(fù)合鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%、阻滯劑質(zhì)量濃度為0.05 g/mL、致孔劑質(zhì)量濃度為0.004 g/mL、脂溶性膜為6層，探究聚乙二醇-6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)微球累計(jì)釋放率的影響;(2)以聚乙二醇-6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%、阻滯劑質(zhì)量濃度為0.05 g/mL、致孔劑質(zhì)量濃度為0.004 g/mL、脂溶性膜為6層，探究KHSO5復(fù)合鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)微球累計(jì)釋放率的影響;(3)以聚乙二醇-6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%、KHSO5復(fù)合鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%、致孔劑質(zhì)量濃度為0.004 g/mL、脂溶性膜為6層，探究阻滯劑乙基纖維素的質(zhì)量濃度對(duì)微球累計(jì)釋放率的影響; (4)以聚乙二醇-6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%、KHSO5復(fù)合鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%、阻滯劑質(zhì)量濃度為0.05 g/mL、致孔劑為0.004 g/mL，探究脂溶性膜的層數(shù)對(duì)微球累計(jì)釋放率的影響; (5)以聚乙二醇-6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%、KHSO5復(fù)合鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%、阻滯劑質(zhì)量濃度為0.05 g/mL、脂溶性膜為7層，探究致孔劑的質(zhì)量濃度對(duì)微球累計(jì)釋放率的影響.

1.4 微球累計(jì)釋放率的測(cè)定

取1 g樣品加入到400 mL去離子水中，室溫下攪拌，每隔2 h取樣5 mL并補(bǔ)充等體積去離子水，再根據(jù)國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》第四版中敘述的質(zhì)量法測(cè)定硫酸根離子的質(zhì)量，最后通過(guò)生成的硫酸鋇來(lái)計(jì)算KHSO5累計(jì)釋放量[21]. 同時(shí)繪制KHSO5累計(jì)釋放率曲線，當(dāng)水中的KHSO5累計(jì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)幾乎無(wú)變化時(shí)，說(shuō)明KHSO5已釋放完全.

其中，m為KHSO5的質(zhì)量(g)，m1為硫酸鋇和坩堝總質(zhì)量(g)，m0為坩堝的質(zhì)量(g)，M1為硫酸鋇的摩爾質(zhì)量(233.23 g/moL)，M2為KHSO5的摩爾質(zhì)量(614.76 g/moL).

1.5 微球的形貌表征

將微球從中間切開(kāi)，粘在導(dǎo)電膠上，待樣品表面噴金后，用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察樣品的微觀結(jié)構(gòu)，用能量色散光譜(EDS)分析元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù).

1.6 滅菌性能的測(cè)定

1.6.1 菌懸液的制備 參照文獻(xiàn)[22]的方法制備菌懸液，對(duì)菌懸液進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)，然后用濃度為0.03 mol/L的滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至菌數(shù)約1×107cfu/mL，備用.

1.6.2 中和劑的選擇 以硫代硫酸鈉溶液(0.5%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))為中和劑、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為指示菌、2.6 g/L KHSO5微球?yàn)橄緞?.03 mol/L PBS為稀釋液進(jìn)行試驗(yàn). 試驗(yàn)共設(shè)6組：第1組為消毒劑+菌懸液；第2組為消毒劑+菌懸液+中和劑；第3組為中和劑+菌懸液；第4組為消毒劑+中和劑+菌懸液；第5組為稀釋液+菌懸液；第6組為中和劑+稀釋液+未接種培養(yǎng)基. 具體操作參考文獻(xiàn)[23]的試驗(yàn)方法.

1.6.3 定量殺菌試驗(yàn) 取無(wú)菌試管，先加入0.5 mL菌懸液，置于20 ℃的水浴中保溫5 min，再加入4.5 mL消毒劑，迅速混勻并計(jì)時(shí). 待菌懸液與消毒劑相互作用12 h后，分別移取1 mL菌懸液與消毒劑混合液加入9 mL在滅菌的中和劑中混勻，作用10 min后，移取1.0 mL樣品液，測(cè)定存活菌數(shù)，每管接種致2個(gè)培養(yǎng)皿. 若平板上生長(zhǎng)的菌落過(guò)密集，則進(jìn)行10倍系列稀釋后，再進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù). 同時(shí)以0.03 mol/L PBS代替消毒劑，進(jìn)行平行試驗(yàn)，作為陽(yáng)性對(duì)照. 樣本均置于培養(yǎng)箱，恒溫培育48 h后觀察最終結(jié)果.

殺菌率：

其中，N0為消毒前的活菌數(shù)，Nt為消毒后的活菌數(shù)[22]. 試驗(yàn)重復(fù)3次，以各組平均值表示最終的殺菌率.

1.6.4 定性殺滅試驗(yàn) 移取各菌懸液2.5 mL至 2.5 mL各濃度消毒劑中，輕搖混勻，開(kāi)始計(jì)時(shí)，于0.25、0.5、1、2、4、8、12 h時(shí)從試管中取 0.5 mL加入到4.5 mL中和劑溶液中，輕搖混勻 10 min；移取 0.5 mL混合液加入到4.5 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中，在37 ℃下培育24 h后觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況. 同時(shí)以 PBS 代替消毒劑，重復(fù)以上步驟，作為陽(yáng)性對(duì)照組，試驗(yàn)重復(fù)3次，根據(jù)培養(yǎng)物渾濁與否判斷細(xì)菌的生長(zhǎng)情況. 若渾濁，則有細(xì)菌生長(zhǎng)；若不渾濁，再培養(yǎng)48 h后觀察，仍不渾濁即視為無(wú)菌生長(zhǎng).

2 結(jié)果與討論

2.1 KHSO5微球的形態(tài)表征

KHSO5微球的形態(tài)及緩釋性能與制備工藝關(guān)系密切. KHSO5屬于水溶性物質(zhì)，將其與輔料混合制成丸芯可減少與水的反應(yīng)，避免氧化能力的喪失，其中丸芯骨架聚乙二醇-6000在熔融狀態(tài)下易定型，制得的丸芯表面光滑、圓整度好(圖1A)；壁材乙基纖維素有良好的耐吸濕性，性質(zhì)穩(wěn)定，將其包被KHSO5可保護(hù)KHSO5不受潮解(圖1B)；而致孔劑聚乙二醇-2000是細(xì)小且易溶于水的物質(zhì)，與脂溶性膜溶液充分混合，當(dāng)膜液中溶劑揮發(fā)形成薄膜時(shí)，膜上的聚乙二醇-2000易溶解，形成微小的孔隙(圖1C、圖1D). 以上結(jié)果說(shuō)明該制備工藝簡(jiǎn)單可行，微球成膜性較好，表面有明顯鑲嵌的微孔結(jié)構(gòu). 利用EDS能譜分析微球的化學(xué)組成(圖1E、圖1F),結(jié)果表明：微球主要由C(42.95%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)，全文同)、O(44.50%)、S(5.22%)和K(7.32%)等元素組成，其中C和O的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，這與KHSO5本身和包被材料組成有關(guān).

圖1 KHSO5微球的SEM圖及EDS能譜

2.2 制備工藝的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 聚乙二醇-6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 在其他因素相同時(shí)，KHSO5累計(jì)釋放率與骨架聚乙二醇-6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)成負(fù)相關(guān)(圖2)，緩釋12 h后基本釋放完全，前期釋放速率較快，后期有所減緩，其中在4～10 h區(qū)間，聚乙二醇-6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%的緩釋效果比質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%和25%的略優(yōu)，但與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%和45%的緩釋效果差異不大，因此，骨架聚乙二醇-6000的較優(yōu)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%.

圖2 聚乙二醇-6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)KHSO5微球累計(jì)釋放率的影響

2.2.2 KHSO5復(fù)合鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 在其他因素相同時(shí)，KHSO5累計(jì)釋放率隨KHSO5復(fù)合鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增大(圖3)，說(shuō)明KHSO5的質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高會(huì)加速丸芯內(nèi)KHSO5的釋放. KHSO5復(fù)合鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的緩釋效果比質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%和40%的更優(yōu)，與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%和25%的緩釋效果差異不大；綜合考慮丸芯性能和工藝成本，KHSO5復(fù)合鹽的較優(yōu)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%.

圖3 KHSO5復(fù)合鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)KHSO5微球累計(jì)釋放率的影響

2.2.3 阻滯劑質(zhì)量濃度的影響 在其他因素相同時(shí)，隨著阻滯劑質(zhì)量濃度的增加，KHSO5累計(jì)釋放率呈下降趨勢(shì)(圖4)，說(shuō)明阻滯劑能有效阻滯水與KHSO5的接觸，從而減緩其釋放率，但阻滯劑質(zhì)量濃度過(guò)高不利于充分發(fā)揮丸芯的功效. 阻滯劑質(zhì)量濃度為0.05、0.03、0.04 g/mL的緩釋效果差異不大，但質(zhì)量濃度為0.05 g/mL時(shí)緩釋速率更理想. 可見(jiàn)，阻滯劑的較優(yōu)質(zhì)量濃度為0.05 g/mL.

圖4 阻滯劑乙基纖維素質(zhì)量濃度對(duì)KHSO5微球累計(jì)釋放率的影響

2.2.4 脂溶性膜層數(shù)的影響 在其他因素相同時(shí)，脂溶性膜層數(shù)變化對(duì)釋放率的影響較為明顯(圖5)，隨著脂溶性膜層數(shù)的增加，KHSO5的累計(jì)釋放率減少，緩釋時(shí)長(zhǎng)基本在12 h. 8層緩釋效果雖優(yōu)于其他的組，但綜合緩釋速率和成本的考慮，脂溶性膜的較優(yōu)層數(shù)為7層.

圖5 脂溶性膜層數(shù)對(duì)KHSO5微球累計(jì)釋放率的影響

2.2.5 致孔劑質(zhì)量濃度的影響 在其他因素相同時(shí)，隨著致孔劑質(zhì)量濃度的增加，KHSO5累計(jì)釋放率也相應(yīng)增加，前期釋放速率較快，后期逐漸減緩(圖6). 聚乙二醇-2000質(zhì)量濃度為0.003 g/mL時(shí)的緩釋效果與0.002 g/mL的差異不大，但優(yōu)于質(zhì)量濃度0.004 g/mL及以上的緩釋效果，可能是由于聚乙二醇-2000質(zhì)量濃度過(guò)高導(dǎo)致緩釋球吸收漲破，失去緩釋作用. 可見(jiàn)添加少量致孔劑，增加緩釋微球表面的孔隙率，即可避免藥物釋放的滯后效應(yīng)，同時(shí)也有助于丸芯中KHSO5經(jīng)孔道擴(kuò)散實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效緩釋的作用. 綜合分析，致孔劑的較優(yōu)質(zhì)量濃度為0.003 g/mL.

圖6 致孔劑聚乙二醇-2000質(zhì)量濃度對(duì)KHSO5微球累計(jì)釋放率的影響

2.3 微球釋放模型及釋藥機(jī)制

為分析KHSO5微球的釋放模型和機(jī)制，分別采用零級(jí)模型、Higuchi模型和Ritger-peppas模型對(duì)微球進(jìn)行擬合[24-25]，擬合曲線見(jiàn)圖7. 擬合結(jié)果如下：零級(jí)釋放模型(Q=6.786t+5.448，R2=0.955)；Higuchi釋放模型(Q=38.946t1/2-45.538，R2=0.984)；Ritger-peppas釋放模型(Q=10.851t0.843，R2=0.965). 比較R2可知，擬合優(yōu)度順序：Higuchi、Ritger-peppas、零級(jí)，說(shuō)明KHSO5微球的釋放過(guò)程符合Higuchi釋放模型，釋藥機(jī)制以Fick擴(kuò)散為主.

圖7 KHSO5微球的緩釋擬合曲線

2.4 滅菌性能

2.4.1 中和劑的選擇 為驗(yàn)證所選中和劑，試驗(yàn)共設(shè)6組：第1組驗(yàn)證消毒劑在試驗(yàn)濃度下能否殺菌；第2組驗(yàn)證中和劑是否中和殘留消毒劑的殺菌效果；第3組驗(yàn)證中和劑能否殺菌；第4組驗(yàn)證消毒劑與中和劑的反應(yīng)產(chǎn)物能否殺菌；第5組作為陽(yáng)性對(duì)照；第6組作為陰性對(duì)照. 若第1組無(wú)菌生長(zhǎng)或僅有少數(shù)菌生長(zhǎng)，第2組有菌且菌數(shù)不低于100 cfu/mL，第3、4和5組間菌數(shù)誤差率≤15%，第6組無(wú)菌生長(zhǎng)，則說(shuō)明所選中和劑適用[23]. 表1結(jié)果顯示，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的硫代硫酸鈉可有效中和其對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殘留，且中和劑及中和產(chǎn)物對(duì)試驗(yàn)菌無(wú)抑制及滅菌性能，對(duì)培養(yǎng)基無(wú)顯著影響.

表1 中和劑的選擇試驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 定量滅菌性能 當(dāng)消毒劑在最低質(zhì)量濃度下的殺菌率均在 99.9%以上時(shí)，可判定該質(zhì)量濃度為消毒劑的有效殺菌質(zhì)量濃度[23]. 由表2結(jié)果顯示，微球?qū)Υ竽c桿菌和金黃色葡萄球菌的有效殺菌質(zhì)量濃度均為2.0 g/L，同時(shí)與相應(yīng)質(zhì)量濃度KHSO5的混合物相比差別不大，這說(shuō)明微球制備過(guò)程對(duì)原料中的有效殺菌活性成分影響不大.

表2 KHSO5微球與KHSO5混合物對(duì)細(xì)菌的定量滅菌性能Table 2 The results of quantitative killing test of microspheres and peroxymonosulfate mixture against strains

2.4.3 定性滅菌性能 KHSO5微球與KHSO5混合物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低有效質(zhì)量濃度均為2.0 g/L(圖8)，該質(zhì)量濃度下KHSO5混合物對(duì)2種菌株的最短作用時(shí)間均為1 h，而微球?qū)Υ竽c桿菌的最短作用時(shí)間為8 h，對(duì)金黃色葡萄球菌的最短作用時(shí)間為12 h. 這進(jìn)一步說(shuō)明微球制備過(guò)程對(duì)原料的活性成分干擾不大，在作用時(shí)間上滅菌性能存在差異是因?yàn)榘缓驥HSO5具有緩釋效果.

圖8 KHSO5微球及KHSO5混合物對(duì)大腸桿菌、葡萄球菌的定性滅菌性能

3 結(jié)論

采用緩釋技術(shù)對(duì)KHSO5復(fù)合物進(jìn)行包被處理，研究不同條件對(duì)緩釋效果的影響. 結(jié)果表明：當(dāng)聚乙二醇-6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%、KHSO5復(fù)合鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%、阻滯劑質(zhì)量濃度為0.05 g/mL、致孔劑質(zhì)量濃度為0.003 g/mL和脂溶性膜為7層時(shí)，所制備的KHSO5微球成膜性良好，形態(tài)較圓整且具有明顯的膜孔，12 h內(nèi)累計(jì)釋放率達(dá)95.39%，基本符合Higuchi釋藥模型，釋藥機(jī)制以Fick擴(kuò)散為主. 對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的有效殺菌質(zhì)量濃度均為2.0 g/L. 此工藝簡(jiǎn)單可行，對(duì)提高KHSO5的利用率和增加其穩(wěn)定性具有重要的意義.