★ 王瑋瑋 姜麗,2, 李冰濤,2, 翟興英 劉玉暉 徐國(guó)良,2,（.江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論分化發(fā)展研究中心 南昌 0004；2.江西省中醫(yī)病因生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 0004；.江西省中藥藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 0004）

［關(guān)鍵字］補(bǔ)陽(yáng)還五湯；動(dòng)脈粥樣硬化；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；藥效物質(zhì)基礎(chǔ)；作用機(jī)制

中醫(yī)認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）證候要素主要有血瘀、痰濁、氣虛，為本虛標(biāo)實(shí)之病，標(biāo)實(shí)為血瘀、痰濁，本虛為氣虛，初期以氣滯血瘀為主，中期以氣血虛弱是關(guān)鍵，后期則出現(xiàn)氣虛痰瘀閉阻之象，故臨床上常以補(bǔ)氣、活血藥物治療［1］。補(bǔ)陽(yáng)還五湯為益氣活血之名方，出自清代王清任所注《醫(yī)林改錯(cuò)》，全方由黃芪、當(dāng)歸尾、川芎、赤芍、桃仁、紅花、地龍組成，將大劑量補(bǔ)氣藥和活血化瘀藥配伍使用，既能提高活血化瘀的能力以祛邪，又能促使舊血排出、新血生成而扶正，繼承并豐富了中醫(yī)學(xué)的扶正祛邪、標(biāo)本兼治治療方法［2］。實(shí)驗(yàn)研究表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化模型炎癥因子［3］，抑制同型半胱氨酸所致Apo E-/-小鼠AS病變與提高緊密連接蛋白表達(dá)量［4］，下調(diào)主動(dòng)脈組織血管細(xì)胞黏附分子1 mRNA的表達(dá)與降低血脂［5］。臨床相關(guān)報(bào)道補(bǔ)陽(yáng)還五湯可降低頸動(dòng)脈粥樣硬化患者的血管阻力、頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度，動(dòng)脈粥樣硬化的患者實(shí)施治療的臨床效果非常明顯［6-7］。但是，補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療AS的藥效物質(zhì)以及作用機(jī)制仍然顯得模糊不清。Hopkins最早提出將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)用于中藥藥理學(xué)研究［8］，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從系統(tǒng)的角度展現(xiàn)中藥多成分多靶點(diǎn)間的相互聯(lián)系和作用，在不拆分中藥各成分的前提下對(duì)中藥可能的作用機(jī)制進(jìn)行分析研究，這與傳統(tǒng)中藥通過(guò)多重靶點(diǎn)對(duì)病患機(jī)體進(jìn)行整體調(diào)節(jié)的觀點(diǎn)相一致［9-10］。目前，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)補(bǔ)陽(yáng)還五湯抗動(dòng)脈粥樣硬化藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制相關(guān)報(bào)道較少，主要集中在基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)分析補(bǔ)陽(yáng)還五湯抗腦梗死、腦缺血等疾病的藥效物質(zhì)及作用機(jī)制［11-14］。因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)補(bǔ)陽(yáng)還五湯抗動(dòng)脈粥樣硬化藥效成分以及作用機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測(cè)與分析，為下一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證研究提供思路與方向。

1 材料

TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫(kù)、Pubmed（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）數(shù)據(jù)庫(kù)、Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）在線分析平臺(tái)、DisGeNET（http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu）數(shù) 據(jù) 庫(kù)、Cytoscape 3.7.1，DAVID（the database for annotation visualization and integrated discovery）在線分析平臺(tái)以及Omicshare在線作圖工具。

2 方法

2.1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯潛在活性成分的獲取 分別以“桃仁”“紅花”“赤芍”“川芎”“當(dāng)歸”“黃芪”“地龍”為檢索詞，以O(shè)B（口服生物利用度）≥30 %，Lipinski五 規(guī) 則：（1）分 子 量（molecular weight，MW）＜500 Da；（2）氫鍵受體（H-bond acceptor，HAcc）≤10；（3）氫 鍵 供 體（H-bond donor，HDon）≤5；（4）脂水分配系數(shù)的對(duì)數(shù)值（Alog P，即由軟件ACD測(cè)出的log P），-2≤Alog P≤5；（5）可旋轉(zhuǎn)鍵（RBN）≤10為過(guò)濾條件［15］。從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出7味中藥的潛在活性成分。

2.2 補(bǔ)陽(yáng)還五湯潛在活性成分藥物靶點(diǎn)的收集 利用pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)將上一步篩選出的補(bǔ)陽(yáng)還五湯各潛在活性成分都轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)的SMILES格式（canonical SMILES），將SMILES格式文件導(dǎo)入Swiss Target Prediction在線分析平臺(tái)，設(shè)置屬性為“Homo sapiens”，預(yù)測(cè)潛在活性成分靶點(diǎn)并以csv格式文件導(dǎo)出作用靶點(diǎn)。

2.3 動(dòng)脈粥樣硬化疾病靶點(diǎn)的收集 在疾病數(shù)據(jù)庫(kù)DisGeNET中輸入關(guān)鍵詞“atherosclerosis”，設(shè)置屬性為“homo sapiens”，獲得與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)靶點(diǎn)59個(gè)。

2.4 動(dòng)脈粥樣硬化疾病靶點(diǎn)與補(bǔ)陽(yáng)還五湯潛在活性成分靶點(diǎn)的映射 通過(guò)比較補(bǔ)陽(yáng)還五湯潛在活性成分作用靶點(diǎn)與動(dòng)脈粥樣硬化疾病靶點(diǎn)的共同部分，得到該湯劑治療動(dòng)脈粥樣硬化的活性靶標(biāo)。

2.5 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析 將“2.1”“2.3”項(xiàng)下獲得的藥材活性成分及活性靶標(biāo)，利用Cytoscape 3.7.1該軟件中的network analyzer插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫苑治?，如：度（degree）、介數(shù)中心度（betweenness centrality）和緊密中心度（closeness centrality）等。

2.6 GO富集分析和KEGG通路富集分析 采用在線分析工具DAVID對(duì)“2.4”項(xiàng)下的結(jié)果中的活性靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO通路分析和KEGG生物過(guò)程分析，其中GO分析中包括生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞組成（CC）和分子功能（MF）3個(gè)部分，在分析結(jié)果選擇P＜0.01的項(xiàng)目，認(rèn)為在該條件下，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯潛在活性成分的獲取結(jié)果 以“OB（口服生物利用度）≥30 %，Lipinski五規(guī)則”為篩選條件。198個(gè)成分滿足條件，可被作為的潛在活性成分用于后續(xù)研究。除地龍外，紅花、桃仁、赤芍、川芎、當(dāng)歸、黃芪6味藥材各篩選獲得潛在活性成分33、13、16、88、59、21個(gè)，6味藥材中的潛在活性成分有重合部分。

3.2 動(dòng)脈粥樣硬化疾病靶點(diǎn)與補(bǔ)陽(yáng)還五湯潛在活性成分靶點(diǎn)的映射 將“2.2”項(xiàng)下中的藥材潛在活性成分靶標(biāo)與動(dòng)脈粥樣硬化疾病靶標(biāo)交集，獲得30個(gè)相互作用靶標(biāo)。靶標(biāo)具體信息見(jiàn)表1。

表1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療AS靶點(diǎn)信息

3.3 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 利用Cytoscape 3.7.1軟件中的network analyzer插件對(duì)“3.1”“3.2”項(xiàng)下的198個(gè)藥材潛在活性成分與30個(gè)抗動(dòng)脈粥樣硬化靶標(biāo)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫苑治?，以度、介?shù)中心度和緊密中心度為依據(jù)，對(duì)活性成分和靶標(biāo)分別進(jìn)行篩選，得到3項(xiàng)數(shù)值均在平均值以上的關(guān)鍵活性成分66個(gè)和關(guān)鍵靶標(biāo)8個(gè)，拓?fù)浞治鼋Y(jié)果見(jiàn)表2-3。各藥材中的關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵作用靶標(biāo)有一定重合。同時(shí)利用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“藥材-關(guān)鍵活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，見(jiàn)圖1。

表2 補(bǔ)陽(yáng)還五湯抗動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵活性成分的網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

（續(xù)表）

表3 補(bǔ)陽(yáng)還五湯抗動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵靶標(biāo)信息及網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

圖1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯抗動(dòng)脈粥樣硬化的“藥材-關(guān)鍵活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

3.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析 為研究補(bǔ)陽(yáng)還五湯抗動(dòng)脈粥樣硬化的具體作用機(jī)制，利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)“3.2”項(xiàng)結(jié)果中的30個(gè)活性靶點(diǎn)進(jìn)行了GO分析和KEGG分析，結(jié)果如圖2和表4-5所示。

表4 GO分析結(jié)果及各項(xiàng)目關(guān)聯(lián)的基因

（續(xù)表）

表5 KEGG通路分析結(jié)果及各項(xiàng)目關(guān)聯(lián)的基因

圖2 KEGG分析富集結(jié)果高級(jí)氣泡圖

4 討論

本研究通過(guò)分析補(bǔ)陽(yáng)還五湯活性成分靶點(diǎn)與動(dòng)脈粥樣硬化疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯中的單個(gè)活性成分可以作用于多個(gè)靶點(diǎn)，多個(gè)活性成分也可以作用于同一靶點(diǎn)，這符合中藥治療的系統(tǒng)性特點(diǎn)。對(duì)補(bǔ)陽(yáng)還五湯藥材中30個(gè)的活性靶點(diǎn)進(jìn)行通路分析和黃芩素、阿魏酸等為代表的多個(gè)成分的GO富集分析，補(bǔ)陽(yáng)還五湯活性成分可能作用于動(dòng)脈粥樣硬化疾病靶點(diǎn)影響多個(gè)生物過(guò)程，如影響一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)控、ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)的正調(diào)控、脂氧合酶途徑、細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)、白三烯代謝過(guò)程、RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、細(xì)胞對(duì)腫瘤壞死因子的反應(yīng)都與已報(bào)道的AS發(fā)病機(jī)制一致，因此，該富集結(jié)果是可信的。

KEGG富集結(jié)果顯示，活性靶點(diǎn)涉及16條代謝通路，其中HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、花生四烯酸代謝等4條代謝通路與動(dòng)脈粥樣硬化及其相關(guān)疾病有關(guān)。將結(jié)果用Omicshare高級(jí)氣泡圖進(jìn)行可視化處理，Rich factor指差異表達(dá)基因中位于該pathway條目的基因數(shù)目與所有注釋基因中位于該pathway條目的基因總數(shù)的比值，Rich factor越大，表示富集的程度越大。P value的取值范圍為0～1，且越接近于0，表示富集越顯著。在圖中，點(diǎn)的大小表示富集的基因數(shù)目多少，點(diǎn)越大表示富集的基因數(shù)目越多；點(diǎn)越接近紅色表示P value越小。結(jié)果顯示，缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）的富集程度最高，富集最為顯著，該通路可能是補(bǔ)陽(yáng)還五湯抗動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵通路。已有研究表明本研究富集的4條信號(hào)通路均與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展具有緊密聯(lián)系。如：HIF是由缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）和缺氧誘導(dǎo) 因 子-1β（hypoxia inducible factor-1β，HIF-1β）組成的異源二聚體，HIF-1β在體內(nèi)可正常表達(dá)，而HIF-1α在氧含量正常的細(xì)胞中并不表達(dá)，低氧情況下才被誘導(dǎo)表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)上調(diào)，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞活化、增殖，形成新的血管，促進(jìn)AS斑塊內(nèi)炎性反應(yīng)浸潤(rùn)和平滑肌細(xì)胞增殖、遷移，亦能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的泡沫化［16］。腫 瘤 壞 死 因 子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）信號(hào)通路是重要的炎癥信號(hào)通路之一，調(diào)控炎性細(xì)胞釋放炎癥性介質(zhì)、細(xì)胞因子、趨化因子［17］，可加速AS進(jìn)程。核因子κB（nuclearfactor kappa B，NF-κB）信號(hào)通路激活后可調(diào)控其下游靶基因如促炎細(xì)胞因子（IL-1，TNF-α等）、粘附因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子等的表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)［18］；參與調(diào)控5-脂氧化激酶、12-脂氧化激酶、磷酸激酶A2、環(huán)氧化酶2等促進(jìn)LDL氧化修飾和炎性介質(zhì)產(chǎn)生；同時(shí)能夠激活下游HIF-1α基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)［19］，可見(jiàn)NF-κB信號(hào)通路可通過(guò)多環(huán)節(jié)干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程?；ㄉ南┧岽x通路主要包括環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）、脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）、細(xì)胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP）三條代謝途徑，花生四烯酸在COX代謝途徑中其代謝物TXA2/PGI2水平若失衡，會(huì)導(dǎo)致多種炎癥因子釋放，損傷血管壁、誘發(fā)血小板聚集，啟動(dòng)AS的形成［20］；在其5-LOX途徑中花生四烯酸被代謝為白三烯，尤其是LTB4，可增強(qiáng)細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）和血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1與單核/巨噬細(xì)胞膜的親和力，促使單核細(xì)胞更易黏附于血管內(nèi)皮，其次可強(qiáng)烈誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化蛋白-1的表達(dá)，使其趨化效應(yīng)放大，同時(shí)能夠上調(diào)單核/巨噬細(xì)胞膜表面氧化低密度脂蛋白受體CD36的表達(dá)，促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，促進(jìn)脂質(zhì)堆積，參與了AS斑塊的形成，增加了AS斑塊的不穩(wěn)定性［21］；近來(lái)也有較多研究發(fā)現(xiàn)在花生四烯酸CYP代謝途徑中產(chǎn)生的20-HETE可以激活NF-κB通路，上調(diào)ICAM-1、白介素-8和氧化應(yīng)激水平，促進(jìn)血管內(nèi)皮的炎癥反應(yīng)，同時(shí)還可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管新生，促進(jìn)AS生成［22］。

近年也有研究表明黃芩素對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化中的炎癥因子有著良好調(diào)節(jié)作用，通過(guò)上調(diào)G蛋白信號(hào)通路調(diào)節(jié)蛋白5（Regulator of G protein signaling 5，RGS5）信號(hào)通路,經(jīng)過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制PPARδ和NF-κB表達(dá)，在一定程度上減少了MCP-1的產(chǎn)生，從而阻斷MCP-1/CCR2表達(dá)，減少炎癥因子的表達(dá)，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞起到了保護(hù)作用，延緩了AS的進(jìn)程［23］。阿魏酸可通過(guò)抑制Ox-LDL對(duì)NF-κB的活化而抑制炎癥因子的表達(dá),從而起到對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，延緩AS發(fā)展［24］。綜合已有研究成果可以部分地驗(yàn)證本研究對(duì)補(bǔ)陽(yáng)還五湯抗動(dòng)脈粥樣硬化藥效物質(zhì)與作用機(jī)制預(yù)測(cè)結(jié)果的正確性。充分體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分、多靶標(biāo)、多通路的作用特點(diǎn)，為補(bǔ)陽(yáng)還五湯抗動(dòng)脈粥樣硬化的藥效物質(zhì)及潛在作用機(jī)制研究提供了一種新的研究思路。