羅玉婷，楊正艷，李 蒙，趙曼竹，溫秀杰，周 智

1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，重慶 401147；2口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401147；3重慶市高校市級口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401147；4四川省瀘州市西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科，四川瀘州646000

外胚間充質(zhì)干細(xì)胞(EMSCs)來源于顱神經(jīng)嵴，是牙齒發(fā)育的始祖細(xì)胞［1-3］。向平滑肌和成骨細(xì)胞分化的特點(diǎn)限制了它在牙發(fā)育中的應(yīng)用［4,5］。為了促使EMSCs發(fā)揮最大效能，本課題組利用顱神經(jīng)嵴細(xì)胞中高表達(dá)的p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體（p75NTR）對EMSCs進(jìn)行分選純化［6］，成功獲得p75NTR陽性EMSCs［7］，并發(fā)現(xiàn)其正向調(diào)控了EMSCs在牙發(fā)育過程中的礦化［8］。p75NTR是神經(jīng)生長因子(NGF)的低親和力受體，屬Ⅰ型跨膜腫瘤壞死受體超家族成員［9］。前期研究發(fā)現(xiàn)p75NTR可能參與牙發(fā)育初期上皮與間充質(zhì)相互作用的調(diào)控［10］。它與小鼠牙齒硬組織形成的的晝夜節(jié)律有關(guān)，其缺失會(huì)降低牙槽骨的骨量［11］。此外，它還協(xié)同參與多條信號通路調(diào)控EMSCs成骨分化［11,12］。

p75NTR可能通過改變Dlx和Msx的轉(zhuǎn)錄活性從而進(jìn)一步調(diào)控牙齒的發(fā)育，但中間信使是什么尚不清楚。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)黑色素瘤相關(guān)抗原Mage-D1可能是p75NTR參與調(diào)控的下游因子［13］。Mage-D1屬黑色素抗原蛋白家族Ⅱ型蛋白，介導(dǎo)了多種細(xì)胞生理功能，它與p75NTR的胞內(nèi)域結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用［14］，還能調(diào)控Dlx/Msx 轉(zhuǎn)錄活性［15］。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：Mage-D1 與p75NTR的組織學(xué)表達(dá)模式相近，免疫共沉淀結(jié)果也顯示隨著礦化天數(shù)增加，二者結(jié)合呈增多趨勢，礦化相關(guān)基因表達(dá)增高［16］。基于以上，我們提出p75NTR-Mage-D1-Dlx/Msx信號通路假說。本研究通過高靈敏度的鄰位連接法確證Mage-D1與活化后的p75NTR在EMSCs中的結(jié)合，使結(jié)合部位在細(xì)胞中可視化，并進(jìn)一步研究二者結(jié)合對EMSCs礦化的調(diào)控作用，以期為頜骨及牙齒發(fā)育提供新依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

SD大鼠由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)過程及動(dòng)物處死方法均經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)審查通過（201903-187）。

DMEM-F12培養(yǎng)基（Hyclone），胰酶（Hyclone），胎牛血清（Hyclone），CD44、CD90、CD29、CD146、CD105、CD45（Santa Cruz）、p75NTR抗體（Invitrogen），Mage-D1 抗體（Biorbyt），山羊抗小鼠IgG，山羊抗兔IgG，CCK-8試劑（碧云天），NGF（Peprotech），DUOLINK PLA試劑盒（Sigma），0.2%茜素紅溶液（碧云天），堿性磷酸酶顯色試劑盒（上海生工），TRIzol Reagent RNA提取試劑盒（Invitrogen），TB Green Premix EX TaqⅡ（Takara），Western blot凝膠試劑盒（康為世紀(jì)）。

1.2 方法

1.2.1 E19.5 d EMSCs培養(yǎng)及表面抗原鑒定 SD大鼠胚胎發(fā)育至第19天時(shí)處死，取出胚胎，分離上下頜，于體視顯微鏡下取出牙胚組織，置于培養(yǎng)瓶中，加入含10%FBS的DMEM-F12。置于37 ℃含5%CO2的恒溫箱中靜置貼壁培養(yǎng)，約24 h后可觀察到組織塊周圍細(xì)胞呈放射狀生長。視細(xì)胞生長情況進(jìn)行傳代。

取生長狀態(tài)良好的第3代EMSCs，胰酶消化離心后于4 ℃冰箱固定30 min，12000 r/min離心5 min，PBS清洗并重懸，稀釋為每1.5 mLEP管1×106細(xì)胞，加入CD44、CD90、CD29、CD146、CD105、CD45單克隆抗體2μL，4 ℃冰箱過夜孵育。次日加入相應(yīng)熒光二抗避光孵育2 h，清洗后加3%FBS-PBS重懸，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.2 鄰位連接法檢測Mage-D1與p75NTR在EMSCs中的結(jié)合 選擇生長良好的第3代EMSCs制備成密度為5×103/mL的懸液，接種至含細(xì)胞爬片的孔板中。4%多聚甲醛室溫于加入100 ng/mL NGF的不同時(shí)間點(diǎn)（0、2、12、24、72 h）固定，封閉，加入Mage-D1與p75NTR一抗4 ℃過夜。次日，加入PLA探針37 ℃孵育1 h，緩沖液A清洗。隨后加入連接酶溶液37 ℃反應(yīng)30 min，緩沖液A清洗。避光加入擴(kuò)增酶溶液37 ℃反應(yīng)100 min，緩沖液B清洗。干燥，DAPI染核5 min；顯微鏡分析。具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

以未加入任何干預(yù)為空白對照組（NC），實(shí)驗(yàn)組為：100 ng/mL NGF 組和SH-Mage-D1 組。即，僅使用100 ng/mL NGF刺激EMSCs，及僅加入慢病毒液干擾Mage-D1，嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定表達(dá)的EMSCs。待各組細(xì)胞匯集率達(dá)80%時(shí)按上述同樣方法進(jìn)行檢測，并比較結(jié)合強(qiáng)度的差異。

1.2.3 茜素紅及ALP染色 常規(guī)消化第3代EMSCs，以5×104/孔的密度接種于孔板中。在礦化誘導(dǎo)（配方為含10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉，50μg/mL維生素C，1×10-8mol/L地塞米松、10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基）第14天時(shí)，對各組進(jìn)行多聚甲醛固定，染色。

1.2.4 RT-PCR與Western blot檢測基因與蛋白表達(dá) 收集各組礦化誘導(dǎo)第7天后的細(xì)胞，按TRIzol說明書方法提取總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫（GAPDH）為內(nèi)參照，采用RT-PCR 檢測。所用引物均由Takara公司合成（表1）。成骨誘導(dǎo)第14天提取細(xì)胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度，以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行Western blot檢測蛋白表達(dá)情況。

表1 引物基因序列Tab.1 Primer sequence for qRT-PCR

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Graphpad Prism 8軟件統(tǒng)計(jì)分析與作圖，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，NGF刺激組與空白組，以及SH-Mage-D1與空白組間分別采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 E19.5d EMSCs的分離培養(yǎng)與表面分子鑒定

通過組織塊貼壁法成功獲得E19.5 d原代EMSCs，并培養(yǎng)至第3代E19.5 d，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，為間充質(zhì)干細(xì)胞紡錘樣形態(tài)，呈梭形或多邊形（圖1A）。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分子情況：CD44（98.0%）、CD90（98.2%）、CD29（97.7%）、CD146（97.9%）、CD105（97.8%）、CD45（0.3%）（圖1B）。

圖1 E19.5d EMSCs的分離培養(yǎng)與表面分子鑒定Fig.1 Isolation,culture and characterization of E19.5 d EMSCs.A:Primary and third-passage EMSCs (Scale bar=100 μm).B:The cells show high expressions of the MSC markers CD44,CD90,CD29,CD146 and CD105 while CD45 expression is hardly detected.

2.2 Mage-D1與p75NTR在EMSCs的結(jié)合

鄰位連接法檢測顯示隨著加入100 ng/mL NGF時(shí)間的延長Mage-D1與活化后p75NTR的結(jié)合也愈多，且大部分集中在胞漿，極少部分位于細(xì)胞核內(nèi)（圖2A）；當(dāng)慢病毒干擾Mage-D1 后二者結(jié)合也隨之減弱（圖2B），且實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度與對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2C）。

圖2 鄰位連接法檢測Mage-D1與p75NTR在EMSCs的結(jié)合Fig.2 Binding of Mage-D1 and p75NTR in the EMSCs.A:Proximity ligation assay for detecting the binding of the Mage-D1 and p75NTR in cells treated with 100 ng/mL NGF for 0,2,12,24 and 72 h (Scale bar=50 μm).B:Binding of Mage-D1 and p75NTR in the cell in the control,100 ng/mL NGF and SH-Mage-D1 groups(Scale bar=50μm);C:Quantitative analysis of PLA fluorescence signals(*P<0.05 vs NC).

2.3 茜素紅與ALP染色

對礦化誘導(dǎo)液14 d后的細(xì)胞進(jìn)行茜素紅與ALP發(fā)現(xiàn)，100 ng/mL NGF組細(xì)胞礦鹽沉積與堿性磷酸酶均最強(qiáng)，SH-Mage-D1組最弱（圖3）。

圖3 茜素紅與ALP染色Fig.3 Alizarin red staining (A) and ALP staining (B,C) of the EMSCs after 14 days of osteogenic induction(scale bar=100 μm).

2.4 RT-PCR與Western blot檢測基因與蛋白水平

RT-PCR 與Western blot 檢測ALP、Runx2、OCN、BSP、OPN、Col1、Dlx1及Msx1基因與蛋白水平發(fā)現(xiàn)，100 ng/mL NGF組的基因與蛋白表達(dá)最強(qiáng)，SH-Mage-D1組最弱，與對照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4A，4B）。

圖4 RT-PCR與Western blot檢測基因與蛋白水平Fig.4 RT-PCR(A) and Western blotting (B) for detecting ALP,Runx2,OCN,BSP,OPN,Dlx1 and Msx1expressions in the EMSCs after osteogenic induction(*P<0.05 vs NC).

3 討論

神經(jīng)嵴是脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中的暫時(shí)性結(jié)構(gòu)［17］。當(dāng)顱神經(jīng)嵴向腹外側(cè)遷移至面突中胚層后被稱為外胚間充質(zhì)。顱頜面部的大部分組織結(jié)構(gòu)都可由神經(jīng)嵴來源的外胚間充質(zhì)組織發(fā)育而來［18,19］，因此被認(rèn)為是頜面部發(fā)育的始祖細(xì)胞。

它是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的NGF低親和力受體，可發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)，不僅在整個(gè)生命過程中對神經(jīng)損傷修復(fù)，促進(jìn)細(xì)胞生長分化等過程中具有極重要作用［20］，還參與了牙齒形態(tài)形成、牙齒硬組織的礦化［21］以及牙發(fā)育初期的調(diào)控［13］。p75NTR是由胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、跨膜域和胞外結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的跨膜蛋白，其胞外結(jié)構(gòu)域可與NGF結(jié)合［22］。當(dāng)加入外源性NGF后，發(fā)現(xiàn)p75NTR敲除小鼠的成骨分化能力不如野生型小鼠，這說明NGF可激活p75NTR從而正向調(diào)控的EMSCs成骨分化［11］。本研究結(jié)果也證實(shí)，當(dāng)p75NTR被外源性NGF激活后，EMSCs的礦化能力增強(qiáng)。

p75NTR發(fā)揮生物學(xué)功能主要是靠配體類型及所激活的信號通路。因其胞內(nèi)域不具有固有的酶活性，因此依賴于與胞漿結(jié)合蛋白的相互作用來誘導(dǎo)下游效應(yīng)。Mage-D1能與多種胞內(nèi)胞外蛋白結(jié)合，并介導(dǎo)多種細(xì)胞生理功能，如凋亡［23］、轉(zhuǎn)錄［15］等。Salehi［14］發(fā)現(xiàn)，Mage-D1 可通過其同源結(jié)構(gòu)域與NGF 的另一受體TrkA競爭結(jié)合p75NTR。當(dāng)Mage-D1與p75NTR的胞內(nèi)域結(jié)合后，在下游信號傳遞中發(fā)揮直接作用或通過促進(jìn)p75NTR胞內(nèi)域的生成來介導(dǎo)生物學(xué)效應(yīng)。并且研究顯示TrkA在EMSCs和大鼠胚胎第一磨牙的發(fā)育中未見表達(dá)，因此p75NTR 失去TrkA 的競爭從而與Mage-D1結(jié)合發(fā)揮調(diào)控功能［24］。在本研究中，通過鄰位連接法檢測發(fā)現(xiàn)，當(dāng)p75NTR被活化后直接與Mage-D1結(jié)合，且發(fā)現(xiàn)二者結(jié)合信號多聚集在胞漿中，極少部分位于細(xì)胞核中。這說明，當(dāng)p75NTR被活化后，產(chǎn)生水解效應(yīng)［25］，裂解后釋放其胞內(nèi)段至胞漿內(nèi)［26］與Mage-D1結(jié)合，之后二者共同作用調(diào)節(jié)生物學(xué)功能。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，我們利用慢病毒干擾Mage-D1，當(dāng)Mage-D1表達(dá)水平的下降，p75NTR與Mage-D1結(jié)合的信號強(qiáng)度也下降，染色與基因蛋白的表達(dá)水平均降低，更加確證了p75NTR與Mage-D1在EMSCs中的結(jié)合及對EMSCs成骨分化的調(diào)控作用。

在牙齒早期發(fā)育中有許多轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，這些轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)節(jié)生長因子進(jìn)一步調(diào)控牙發(fā)育。Dlx和Msx屬于同源盒基因家族，被廣泛認(rèn)為是顱面和牙齒發(fā)育的關(guān)鍵因子［27-29］。已經(jīng)證實(shí)Mage-D1可通過自身的六肽重復(fù)序列與Dlx、Msx結(jié)合從而發(fā)揮調(diào)控作用［30,31］。在本研究中，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，Dlx1和Msx1的基因表達(dá)水平隨著p75NTR與Mage-D1結(jié)合強(qiáng)度變化而出現(xiàn)變化，并且相應(yīng)的成骨分化能力出現(xiàn)改變。這進(jìn)一步說明Mage-D1與p75NTR結(jié)合后，結(jié)合信號由胞外傳至胞內(nèi)。在胞內(nèi)，Mage-D1與Dlx/Msx家族結(jié)合，再向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移上調(diào)Dlx/Msx的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化［32］。

本研究初步驗(yàn)證了Mage-D1與p75NTR在EMSCs的結(jié)合及對礦化正向調(diào)控的作用。通過100 ng/mL NGF刺激EMSCs后，Mage-D1與p75NTR結(jié)合隨時(shí)間延長而增多，而當(dāng)慢病毒干擾Mage-D1使其表達(dá)降低后，結(jié)合也隨之降低。并且隨著結(jié)合強(qiáng)度的變化，成骨分化能力也發(fā)生改變。雖然以往研究通過免疫共沉淀初步證明了Mage-D1與p75NTR的結(jié)合，但本研究使用具有高靈敏度的鄰位連接法進(jìn)一步確證了二者的結(jié)合，并且可以直觀的觀察到Mage-D1與p75NTR結(jié)合的部位，使得結(jié)合可視化［33］。綜上所述，本研究證明Mage-D1可與活化后的p75NTR相結(jié)合，影響了Dlx/Msx的轉(zhuǎn)錄活性，從而調(diào)控EMSCs的礦化。但本研究僅從細(xì)胞水平證明二者的結(jié)合，還需借助敲除小鼠等多種研究方法驗(yàn)證p75NTR-Mage-D1-Dlx/Msx信號通路假說，以期揭示牙發(fā)育的復(fù)雜機(jī)制，為推進(jìn)牙齒組織工程化進(jìn)程提供新的科學(xué)依據(jù)。