王相平 紀煜航 管殿堯 韓俞爽

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，我國膀胱癌發(fā)病率及病死率均為泌尿系統(tǒng)腫瘤首位[1]。類固醇受體共激活因子3(steroid receptor co-activator 3, SRC-3)是p160類固醇受體輔助活化因子 SRC基因的家族成員, 與體內多種腫瘤的形成密切相關[2]。研究顯示，SRC-3蛋白編碼類固醇激素受體，具有激活轉錄細胞染色體片段的功能，能促進或抑制腫瘤生成，在許多生物學功能方面具有重要作用[3]。SRC-3與乳腺癌[4]、肺癌[5]、前列腺癌[6]的發(fā)生、發(fā)展密切相關，但關于其在膀胱癌中的研究仍不多。本課題組前期研究結果顯示，SRC-3在膀胱癌組織中呈明顯異常表達，并發(fā)現(xiàn)其可能參與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展，本研究擬明確膀胱癌中SRC-3的表達，并探討其作用及相關機制，現(xiàn)將結果報道如下。

材料與方法

一、一般資料

1.組織標本：收集我院2018年6月至2019年10月期間經(jīng)手術治療并病理證實為肌層浸潤性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer, MIBC)的患者40例，其中女12例，男28例，年齡45～82歲，平均年齡(65.40±5.17)歲；按WHO 2004膀胱尿路上皮癌惡性程度分級，低級別膀胱尿路上皮癌8例、高級別膀胱尿路上皮癌32例?；颊呔押炇鹬橥鈺@醫(yī)院倫理委員會批準。所有患者術前均未行放化療及雄激素抗體阻斷劑干預等抗雄性激素內分泌治療。取患者膀胱癌組織及相應的癌旁正常組織(距離癌組織2 cm以上)，置于甲醛中，-80 ℃保存。

2.細胞：膀胱癌細胞系T24、253J均購于美國模式培養(yǎng)物保藏所。

二、實驗方法

1.細胞培養(yǎng)：膀胱癌細胞系T24、253J置于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞進行細胞學功能實驗。

2.細胞轉染及分組：SRC-3重組表達質粒(pHBAd-CMV-SRC-3)、空載體對照質粒(pHBAd-CMV)及菌種委托美國Gene Copoeia公司進行構建，SRC-3-siRNA及siRNA-control購于廣州銳博生物技術有限公司。

質粒提取參照OMEGA公司產(chǎn)品質粒提取試劑盒操作說明進行。細胞轉染采用lipofectamine 2000試劑盒，嚴格按照試劑盒要求操作。

3.RT-PCR實驗：組織及細胞總RNA采用Trizol法。按照mRNA反轉錄試劑盒操作說明進行反轉錄，參照SYBR?Premix Ex Taq TM試劑盒說明進行RT-PCR檢測，按照2-[△△Ct(實驗組)-△△CT(對照組)]計算相對定量結果。

4.Western Bolt實驗：取膀胱癌組織及相應的癌旁正常組織，每例約50 mg，加入組織蛋白提取液，冰上碾磨，離心取上清液。取對數(shù)生長期細胞，加入細胞裂解液及蛋白酶抑制劑，冰上裂解，4 ℃離心取上清液收集細胞。

使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，根據(jù)標準曲線計算蛋白含量。各組以30～60 μg相同的蛋白上樣量，煮沸變性，10% SDS-PAGE 凝膠電泳、轉膜、封閉，一抗4 ℃ 孵育過夜。次日使用Tris-HCl緩沖鹽溶液洗脫一抗，37 ℃孵育二抗1 h，采用化學發(fā)光劑顯影。

5.CCK8細胞增殖實驗：調整細胞濃度5 000個/ml，96孔板每孔加入細胞懸液100 μl，每組3個復孔，常規(guī)培養(yǎng)48 h。分別于0、24、48、72 h時于每孔加入10 μl CCK8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標儀測定其在450 nm處的吸光度(OD)值，繪制細胞生長曲線。

6.細胞平板克隆實驗：調整細胞懸液以每孔1×103接種于6孔板，添加PEDF蛋白，常規(guī)培養(yǎng)。每3 d更換1次培養(yǎng)液，約10 d后，肉眼可看到細胞克隆時，4%多聚甲醛固定15 min，每孔加入1 ml 0.5%結晶紫染液染色20 min。洗去多余染液，在顯微鏡下觀察計數(shù)大于50個細胞的克隆數(shù)。

7.Transwell遷移實驗：制備5×105個/ml無血清細胞懸液，每個Transwell小室中加入200 μl細胞懸液，并在24孔板每孔對應加入600 μl完全培養(yǎng)液，將小室放入孔中，培養(yǎng)24 h后固定、染色。計數(shù)穿過微孔移到濾膜下層的細胞總數(shù)。

8.Transwell侵襲實驗：無血清培養(yǎng)液對8 mg/ml的Matrigel膠進行水化，取50 μl包被于Transwell小室底部，37 ℃靜置2 h，進行Matrigel膠預處理。其余操作同遷移實驗。

9.流式細胞凋亡實驗：細胞重懸于預冷緩沖液中制成1×106個/ml細胞懸液，取0.5 ml細胞懸液轉移至干凈離心管內，根據(jù)試劑盒要求使用細胞凋亡試劑Annexin V-FITC進行檢測，采用流式細胞儀檢測分析。

10.GST融合蛋白沉降實驗(GST-pull down)：使用Target Scan(http://www.targetscan.org)數(shù)據(jù)庫預測SRC-3下游靶基因。收集細胞提取真核表達蛋白，球珠蛋白孵育漂洗，混勻后離心，分離除雜取上清液，進行GST-pull down純化體系上樣電泳，進行Western Blot驗證。

三、統(tǒng)計學方法

應用 SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、膀胱癌及癌旁正常組織中SRC-3表達情況

與癌旁正常組織比較，膀胱癌組織中SRC-3 mRNA及蛋白呈明顯高表達(P<0.05)，組間差異有統(tǒng)計學意義。見圖1。

A：膀胱癌及癌旁正常組織中SRC-3 mRNA表達情況；B： 膀胱癌及癌旁正常組織中SRC-3蛋白表達情況圖1 膀胱癌及癌旁正常組織中SRC-3表達情況(*P<0.05)

二、SRC-3對膀胱癌細胞增殖能力的影響

膀胱癌細胞T24及253J中，與pHBAd-CMV組比較，pHBAd-CMV-SRC-3組在48、72 h時的增殖率均明顯較高(P<0.05)；與siRNA-control組比較，SRC-3-siRNA組在48、72 h時的增殖率則明顯較低(P<0.05)，組間差異有統(tǒng)計學意義。見圖2。

A:SRC-3對膀胱癌細胞T24增殖能力的影響(***P<0.001)；B:SRC-3對膀胱癌細胞253J增殖能力的影響圖2 SRC-3對膀胱癌細胞增殖能力的影響

三、SRC-3對膀胱癌細胞平板克隆形成能力的影響

與pHBAd-CMV組細胞比較，pHBAd-CMV-SRC-3組細胞克隆形成率明顯較高(P<0.05)；與SRC-3-siRNA組比較，siRNA-control組克隆形成率明顯較低(P<0.05)，組間差異有統(tǒng)計學意義。見圖3。

1：pHBAd-CMV；2：pHBAd-CMV-SRC-3；3：siRNA-control；4：SRC-3-siRNA圖3 SRC-3對膀胱癌細胞平板克隆形成能力的影響(龍膽紫染色，×40)

四、SRC-3對膀胱癌細胞遷移能力的影響

膀胱癌細胞T24及253J中，pHBAd-CMV-SRC-3組細胞遷移能力明顯優(yōu)于pHBAd-CMV組細胞(P<0.05)，SRC-3-siRNA組細胞遷移能力則明顯低于siRNA-control組細胞(P<0.05)，組間差異有統(tǒng)計學意義。見圖4。

1：pHBAd-CMV；2：pHBAd-CMV-SRC-3；3：siRNA-control；4：SRC-3-siRNA圖4 SRC-3對膀胱癌細胞遷移能力的影響(龍膽紫染色，×40)

五、 SRC-3對膀胱癌細胞侵襲能力的影響

與pHBAd-CMV組細胞比較，pHBAd-CMV-SRC-3組細胞侵襲能力明顯較高(P<0.05)，與siRNA-control組細胞比較，SRC-3-siRNA組細胞的侵襲能力則明顯降低(P<0.05)，組間差異有統(tǒng)計學意義。見圖5。

1：pHBAd-CMV；2：pHBAd-CMV-SRC-3；3：siRNA-control；4：SRC-3-siRNA圖5 SRC-3對膀胱癌細胞侵襲能力的影響(龍膽紫染色，×40)

六、SRC-3對膀胱癌細胞凋亡能力的影響

與pHBAd-CMV組比較，pHBAd-CMV-SRC-3組細胞凋亡率明顯較低(P<0.05)，與siRNA-control組比較，SRC-3-siRNA組細胞凋亡率則明顯較高(P<0.05)，組間差異有統(tǒng)計學意義。見圖6。

圖6 SRC-3對膀胱癌細胞凋亡能力的影響

七、SRC-3對膀胱癌細胞凋亡相關蛋白表達的影響

與pHBAd-CMV組比較，pHBAd-CMV-SRC-3組細胞中凋亡抑制相關蛋白Bcl-2表達水平明顯較高(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax及Caspase-3表達水平則明顯較低(P<0.05)，SRC-3-siRNA組細胞中Bcl-2蛋白表達水平明顯低于siRNA-control組(P<0.05)，Bax及Caspase-3蛋白表達水平則明顯高于siRNA-control組(P<0.05)，組間差異有統(tǒng)計學意義。見圖7。

A：過表達SRC-3影響膀胱癌細胞凋亡相關蛋白表達的條帶結果;B：沉默SRC-3影響膀胱癌細胞凋亡相關蛋白表達的條帶結果圖7 SRC-3對膀胱癌細胞凋亡相關蛋白表達的影響

八、SRC-3和CXCR4靶向作用分析

生物信息學網(wǎng)站預測結果提示，SRC-3與CXCR4 3’UTR存在結合位點。為進一步證實SRC-3與CXCR4的直接結合作用，我們進行了GST-pull down實驗，結果顯示，SRC-3與CXCR4存在直接靶向作用關系。見圖8。

圖8 SRC-3和CXCR4靶向作用分析

九、SRC-3對CXCR4蛋白表達水平的影響

與pHBAd-CMV組比較，pHBAd-CMV-SRC-3組細胞中CXCR4 蛋白表達水平明顯增高(P<0.05)，與siRNA-control 組比較，SRC-3 siRNA組細胞中CXCR4蛋白表達水平則明顯降低(P<0.05)，組間差異有統(tǒng)計學意義。見圖9。

A：過表達SRC-3影響膀胱癌細胞CXCR4蛋白表達的條帶結果;B：沉默SRC-3影響膀胱癌細胞CXCR4蛋白表達的條帶結果圖9 SRC-3對CXCR4蛋白表達水平的影響

討 論

膀胱癌的發(fā)生與多種因素相關，吸煙、職業(yè)暴露等均可誘發(fā)膀胱癌[7]。現(xiàn)已明確，腫瘤的發(fā)生與原癌基因的激活和/或抑癌基因的失活密切相關，原癌基因受致病危險因素影響激活可引起腫瘤細胞的異常增殖，致使細胞周期紊亂，從而誘發(fā)腫瘤。

核受體超家族(nuclear receptor super family, NRs)是一組配體激活的轉錄因子，其配體主要為類固醇激素，可通過在信號分子與轉錄應答間建立聯(lián)系，調控著細胞生長和分化[8]。研究表明，NRs家族不僅是核受體的共激活劑，同時也是核轉錄因子κB、GF-1等依賴性轉錄因子的共激活劑，可通過共激活核受體和其他轉錄因子，參與調控基因表達[9]。SRC-3是P160 SRC家族成員之一，可通過與細胞核受體、核因子kappa B(NF-κB)、激活蛋白-1等人體因子或蛋白結合，參與細胞內染色體重建調節(jié)以及靶基因轉錄調節(jié)[10]。研究顯示，在正常細胞中SRC-3存在限制濃度，其異常激活后可有效促進細胞的生長及增殖，從而參與細胞癌變[11]。目前已有研究指出，SRC-3可能促進MMP-9降解細胞外基質和基底膜，導致乳腺癌的浸潤及轉移[12]。另有研究發(fā)現(xiàn)，SRC-3的高表達與肝癌的疾病進展關系密切，可能成為潛在的肝癌分子標志物或治療靶點[13]。

為明確SRC-3在膀胱癌中的表達情況及作用，我們對40例膀胱癌患者的癌組織及癌旁正常組織進行檢測，結果顯示膀胱癌組織中SRC-3 mRNA及蛋白均呈明顯高表達(P<0.05)。隨后我們通過構建SRC-3過表達重組質粒以及siRNA對膀胱癌細胞系T24、253J中SRC-3的表達水平進行了干擾，擬探究SRC-3對膀胱癌細胞生物學行為能力的影響。CCK8實驗結果與平板克隆實驗結果一致，提示SRC-3參與調節(jié)膀胱癌細胞的增殖及克隆形成。細胞遷移、侵襲實驗結果進一步提示，SRC-3可促進膀胱癌細胞的遷移、侵襲。另外，過表達SRC-3可抑制膀胱癌細胞凋亡(P<0.05)，沉默SRC-3則可促進膀胱癌細胞凋亡率增加(P<0.05)，同時改善Bcl-2、Bax、Caspase-3等凋亡相關標志蛋白表達(P<0.05)，因此我們猜測SRC-3的異常表達可在一定程度上影響膀胱癌細胞的凋亡活性，參與調控腫瘤進程。

趨化因子受體CXCR4是趨化因子家族成員基質細胞衍生因子-1(stromal cell derivedfactor-1，SDF-1)，又稱趨化因子CXCL12的特異受體，主要通過與其配體 CXCL12 結合，激活下游 AKT/MAPK信號通路，調控細胞增殖、凋亡、遷移等[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌中CXCR4 表達增高，且其表達水平與腫瘤復發(fā)具有正相關關系[15]。我們結合生物信息學網(wǎng)站及高通量數(shù)據(jù)預測SRC-3與CXCR4 可能存在靶向結合關系，GST-pull down實驗結果顯示，膀胱癌中SRC-3與CXCR4存在靶向結合關系，提示SRC-3在膀胱癌中的過表達與膀胱癌細胞增殖、遷移、侵襲密切相關，其可能與SRC-3上調CXCR4表達相關。

綜上所述，SRC-3在膀胱癌中高表達，可通過靶向上調CXCR4表達，促進膀胱癌細胞的增殖、遷移、侵襲，抑制腫瘤細胞凋亡，參與膀胱癌發(fā)病進程調節(jié)。