趙延輝，邢 凱*，盛熙暉，齊曉龍，曹永春，崔德鳳，張永紅，倪和民，郭 勇，王楚端*

(1.北京農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193)

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是非編碼RNA重要的組成部分，其蛋白質(zhì)編碼能力很弱甚至不存在。研究表明，基因表達(dá)受到lncRNA的調(diào)控，在細(xì)胞生長及腫瘤的生成方面起著不可替代的作用[1]。隨著下一代測序(NGS)技術(shù)的應(yīng)用，lncRNA對肌肉生長和脂肪沉積的調(diào)控作用陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)[2-4]。XING等[5]以閹割和正?；茨瞎i為試驗(yàn)對象，并選取背最長肌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果顯示了8 946個(gè)lncRNA的表達(dá)受到閹割的影響，其中有385個(gè)lncRNA及其靶基因可能與骨骼、肌肉發(fā)育相關(guān)。ATKINSON等[6]通過比較脂肪型豬陸川豬和瘦肉型豬杜洛克豬脂肪組織的轉(zhuǎn)錄組，共檢測到503個(gè)差異表達(dá)的lncRNA，其中部分lncRNA可能參與了脂肪細(xì)胞因子的調(diào)控過程。HUANG等[7]對萊蕪豬和大白豬皮下脂肪組織的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了研究，檢測到54個(gè)差異表達(dá)的lncRNA，其中有6個(gè)關(guān)鍵lncRNA及其靶基因可能發(fā)揮調(diào)控脂肪沉積的作用。MIAO等[8]對金華豬和長白豬兩者之間的脂肪組織中的lncRNA進(jìn)行了鑒定，共發(fā)現(xiàn)了119個(gè)差異表達(dá)的lncRNA，同時(shí)發(fā)現(xiàn)有6個(gè)lncRNA參與相關(guān)脂肪代謝途徑，包括脂肪沉積和脂肪代謝。

松遼黑豬和長白豬在肉品質(zhì)方面差異明顯[9]。課題組前期利用高通量測序技術(shù)獲得松遼黑豬和長白豬背最長肌中差異表達(dá)的lncRNA TCONS-00035174基因[10]，為對其進(jìn)行深入研究，本試驗(yàn)對lncRNA TCONS-00035174基因進(jìn)行全長克隆并進(jìn)行分子特征分析和不同組織中表達(dá)量的比較，為以后松遼黑豬和長白豬肉品質(zhì)差異研究提供有用信息。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)樣品

瘦肉型長白豬和肥胖型松遼黑豬各6頭，飼養(yǎng)管理?xiàng)l件相同，屠宰體質(zhì)量為100 kg左右[11]。取背最長肌及心、肝、脾、肺、腎并在液氮中保存。

1.2 引 物

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序得到的TCONS-00035174基因序列，使用SnapGene軟件設(shè)計(jì)引物，分別用于熒光定量PCR、RACE末端擴(kuò)增，內(nèi)參基因引物根據(jù)Genebank提供的豬GAPDH基因序列設(shè)計(jì)(表1)。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 總RNA的提取與cDNA合成

取2種豬的不同組織樣本0.1 g于液氮研磨，使用Trizol試劑盒提取各組織總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA 純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，獲得的cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 LncRNATCONS-00035174中間片段克隆

根據(jù)高通量測序得到的TCONS-00035174基因序列設(shè)計(jì)簡并引物。使用2×Phanta? Max Master Mix試劑盒(Vazyme, 中國南京)進(jìn)行中間片段的擴(kuò)增，反應(yīng)體系：上下游引物、cDNA各2 μL， ddH2O 44 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 15 s，56～72 ℃ 15 s，72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物4 ℃保存，1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 用DNA膠回收試劑盒純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。純化產(chǎn)物送到上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.5 LncRNA TCONS-00035174基因cDNA末端片段克隆

根據(jù)測序得到的中間序列設(shè)計(jì)5′ RACE引物(5′ GSP)和3′ RACE引物(3’GSP)(表1)擴(kuò)增豬TCONS-00035174基因cDNA末端序列。按照Single Cell Full Length mRNA-Amplication Kit(Vazyme, 中國南京)說明書進(jìn)行5′ RACE和3′ RACE擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物純化、克隆及測序同1.3。

1.6 全長序列分子特征分析

將測序結(jié)果人工進(jìn)行5′和3′序列拼接, 得到最終全長序列。對豬TCONS-00035174基因進(jìn)行分子特征分析，利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列基本分析；運(yùn)用UCSC基因組瀏覽工具查詢TCONS-00035174在豬基因組中的定位；用NCBI中BLAST 程序進(jìn)行同源性比對。利用CPC和CNCI軟件預(yù)測TCONS-00035174基因的編碼能力，CPC<0和CNCI<0被認(rèn)為是非編碼基因。

1.7 LncRNA TCONS-00035174組織表達(dá)譜分析

取反轉(zhuǎn)錄出的cDNA 1 μL，使用ChamQTM Universal SYBR? qPCR Master Mix(Vazyme, 中國南京)試劑盒，進(jìn)行熒光定量分析，反應(yīng)體系：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各 0.4 μL，cDNA 1.5 μL，ddH2O 7.7 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，59 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因，樣本和內(nèi)參均設(shè)置3個(gè)平行。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用2-ΔΔCt法[12]計(jì)算TCONS-00035174基因的相對表達(dá)量，使用SPSS軟件比較兩豬種各組織表達(dá)水平差異，兩組結(jié)果之間的比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 LncRNA TCONS-00035174基因的全長cDNA序列

以長白豬肌肉組織反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，采用RACE末端擴(kuò)增方法和中間片段擴(kuò)增方法得到TCONS-00035174基因的全長序列，其片段長3 889 bp。

2.2 分子特征分析結(jié)果

UCSC分析結(jié)果表明，TCONS-00035174基因位于chr2:5 855 637～5 859 868區(qū)間。DNAMAN軟件分析結(jié)果表明，A、C、G、T含量分別為19.3%(750個(gè))、30.5%(1 186個(gè))、30.6%(1 192個(gè))、19.6%(761個(gè))，GC含量(61.1%)明顯高于AT含量(38.9%)，說明編碼區(qū)的DNA雙鏈較為穩(wěn)定。利用NCBI中BLAST 程序進(jìn)行同源性比對分析，結(jié)果顯示豬TCONS-00035174基因序列與雪貂的同源性最高，為90.71%，其次為黃牛，為90.00%，與綿羊的同源性最低，為83.78%，同源性均在83%以上，說明該基因的保守性較高(表2)。

表2 豬TCONS-00035174基因與其他物種的同源性分析

經(jīng)NCBI在線工具CDD對豬TCONS-00035174基因進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，在其序列中含有組織蛋白酶F(CTSF)結(jié)構(gòu)域和木瓜蛋白酶結(jié)果域(圖1)。CPC和CNCI軟件預(yù)測TCONS-00035174基因的編碼能力，結(jié)果顯示CPC和CNCI的數(shù)值均為負(fù)，證明TCONS-00035174基因?yàn)榉蔷幋a基因。

2.3 LncRNA TCONS-00035174組織表達(dá)情況

利用熒光定量PCR對松遼黑豬和長白豬心、肝、脾、肺、腎和肌肉組織的TCONS-00035174基因表達(dá)情況進(jìn)行研究。結(jié)果顯示TCONS-00035174基因在松遼黑豬的脾臟組織中表達(dá)最高，其次為肺和肝臟組織，心臟和肌肉中表達(dá)最低(圖2-A)；長白豬中各組織表達(dá)量最高為肺，其次為脾和肝臟組織，心臟和肌肉中表達(dá)最低(圖2-B)；在相同組織中，TCONS-00035174基因在松遼黑豬和長白豬之間的差異表達(dá)情況為：除了腎臟之外，松遼黑豬中的表達(dá)均顯著高于長白豬(圖3)。

3 結(jié)論和討論

本研究成功地克隆了豬TCONS-00035174基因的cDNA全長序列，得到長度為3 889 bp的精準(zhǔn)序列，使用NCBI數(shù)據(jù)庫對序列進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該段序雪貂的同源性最高，與其他物種同源性均在83%以上，說明該基因的保守性較高。

TCONS-00035174基因列中含有組織蛋白酶F結(jié)構(gòu)域，推測CTSF基因可能是TCONS-00035174基因的相關(guān)靶基因，通過該靶基因來調(diào)控肌肉發(fā)育。組織蛋白酶 F屬于半胱氨酸蛋白酶[12,13]，是組織蛋白酶(Cathepsins，CTS)家族的一員。CTS是一類酸性蛋白質(zhì)水解酶，可以將蛋白質(zhì)裂解為多肽(通過裂解蛋白質(zhì)肽鍵)。通常情況下，CTS主要在水解及修飾細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的過程中發(fā)揮作用，同時(shí)維護(hù)保持蛋白質(zhì)的平衡狀態(tài)。研究表明，CTS在肉的嫩化方面發(fā)揮重要作用[14]。本研究推測CTSF可能是TCONS-00035174基因的相關(guān)靶基因，且二者基因序列存在堿基互補(bǔ)配對關(guān)系，認(rèn)為TCONS-00035174可能是CTSF的反義lncRNA或者存在其他某種調(diào)控關(guān)系，TCONS-00035174基因調(diào)控CTSF的表達(dá)來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的代謝，從而影響肌肉發(fā)育過程。

本研究采用熒光定量PCR法研究了TCONS-00035174基因在不同組織表達(dá)模式，研究發(fā)現(xiàn)在心、肝、脾、肺、腎以及肌肉中均有表達(dá)。結(jié)果TCONS-00035174基因在松遼黑豬和長白豬中表達(dá)最高的組織不同，分別是脾和肺，但是表達(dá)最低的組織是相同的，均是心臟和肌肉組織。在前面試驗(yàn)中，推測TCONS-00035174可能作為CTSF的反義lncRNA來調(diào)控蛋白質(zhì)代謝，從而影響肌肉發(fā)育。

綜上所述，豬TCONS-00035174基因全長為3 889 bp，位于chr2:5 855 637～5 859 868區(qū)間，沒有編碼潛能；與雪貂的同源性最高；在松遼黑豬的脾臟組織中表達(dá)最高，在長白豬中肺臟組織中表達(dá)最高，相同組織中，除腎臟外，松遼黑豬各組織的表達(dá)量均顯著高于長白豬。研究結(jié)果為后期該基因的深入挖掘和功能研究提供幫助，為后續(xù)遺傳育種工作提供有價(jià)值參考。