胡雅瓊，梁 答，陳新璐，陳 琳，白 俊，李洪利，尹崇高，鐘 偉

濰坊醫(yī)學(xué)院1病理學(xué)教研室，2附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外一科//矯形骨科，3醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心，4護(hù)理學(xué)院，山東 濰坊261053

骨肉瘤是最常見于兒童和青少年患者的骨腫瘤，其特征是治療后轉(zhuǎn)移進(jìn)展和復(fù)發(fā)的高風(fēng)險(xiǎn)［1］。由于患者的生存率較低，這種疾病有效的治療管理仍然是難以捉摸的［2］。為了實(shí)現(xiàn)更有效的治療管理方案，從而提高患者的生存率，在臨床環(huán)境中為骨肉瘤的治療確定更有針對(duì)性的治療方法至關(guān)重要［3］。

miRNA是小的內(nèi)源RNA，可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)，在各種細(xì)胞和生理過程（例如細(xì)胞增殖和分化）中發(fā)揮重要作用［4-6］。據(jù)報(bào)道它們的異常表達(dá)與各種人類腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有關(guān)的功能研究已被證實(shí)［7,8］，miRNA充當(dāng)腫瘤抑制物或癌基因，并且針對(duì)miRNA的miRNA模擬物和分子已在臨床前開發(fā)中顯示出希望［9］。前期已有研究證明miR-671-5p能夠結(jié)合相關(guān)靶蛋白從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，能夠通過抑制成纖維生長(zhǎng)因子受體2阻斷人食道鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展［10］。MiR-671-5p的過表達(dá)能夠影響結(jié)腸癌的預(yù)后，并會(huì)加速結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲［11］。另外，MiR-671-5p也能夠通過結(jié)合釉叢蛋白1在抑制骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲中發(fā)揮關(guān)鍵作用［12］。但是，miR-671-5p影響骨肉瘤發(fā)展進(jìn)程的其他分子機(jī)制尚不明確。

在本研究中，我們研究了miR-671-5p在骨肉瘤中的作用，并探討了miR-671-5p與其下游靶基因SMAD3在體外的相互作用，結(jié)果表明，miR-671-5p通過結(jié)合其下游靶基因SMAD3影響骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

Lipofectamine 2000（Invitrogen），miR-671-5p上下游引物（上海生工生物工程有限公司），β-actin（ab8226）、SMAD3（ab40854）、Vimentin（ab92547）、N-cadherin（ab76001）抗體（Abcam）。

1.2 網(wǎng)上在線數(shù)據(jù)庫(kù)

NCBI在線數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中GSE28423 數(shù)據(jù)集篩選骨肉瘤細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNAs，GSE70414數(shù)據(jù)集對(duì)骨肉瘤細(xì)胞中l(wèi)og2FC>1，P<0.05 的mRNA 進(jìn)行篩選；starbase 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://starbase.sysu.edu.cn/）、miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http://mirdb.org/）、TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.targetscan.org/vert_72/）預(yù)測(cè)可能與miR-671-5p結(jié)合的hub基因。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人成骨細(xì)胞hFOB1.19，骨肉瘤細(xì)胞MG63、U2OS、Saos-2，人胚胎腎細(xì)胞HEK293T均購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所（ATCC），并按照其培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h，并在細(xì)胞達(dá)到0.70時(shí)通過Lipofectamine 2000將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞中。細(xì)胞分組為：con（轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-671-5p對(duì)照質(zhì)粒的骨肉瘤細(xì)胞）；miR-671-5p（轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-671-5p質(zhì)粒的骨肉瘤細(xì)胞）；NC（轉(zhuǎn)染過表達(dá)SMAD3對(duì)照質(zhì)粒的骨肉瘤細(xì)胞）；SMAD3（轉(zhuǎn)染過表達(dá)SMAD3質(zhì)粒的骨肉瘤細(xì)胞）；SMAD3+miR-671-5p（共轉(zhuǎn)染過表達(dá)SMAD3和過表達(dá)miR-671-5p質(zhì)粒的骨肉瘤細(xì)胞）。

1.4 qRT-PCR

TRIzol 提取各組細(xì)胞的總RNA，ReverTra AceRQpcr RT Kit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板，U6為內(nèi)參，運(yùn)行條件為95 ℃30 s、95 ℃5 s、65 ℃30 s、72 ℃30 s、循環(huán)數(shù)為35，PCR 檢測(cè)細(xì)胞中miR-671-5p的表達(dá)情況。2-△△CT計(jì)算結(jié)果。miR-671-5p上游引物為：GCGCGCATAAAGTAGAAAGC；下游引物為：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT；莖環(huán)結(jié)構(gòu)：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA CTGGATACGACAGTAGT

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)

將4×104具有不同miR-671-5p或SMAD3表達(dá)水平的骨肉瘤細(xì)胞分別接種在無(wú)FBS的MEM培養(yǎng)基中，并置于小室或鋪有Matrigel小室的上腔室中。然后，下腔注入10% FBS的MEM培養(yǎng)基。24 h后甲醇固定15 min，輕拭上室的細(xì)胞，Giemsa染色1 h，PBS清洗，吸棄PBS晾干后進(jìn)行拍照。鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野拍照，取其平均值作為最終結(jié)果。

1.6 Western blot

提取各組細(xì)胞的總蛋白，測(cè)量蛋白質(zhì)濃度，在10%SDS-PAGE凝膠上分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉，一抗4 ℃過夜，洗膜，二抗常溫孵育1 h，洗膜，顯影，曝光，分析灰度值，計(jì)算結(jié)果?？贵w配制如下：SMAD3（1∶500），Vimentin（1∶1000），N-cadherin（1∶500），β-actin（1∶1000）作為內(nèi)參。

1.7 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

HEK293T細(xì)胞接種到24孔板中，并在細(xì)胞數(shù)量達(dá)到0.70時(shí)利用Lipofectamine 2000將miR-671-5p過表達(dá)質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒、SMAD3野生型SMAD3-3’UTRWt及突變型SMAD3-3’UTR-Mut質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)24 h后，檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光素酶活性，分析相對(duì)熒光強(qiáng)度，計(jì)算結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組之間差異分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)之間的比較采用方差分析，P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MiR-671-5p在骨肉瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)

通過NCBI在線數(shù)據(jù)庫(kù)獲得數(shù)據(jù)集GSE28423，篩選出|log2FC|>4 的miRNAs 并制作熱圖（圖1A），GSE28423數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)miR-671-5p的log2FC=-4.80、P<0.05，在骨肉瘤細(xì)胞中可能發(fā)揮抑癌基因的作用。通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)在10例骨肉瘤組織中，與癌旁正常骨組織相比，骨肉瘤組織中miR-671-5p的表達(dá)明顯降低（圖1B）。因此，我們選擇miR-671-5p作為研究對(duì)象。qRTPCR結(jié)果顯示與人成骨細(xì)胞hFOB1.19相比，在骨肉瘤細(xì)胞中miR-671-5p 的表達(dá)明顯下調(diào)（圖1C）。MiR-671-5p主要參與的前10位KEGG通路，包括Wnt信號(hào)通路、癌癥通路、細(xì)胞周期等，這些通路在癌癥中都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，因此我們可以推測(cè)miR-671-5p也許參與相關(guān)通路的調(diào)控從而影響骨肉瘤的發(fā)展進(jìn)程（圖1D）。

圖1 MiR-671-5p在骨肉瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)Fig.1 MiR-671-5p expression is down-regulated in osteosarcoma tissues and cells.A:Heatmap of the differentially expressed miRNAs with |log2FC| >4 in the GSE28423;B:Expression of miR-671-5p in 10 patients with osteosarcoma (*P<0.05).C:Expression of miR-671-5p in osteosarcoma cells (*P<0.05 vs hFOB1.19 group).D:KEGG analyses of miR-671-5p.

2.2 MiR-671-5p抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲

將miR-671-5p過表達(dá)質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入骨肉瘤細(xì)胞，qRT-PCR結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，過表達(dá)miR-671-5p組中miR-671-5p表達(dá)（MG63：P<0.0001；Saos-2：P=0.0002）明顯上調(diào)（圖2A）。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，過表達(dá)miR-671-5p組穿膜細(xì)胞數(shù)（MG63：P=0.0017；Saos-2：P=0.0014）明顯減少（圖2B）。而Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，過表達(dá)miR-671-5p 組穿膜細(xì)胞數(shù)（MG63：P=0.0124；Saos-2：P<0.0001）明顯降低（圖2C）。

圖2 MiR-671-5p對(duì)骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響Fig.2 Effect of miR-671-5p overexpression on migration and invasion of osteosarcoma cells.A:Expression of miR-671-5p in different groups after transfection.B,C:Transwell assay for examining cell invasion and migration abilities in each group(scale bar=100 μm).*P<0.05.

2.3 MiR-671-5p抑制骨肉瘤細(xì)胞的EMT的發(fā)生

Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，過表達(dá)miR-671-5p 組中Vimentin（MG63：P=0.0054；Saos-2：P=0.003）和N-cadherin（MG63：P=0.0138；Saos-2：P=0.0244）的表達(dá)明顯降低（圖3）。

圖3 Western blot檢測(cè)miR-671-5p對(duì)骨肉瘤細(xì)胞EMT的影響Fig.3 Western blotting for detecting expressions of EMT-related proteins in osteosarcoma cells overexpressing miR-671-5p.

2.4 SMAD3為miR-671-5p的關(guān)鍵基因

網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)starbase、miRDB、TargetScan預(yù)測(cè)可能與miR-671-5p結(jié)合的靶蛋白取其交集并獲取hub基因，構(gòu)建degree 得分前10 位的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖（圖4A），將網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的hub 基因與骨肉瘤數(shù)據(jù)集GSE70414 中l(wèi)og2FC>1，P<0.05 的mRNA 取交集（圖4B），發(fā)現(xiàn)SMAD3既在骨肉瘤中表達(dá)上調(diào)，又與miR-671-5p 結(jié)合。Western blot 檢測(cè)在骨肉瘤細(xì)胞中SMAD3的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與人成骨細(xì)胞hFOB1.19相比，SMAD3在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào)（圖4C）。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，與con/Wt-SMAD3-3’UTR組相比，miR-671-5p/Wt-SMAD3-3’UTR組的相對(duì)熒光活性明顯降低，而con/Mut-SMAD3-3’UTR組與miR-671-5p/Mut-SMAD3-3’UTR 組則無(wú)明顯差異（圖4D）。

圖4 SMAD3為miR-671-5p的關(guān)鍵基因Fig.4 SMAD3 is a key gene for miR-671-5p.A:Protein interaction network of the top10 target genes associated with miR-671-5p;B:Venn diagram of the hub genes and GSE70414.C:Expression of SMAD3 in osteosarcoma cells (*P<0.05 vs hFOB1.19 group).D:Relative luciferase activity in different groups measured by luciferase report experiment.*P<0.05.

2.5 MiR-671-5p調(diào)控SMAD3抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲

通過Western blot發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，SMAD3組SMAD3 的表達(dá)（MG63：P=0.0006；Saos-2：P=0.0009）明顯升高，而SMAD3+miR-671-5p組SMAD3的表達(dá)（MG63：P=0.0008；Saos-2：P=0.0018）則少于SMAD3組（圖5A）。Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與NC 組相比，SMAD3 組穿膜細(xì)胞數(shù)（MG63：P=0.0006；Saos-2：P=0.0003）明顯升高，而SMAD3+miR-671-5p組的穿膜細(xì)胞 數(shù)（MG63：P=0.0018；Saos-2：P=0.0014）則少于SMAD3組（圖5B）。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，SMAD3組穿膜細(xì)胞數(shù)（MG63：P=0.0003；Saos-2：P=0.0003）明顯升高，而SMAD3+miR-671-5p組的穿膜細(xì)胞數(shù)（MG63：P=0.0003；Saos-2：P=0.0034）則少于SMAD3組。

圖5 MiR-671-5p調(diào)控SMAD3抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲Fig.5 MiR-671-5p targets SMAD3 to inhibit the invasion and metastasis of osteosarcoma cells.A:Expression of SMAD3 in osteosarcoma cells in different groups.B:Transwell assay for examining migration and invasion abilities of cells transfected with the plasmids for overexpression of SMAD3,miR-671-5p,or both.scale bar=100 μm,*P<0.05.

3 討論

骨肉瘤的診療現(xiàn)在大多基于標(biāo)準(zhǔn)的選擇診療法，包括積極的手術(shù)切除、全身化療和靶向放療［13］。本文致力于找到新的腫瘤標(biāo)志物和靶點(diǎn)治療，從而降低骨肉瘤的發(fā)展。目前有報(bào)道闡明，miRNA與骨肉瘤的化療敏感性和耐藥性有著密切相關(guān)性［14,15］。也有報(bào)道稱miRNA可能參與骨肉瘤的抗輻射并能夠降低放療的敏感性從而對(duì)其今后的治療起著非常重要的作用［16］。因此，探索miRNA的分子機(jī)制，找到新的腫瘤標(biāo)志物和靶點(diǎn)治療對(duì)降低骨肉瘤的耐化學(xué)性，提高其對(duì)化療和放療的敏感性尤為重要。本文正是以此為切入點(diǎn)，通過NCBI在線數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出在骨肉瘤中相對(duì)表達(dá)下調(diào)的miR-671-5p作為研究對(duì)象。我們通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，過表達(dá)miR-671-5p后，發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力降低，證實(shí)miR-671-5p可以作為一種抑癌基因在骨肉瘤的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮相應(yīng)的作用。前期研究表明多種miRNA的異常表達(dá)對(duì)骨肉瘤今后的發(fā)展起著至關(guān)重要的作用［17-19］。MiR-627-3p可以通過靶向PTN降低骨肉瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力［20］。這為我們探索miR-671-5p在骨肉瘤的發(fā)展進(jìn)程中如何發(fā)揮作用提供了思路。

EMT是一種可逆的細(xì)胞生物學(xué)程序，參與侵襲、血管生成和轉(zhuǎn)移相關(guān)的化療耐藥［21］。本文通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在骨肉瘤中miR-671-5p對(duì)EMT的影響。在生理EMT過程中，上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程并且失去了與基底膜的連接等上皮表型使細(xì)胞獲得了較高的遷移與侵襲能力。在腫瘤細(xì)胞中，EMT受到來(lái)自腫瘤及其微環(huán)境的刺激，如生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的異常調(diào)節(jié)，導(dǎo)致遷移和侵襲表型［22-24］。本文已經(jīng)證明過表達(dá)miR-671-5p能夠抑制EMT的發(fā)生，而通過transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)也證明miR-671-5p能夠抑制骨肉瘤的遷移和侵襲能力，這正與我們的預(yù)期結(jié)果相符合。在EMT期間，細(xì)胞間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的相互黏連作用被重塑，從而導(dǎo)致上皮細(xì)胞彼此之間以及下層基底膜之間的分離，并激活了一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄程序來(lái)促進(jìn)間充質(zhì)的命運(yùn)［25,26］。本研究通過western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-671-5p質(zhì)粒后，骨肉瘤細(xì)胞中EMT的相關(guān)標(biāo)志物Vimentin、Ncadherin的表達(dá)明顯降低，過表達(dá)miR-671-5p能抑制EMT的發(fā)生。

有文獻(xiàn)報(bào)道稱miR-139可以通過負(fù)向調(diào)控ROCK1的表達(dá)影響骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力［27］。本研究通過相應(yīng)的生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)證明miR-671-5p對(duì)骨肉瘤的遷移運(yùn)動(dòng)和侵襲能力具有一定的抑制作用，也進(jìn)一步為miRNA對(duì)骨肉瘤今后的發(fā)展提供有力依據(jù)。在本研究中，我們通過生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)SMAD3是miR-671-5p的關(guān)鍵基因，在骨肉瘤中表達(dá)上調(diào)。因此，我們把SMAD3作為后期研究對(duì)象。SMAD蛋白能夠介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）信號(hào)傳導(dǎo)，通過多種機(jī)制對(duì)TGF-β超家族信號(hào)通路產(chǎn)生抑制作用，并在腫瘤的生長(zhǎng)，侵襲和轉(zhuǎn)移中扮演著至關(guān)重要的角色［28-31］。在本研究中，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí)miR-671-5p 與SMAD3之間存在結(jié)合位點(diǎn)。通過Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究miR-671-5p與SMAD3相互作用對(duì)骨肉瘤發(fā)展進(jìn)程的影響，發(fā)現(xiàn)SMAD3可以促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)和侵襲能力，而miR-671-5p則能夠抑制這種作用。

綜上所述，我們研究發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤中miR-671-5p表達(dá)下調(diào)，抑制骨肉瘤EMT的發(fā)生，并且能夠通過負(fù)向調(diào)控SMAD3抑制骨肉瘤的遷移和侵襲能力，了解miR-671-5p 在骨肉瘤發(fā)展進(jìn)程中的作用，將為后期miR-671-5p作為骨肉瘤潛在的治療靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)，為未來(lái)骨肉瘤的治療提供新的理論依據(jù)。