徐曉麗， 羅 璋， 鐘文慧， 郝 俊， 王彥懷， 張振奎， 耿緒云

(天津市水產(chǎn)研究所， 天津 300221)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)俗名河蟹，為方蟹科(Grapsidae)絨螯蟹屬(Eriocheir)的重要經(jīng)濟(jì)甲殼品種之一，主要分布在我國(guó)東部自遼寧至福建各省的通海水域中，是傳統(tǒng)的水產(chǎn)養(yǎng)殖珍品，2019年養(yǎng)殖河蟹產(chǎn)量達(dá)到77.87萬(wàn)t[1]。河蟹養(yǎng)殖主要集中在長(zhǎng)江中下游的江蘇、湖北、安徽等地，2016年起農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大力推廣稻漁綜合種養(yǎng)，促進(jìn)了黃河以北地區(qū)河蟹養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。目前河蟹已成為華北和東北地區(qū)稻漁綜合種養(yǎng)的重要養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)品種。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，病害問(wèn)題隨之而來(lái)。2020年4—5月，天津地區(qū)引自遼寧盤(pán)錦地區(qū)的扣蟹暫養(yǎng)期間大規(guī)模發(fā)病死亡，發(fā)病率可達(dá)90%，死亡率在50%以上。病蟹的典型特征為步足關(guān)節(jié)膜處呈乳白色，圍心腔內(nèi)可見(jiàn)大量白色乳狀液體，“牛奶病”由此得名。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于中華絨螯蟹病害的研究報(bào)道并不多。楊宗英等[2-3]對(duì)中華絨螯蟹肝胰腺壞死綜合癥(水癟子病)發(fā)病原因及致病機(jī)理進(jìn)行深入研究，認(rèn)為該病為非病原性疾病，主要誘因?yàn)榫挣ヮ惖人幬飳?duì)蟹肝胰腺造成的不可逆損傷。另一種對(duì)河蟹造成嚴(yán)重危害的疾病為河蟹“顫抖病”，病原為中華絨螯蟹螺原體(Spiroplasmaeriocheiris)[4]。河蟹“牛奶病”病癥與許文軍、王印庚、黃增榮等報(bào)道的三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)“牛奶病”、“乳化病”較為相似[5-9]。許文軍等[6]從患病梭子蟹體內(nèi)分離到一種酵母菌，通過(guò)生化特性分析將其鑒定為假絲酵母(Candidaoleophila)，證實(shí)其為梭子蟹肌肉“乳化病”的病原。史海東等[10]認(rèn)為冬季暫養(yǎng)期間梭子蟹“牛奶病”的病原為假絲酵母，但8—10月高水溫期間梭子蟹“牛奶病”的病原則為血卵渦鞭蟲(chóng)(Hematodiniumsp.)，這與王印庚等[9]的報(bào)道一致，同時(shí)王印庚等還報(bào)道了一種由微孢子蟲(chóng)引起梭子蟹肌肉白濁病(也稱牙膏病)。黃增榮從患“牛奶病”的梭子蟹體內(nèi)分離到溶藻弧菌(Vibrioalginolyti-cus)、哈維氏弧菌(V.harveyi)、惡臭假單胞菌(Pseudo-monasputida)，人工感染試驗(yàn)證實(shí)3株菌均對(duì)三疣梭子蟹有明顯的致病作用[8]。王國(guó)良等[7]則認(rèn)為溶藻弧菌和葡萄牙假絲酵母(Candidalusitaniae)為梭子蟹肌肉“乳化病”的病原菌，其中溶藻弧菌為引起梭子蟹死亡的主致病病原，葡萄牙假絲酵母為繼發(fā)感染引起梭子蟹出現(xiàn)牛奶樣病變的病原。

2020年10月，馬紅麗等[11]首次報(bào)道了遼寧地區(qū)的河蟹“牛奶病”，從病蟹體內(nèi)分離到病原菌，通過(guò)浸浴感染試驗(yàn)證實(shí)其對(duì)河蟹的致病性，病原菌經(jīng)18S rRNA序列分析及部分生理生化特性鑒定為二尖梅奇酵母(Metschnikowiabicuspidate)。Bao等[12]于2021年報(bào)道了遼寧地區(qū)的河蟹“牛奶病”，通過(guò)注射感染試驗(yàn)證實(shí)其對(duì)河蟹的致病性，病原菌經(jīng)26S rRNA基因序列分析鑒定為二尖梅奇酵母，并觀察了病蟹心臟、鰓及肌肉的組織病理變化。為進(jìn)一步確定河蟹“牛奶病”的病原，本文以發(fā)病河蟹作為研究材料，分離病原，構(gòu)建了病原菌多個(gè)基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，對(duì)病原的生理生化特性進(jìn)行詳細(xì)分析，并排除其它病原的混合感染，采用不同感染方式進(jìn)一步確認(rèn)了病原菌的致病性，調(diào)研了該病的流行情況，以期為河蟹“牛奶病”的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料方法

1.1 病蟹來(lái)源

病蟹取自天津?qū)氎鎱^(qū)黃莊鎮(zhèn)、八門城鎮(zhèn)河蟹暫養(yǎng)池，平均體質(zhì)量為(8.6±0.4) g，扣蟹于2020年4月8日購(gòu)自遼寧盤(pán)錦地區(qū)，暫養(yǎng)十余天后陸續(xù)發(fā)病死亡，暫養(yǎng)密度為375～1 500 kg/hm2，暫養(yǎng)期間投喂河蟹配合飼料(蛋白含量36%，來(lái)自于沈陽(yáng)禾豐水產(chǎn)飼料有限公司)。健康蟹取自天津?qū)氎鎱^(qū)，為2019年購(gòu)自盤(pán)錦光合蟹業(yè)有限公司的大眼幼體在本地區(qū)養(yǎng)成的扣蟹，平均體質(zhì)量(7.8±0.6) g，經(jīng)檢測(cè)不攜帶特定病原后用于人工感染實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要儀器和試劑

光學(xué)顯微鏡(Olympus BX51)，掃描電子顯微鏡(HitachiSU8100)，組織切片及染色系統(tǒng)來(lái)自于Leica Biosystems。BHI培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、TCBS培養(yǎng)基等購(gòu)自青島海博生物。無(wú)維生素酵母基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)自青島日水生物技術(shù)有限公司。

1.3 病蟹初檢

活體解剖癥狀典型的瀕死河蟹，取少量組織制作水浸片鏡檢，觀察病蟹鰓、肝胰腺、肌肉中是否有寄生蟲(chóng)；抽取病蟹血淋巴涂片鏡檢；抽取河蟹圍心腔內(nèi)白色乳液涂片鏡檢，觀察是否有寄生蟲(chóng)等。另取河蟹鰓及血淋巴，以快速DNA提取檢測(cè)試劑盒(Tiangen)提取基因組DNA，采用PCR技術(shù)檢測(cè)樣品中是否攜帶中華絨螯蟹螺原體、對(duì)蝦白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)、血卵渦鞭蟲(chóng)[13-15]。

1.4 病菌分離

無(wú)菌條件下從病蟹肝胰腺、白色乳液中接菌，分別劃線接種于BHI培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、TCBS培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h以上，挑取優(yōu)勢(shì)單菌落進(jìn)一步純化，保種備用。

1.5 人工感染實(shí)驗(yàn)

挑取病原菌菌株單菌落于YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h 后，收集并洗滌菌體，采用平板傾注法計(jì)數(shù)，以無(wú)菌生理鹽水調(diào)整菌懸液密度。

分別采用注射、浸浴、飼喂3種途徑對(duì)健康河蟹進(jìn)行人工感染，感染實(shí)驗(yàn)于體積為64 cm×46 cm×39 cm、水深30 cm的塑料箱中進(jìn)行，分4組(3組實(shí)驗(yàn)組，1組對(duì)照組)，每組25尾健康河蟹，連續(xù)充氣，暫養(yǎng)7 d后進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)期間水溫21 ℃，每日換水1/3，每日按河蟹體質(zhì)量的2%投喂河蟹配合飼料。每天觀察河蟹活動(dòng)、攝食及記錄死亡數(shù)量，取瀕死蟹做病原菌分離。

注射組調(diào)整菌懸液密度為2×107CFU/mL，以第4步足底節(jié)關(guān)節(jié)膜進(jìn)行注射(50 μL/尾)。

浸浴組把體表無(wú)損傷的健康河蟹，用無(wú)菌剪刀去除1～2條步足，置于菌懸液密度為2×107CFU/mL的水體中連續(xù)浸泡3 h，轉(zhuǎn)入清水中養(yǎng)殖。

飼喂組調(diào)整菌懸液密度為2×108CFU/mL，按2×107CFU/g的量與河蟹配合飼料混合均勻，再加入生物藻膠攪拌，室溫陰干1 h后于4 ℃冰箱保存，替代河蟹基礎(chǔ)飼料每日投喂。

對(duì)照組注射等劑量的0.85%無(wú)菌鹽水。

1.6 病原鑒定

1.6.1 形態(tài)觀察 挑取純培養(yǎng)菌株，于YPD固體培養(yǎng)基上分區(qū)劃線，于28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)，革蘭氏染色觀察菌體形態(tài)。

1.6.2 生理生化特性 應(yīng)用法國(guó)生物梅里埃(Biomerieux)公司的VITEK2酵母菌鑒定卡進(jìn)行，并參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》進(jìn)行其它相關(guān)指標(biāo)測(cè)定[16]。

1.6.3 分子生物學(xué)鑒定 提取病原菌基因組DNA，采用通用引物18S1、18S2擴(kuò)增病原菌18SrRNA基因，通用引物NL-1、NL-4擴(kuò)增病原菌26SrRNA基因，通用引物ITS1、ITS4擴(kuò)增病原菌ITS基因[5,17]。PCR產(chǎn)物由生工Sangon Biotech進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序所得序列提交至GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，根據(jù)返回的結(jié)果從GeneBank中選擇同源性較高的菌株基因序列，采用Clustalx軟件比對(duì)后，分別以18S rRNA、26S rRNA、ITS為遺傳標(biāo)記，用系統(tǒng)發(fā)育分析軟件Mega X 基于鄰接法(Neighbor-joining) 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstraps 重復(fù)檢驗(yàn)1 000 次。

1.7 掃描電鏡樣品制備

取具有典型癥狀的瀕死河蟹肝胰腺及肌肉，迅速分割成1 mm3的小塊，2.5%戊二醛固定，4 ℃冰箱保存，經(jīng)脫水干燥噴金后，HitachiSU8100 掃描電子顯微鏡觀察并拍照。

1.8 河蟹“牛奶病”的流行情況調(diào)查

2020年4—10月，對(duì)天津地區(qū)養(yǎng)殖的河蟹“牛奶病”流行情況進(jìn)行調(diào)查，分別采集養(yǎng)殖扣蟹樣品15批551尾，成蟹樣品27批345尾，采用孟加拉紅培養(yǎng)基分離河蟹“牛奶病”病原，同時(shí)采用PCR技術(shù)檢測(cè)河蟹是否同時(shí)感染W(wǎng)SSV[14]。

2 結(jié)果

2.1 病蟹典型癥狀與初步檢查

患病河蟹不食，活動(dòng)力差，對(duì)外界刺激反應(yīng)慢或基本不反應(yīng)，步足散開(kāi)僵直，螯足不再緊貼于身體前緣，行動(dòng)緩慢，步足關(guān)節(jié)膜處呈白色，切斷步足，斷口處有乳白色液體流出。打開(kāi)蟹蓋，圍心腔內(nèi)蓄有大量白色乳液(見(jiàn)圖1(b))，因此養(yǎng)殖戶稱之為“牛奶病”。河蟹肝胰腺呈鮮黃色，三角瓣及心臟呈乳白色，部分河蟹鰓絲變黑，鰓水浸片發(fā)現(xiàn)鰓黏液中有大量病原菌，鰓絲排列混亂，已無(wú)正常的鰓結(jié)構(gòu)。肝胰腺、心臟等組織的水浸片鏡檢也發(fā)現(xiàn)大量病原菌，河蟹圍心腔內(nèi)白色乳液涂片觀察未見(jiàn)寄生蟲(chóng)，可見(jiàn)大量病原菌，行出芽生殖，單個(gè)或成簇存在(見(jiàn)圖2(a))。血淋巴也由藍(lán)色變?yōu)槿榘咨?見(jiàn)圖2(b))，鏡檢發(fā)現(xiàn)河蟹血細(xì)胞數(shù)量極少，視野中均為病原菌。各組織鏡檢均未發(fā)現(xiàn)微孢子蟲(chóng)及血卵渦鞭蟲(chóng)。采用PCR技術(shù)檢測(cè)收集的85尾病蟹樣品所攜帶的病原，其中19尾樣品WSSV檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，占比22.35%，未檢出螺原體及血卵渦鞭蟲(chóng)。

圖 1 對(duì)照組正常蟹(a)與發(fā)病蟹(b)的解剖照片F(xiàn)ig.1 Photographs of healthy crab(a) and diseased crab(b)

圖 2 河蟹圍心腔內(nèi)白色乳液涂片(a)與正常蟹(左)與發(fā)病蟹(右)的血淋巴(b)Fig.2 Photograph of pathogen from fresh smears of the milky liquid in crab pericardial cavity(a) and the hemolymph of healthy crab(left) and diseased crab(right)(b)

2.2 菌株的分離與致病性

無(wú)菌條件下從病蟹的肝胰腺和圍心腔內(nèi)白色乳液中劃線接菌，分別接種于不同平板培養(yǎng)基上。28 ℃培養(yǎng)24 h后，BHI、孟加拉紅平板和TCBS平板上均無(wú)菌落生長(zhǎng)，48 h后3種培養(yǎng)基上均出現(xiàn)大量形態(tài)一致的乳白色、圓形菌落，菌落濕潤(rùn)，邊緣光滑(見(jiàn)圖3(a))。挑取單菌落進(jìn)一步純化，編碼JMB-1，保種備用。

圖3 病原酵母JMB-1 的菌落(a)及菌體形態(tài)(b)Fig. 3 Photograph of colonies(a) and cells(b) of the pathogenic yeast strain JMB-1

采用純化后的菌株JMB-1進(jìn)行人工感染實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，河蟹感染后第3天各試驗(yàn)組均出現(xiàn)死亡，注射組河蟹第2天開(kāi)始不再攝食，第7天觀察到明顯的行動(dòng)反應(yīng)遲緩，第9天、第10天死亡量最大，至第14天全部死亡，累積死亡率為100%，第6天死亡的河蟹出現(xiàn)明顯的“牛奶病”癥狀，取人工感染發(fā)病蟹白色乳液涂片觀察，可見(jiàn)大量與菌株JMB-1形態(tài)一致的菌體。浸浴組河蟹第3天即開(kāi)始出現(xiàn)死亡，至14 d試驗(yàn)結(jié)束，累積死亡率為28%，初期死亡的河蟹，未表現(xiàn)出明顯的牛奶病癥狀，但從其肝胰腺中分離到的菌株菌落及菌體形態(tài)與JMB-1一致，從第9天死亡的河蟹圍心腔內(nèi)觀察到較為明顯的白色乳液。飼喂組河蟹第3天開(kāi)始出現(xiàn)死亡，攝食減少，至感染實(shí)驗(yàn)結(jié)束，累積死亡率為12%，但死亡河蟹未表現(xiàn)出明顯的牛奶病癥狀。對(duì)照組至試驗(yàn)結(jié)束，無(wú)一死亡，攝食活動(dòng)良好(見(jiàn)圖4)。

圖4 JMB-1菌株人工感染試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Results of the infection experiments of JMB-1 strain

感染試驗(yàn)結(jié)束后從飼喂組剩余河蟹(22尾)肝胰腺分離病原，其中1尾河蟹處分離到的菌株與JMB-1菌落及菌體形態(tài)相同，占比4.5%。從浸浴組剩余河蟹(18尾)肝胰腺分離病原，其中3尾河蟹處分離到的菌株與JMB-1菌落及菌體形態(tài)相同，占比16.7%。

2.3 病原菌鑒定

2.3.1 菌體形態(tài)與生化特性 挑取JMB-1單菌落于YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)48 h后培養(yǎng)液表面有菌膜，底部有白色菌體沉淀。滴片后革蘭氏染色，顯微鏡下可見(jiàn)大量形態(tài)一致的、深藍(lán)色圓形或卵圓形菌體，直徑為3～7 μm，細(xì)胞大多單個(gè)存在，多邊芽殖(見(jiàn)圖3(b))。菌株JMB-1生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，不利用硝酸鹽、檸檬酸鹽，能利用硫酸銨，不能水解尿素，重氮基藍(lán)B(DBB)反應(yīng)陰性，該菌的生理生化特征參照Barnett等[16]的《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》，與二尖梅奇酵母較為接近。

表1 菌株JMB-1與二尖梅奇酵母生化特征的比較Table 1 Comparison of physiological and chemical characteristics of strain JMB-1 and M. bicuspidata

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定 為確定菌株JMB-1 的分類位置，擴(kuò)增其18S rRNA 基因、26S rRNA 基因D1/D2區(qū)和 ITS 基因并測(cè)序。所獲得的18S rRNA基因序列為1 704 bp，26S rRNA 基因D1/D2區(qū)序列為506 bp，ITS 基因序列為360 bp，提交至GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)分別為MW793499、MW799824、MW793713。所得序列與NCBI 序列數(shù)據(jù)庫(kù)中已知酵母菌相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示所分離菌株JMB-1的3個(gè)基因與二尖梅奇酵母同源性均在98%及以上，表明其具有較近的親緣關(guān)系。分別基于酵母菌18S rRNA基因、26S rRNA基因D1/D2區(qū)序列、ITS基因序列進(jìn)行聚類分析構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，均將病原菌JMB-1與二尖梅奇酵母聚為一支(見(jiàn)圖5～7)。

圖5 酵母菌JMB-1基于18S rRNA 基因序列的聚類分析結(jié)果Fig.5 The tree of phylogenetic evolution of yeast strain JMB-1 based on the 18S rRNA sequences

結(jié)合菌株JMB-1的形態(tài)、生理生化反應(yīng)鑒定的結(jié)果，將此次河蟹“牛奶病”病原酵母 JMB-1 鑒定為二尖梅奇酵母。

圖6 酵母菌JMB-1基于26S rRNA基因序列D1/D2區(qū)的聚類分析結(jié)果Fig. 6 The tree of phylogenetic evolution of yeast strain JMB-1 based on the D1/D2 domain of 26S rRNA sequences

圖7 酵母菌JMB-1基于ITS rRNA 基因序列的聚類分析結(jié)果Fig.7 The tree of phylogenetic evolution of yeast strain JMB-1 based on the ITS rRNA sequences

2.4 掃描電鏡觀察

采用掃描電鏡觀察患病河蟹的肝胰腺和肌肉組織，結(jié)果顯示患病河蟹的肝胰腺、肌肉組織間隙中均存在大量單一的、出芽生殖的病原菌(見(jiàn)圖8)，尤其是肝胰腺，幾乎遍布整個(gè)組織，肌肉中病原菌主要存在于肌間隙及肌絲斷裂處。

圖8 患“牛奶病”中華絨螯蟹肝胰腺(a)和肌肉(b)的掃描電鏡Fig.8 Scanning electron microscope(SEM) of hepatopancreas(a) and muscle(b) of Eriocheir sinensis with milky disease

2.5 河蟹“牛奶病”流行情況調(diào)查

2020年4—10月在天津地區(qū)調(diào)查稻田養(yǎng)殖河蟹“牛奶病”流行情況，收集河蟹樣品42批，檢測(cè)二尖梅奇酵母及WSSV攜帶情況。本地養(yǎng)殖大眼幼體主要來(lái)自于天津立達(dá)海水資源開(kāi)發(fā)有限公司、遼寧盤(pán)錦光合蟹業(yè)有限公司以及遼寧盤(pán)錦其他公司，扣蟹主要來(lái)自于遼寧盤(pán)錦及天津本地(大眼幼體引自遼寧盤(pán)錦)。所收集的15批扣蟹養(yǎng)殖樣品中，未檢出二尖梅奇酵母，WSSV陽(yáng)性樣品為4批，占比26.67%，均來(lái)自遼寧盤(pán)錦；27批養(yǎng)殖成蟹樣品中，二尖梅奇酵母陽(yáng)性樣品為4批34尾，占比14.81%，陽(yáng)性個(gè)體數(shù)占比為9.86%，均為5—6月來(lái)自遼寧盤(pán)錦的扣蟹，批內(nèi)陽(yáng)性率為24.14%～40.00%，WSSV陽(yáng)性樣品為11批15尾，占比40.74%，陽(yáng)性個(gè)體數(shù)占比4.35%，批內(nèi)陽(yáng)性率為3.45%～25.00%。

3 分析與討論

有關(guān)酵母菌作為水產(chǎn)動(dòng)物病原的報(bào)道較少，徐榮彬、孫玉華等[18-19]先后報(bào)道了可感染羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)的兩種酵母菌——漢遜德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)和莫格球擬酵母菌(Torulopsismogii)；Chen等[20]的研究發(fā)現(xiàn)二尖梅奇酵母與糞腸球菌(Enterococcusfaecium)共感染導(dǎo)致了約25%的羅氏沼蝦死亡；以攜帶二尖梅奇酵母的鹵蟲(chóng)(Artemiafranciscana)飼喂大鱗大麻哈魚(yú)(Chinooksalmon)，35 d后34.5%的大鱗大麻哈魚(yú)死亡，遠(yuǎn)高于對(duì)照組(4.3%)[21]。本研究從天津地區(qū)患“牛奶病”河蟹處分離到單一病原，分別采用注射、浸浴、飼喂3種方式進(jìn)行回感試驗(yàn)，回感試驗(yàn)復(fù)現(xiàn)相同的發(fā)病癥狀，證實(shí)所分離菌株JMB-1為病原菌，能夠引起河蟹發(fā)生“牛奶狀”病變。分別擴(kuò)增菌株JMB-1的18S rRNA、26S rRNA和ITS基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示菌株JMB-1與二尖梅奇酵母聚為一支，這與馬紅麗等[11]、Bao等[12]的研究結(jié)果一致。菌株JMB-1的多項(xiàng)生理生化指標(biāo)均與Branett等[16]所述生化特性一致，但該菌在無(wú)硫胺素的培養(yǎng)基中能夠生長(zhǎng)，甚至在無(wú)維生素的酵母基礎(chǔ)培養(yǎng)基中也可生長(zhǎng)，這與Branett等[11]所述生化特性不一致，但與Wang等[17]報(bào)道的三疣梭子蟹“乳化病”病原二尖梅奇酵母WCY的生化特性一致，可能為不同地理株所致。依據(jù)菌株JMB-1的多項(xiàng)生理生化特性及多個(gè)基因的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將菌株JMB-1鑒定為二尖梅奇酵母。

為進(jìn)一步明確病原，排除其它病原的混合感染，本研究從多尾不同程度患病的河蟹中采用BHI平板劃線分菌，培養(yǎng)24 h后，無(wú)大量單一優(yōu)勢(shì)菌落生長(zhǎng)，培養(yǎng)48 h后平板上出現(xiàn)大量形態(tài)一致的乳白色菌落，經(jīng)鑒定為二尖梅奇酵母，排除弧菌或假單胞菌等細(xì)菌性病原的原發(fā)感染。在病蟹圍心腔中白色乳液及鰓水浸片中，未發(fā)現(xiàn)血卵渦鞭蟲(chóng)及微孢子蟲(chóng)，僅見(jiàn)大量形態(tài)一致、行多邊出芽生殖的酵母菌。采用PCR技術(shù)對(duì)病蟹血淋巴進(jìn)行檢測(cè)，未檢出中華絨螯蟹螺原體及血卵渦鞭蟲(chóng)，檢出WSSV陽(yáng)性樣品19例，占比22.35%，但在正常養(yǎng)殖的扣蟹及成蟹中，也有3.45%～25%的河蟹攜帶WSSV，推測(cè)WSSV與河蟹“牛奶病”并無(wú)直接關(guān)聯(lián)，排除微孢子蟲(chóng)、血卵渦鞭蟲(chóng)、中華絨螯蟹螺原體及WSSV的原發(fā)感染。二尖梅奇酵母為本次河蟹“牛奶病”分離到的唯一確定病原。

為初步探明病原的感染途徑，本研究分別采用注射、浸浴、飼喂3種方式進(jìn)行回感試驗(yàn)，其中注射組死亡率最高，14 d內(nèi)全部死亡，試驗(yàn)蟹逐漸出現(xiàn)不食，反應(yīng)遲緩，四肢僵直、步足關(guān)節(jié)膜白濁等癥狀，多數(shù)河蟹在出現(xiàn)明顯癥狀后死亡。浸浴組死亡率為28%，且第9天后的病死蟹出現(xiàn)明顯的“牛奶病”的癥狀，14 d后未死河蟹酵母菌攜帶率為16.7%，感染率相對(duì)較低，可能與河蟹血淋巴具有很強(qiáng)的凝聚能力有關(guān)，斷足后傷口血液迅速凝結(jié)、愈合，保護(hù)河蟹不受外界病原侵襲。有研究認(rèn)為該酵母菌可能先進(jìn)入河蟹腸道進(jìn)而引起全身系統(tǒng)性感染[22]，而本研究中，飼喂組死亡率為12%，且未表現(xiàn)出“牛奶病”癥狀，未死河蟹酵母菌攜帶率為4.5%，死亡率和感染率遠(yuǎn)低于浸浴組及體腔注射組，因此推測(cè)河蟹“牛奶病”的病原酵母可能是通過(guò)傷口進(jìn)入體內(nèi)。北方地區(qū)越冬時(shí)河蟹密度較高，操作不當(dāng)很容易使河蟹斷足，低溫河蟹不攝食，抗病力下降，養(yǎng)殖環(huán)境中的酵母菌進(jìn)入蟹體并隨開(kāi)放式血液循環(huán)進(jìn)入各組織，春天后隨著溫度上升，病原繁殖也加快，將蟹體作為一個(gè)培養(yǎng)基而大量繁殖，造成全身系統(tǒng)性感染?；疾『有扶w腔、心臟、肌肉、肝胰腺均發(fā)生嚴(yán)重病變，出現(xiàn)不同程度的斷裂、溶解、壞死等[11-12]。然而自然條件下病原酵母對(duì)河蟹的感染機(jī)理及傳播途徑有待進(jìn)一步研究。

據(jù)報(bào)道，河蟹“牛奶病”2018年10月首次在遼寧盤(pán)錦地區(qū)養(yǎng)殖成蟹中發(fā)生，2019年4月在該地區(qū)養(yǎng)殖扣蟹中發(fā)生，估計(jì)總體發(fā)病率為30%[11]。2020年3—5月，發(fā)病規(guī)模進(jìn)一步擴(kuò)大，江西、河北、天津、吉林、黑龍江等地購(gòu)自遼寧盤(pán)錦區(qū)的扣蟹，陸續(xù)發(fā)病。2020年5—10月，對(duì)天津地區(qū)養(yǎng)殖扣蟹及成蟹酵母菌攜帶情況調(diào)查顯示，來(lái)自天津地區(qū)或遼寧盤(pán)錦區(qū)的大眼幼體，均不攜帶酵母菌；在成蟹養(yǎng)殖中僅在2020年5月購(gòu)自于遼寧盤(pán)錦地區(qū)的4批扣蟹樣品中檢測(cè)到34尾攜帶二尖梅奇酵母，占比9.86%，批內(nèi)陽(yáng)性率為24.14%～40%，但來(lái)自于天津?qū)氎婊驅(qū)幒訁^(qū)的扣蟹并未檢測(cè)到該酵母。2020年6—10月，在天津地區(qū)稻田養(yǎng)殖扣蟹至成蟹過(guò)程中未檢出酵母菌，說(shuō)明本次河蟹“牛奶病”病原是來(lái)自于盤(pán)錦地區(qū)的越冬扣蟹。從本地區(qū)河蟹“牛奶病”的發(fā)病情況來(lái)看，發(fā)病主要集中在2020年4月中旬至5月中旬的暫養(yǎng)期間，經(jīng)長(zhǎng)途運(yùn)輸后的越冬扣蟹，在暫養(yǎng)密度高、池底淤泥較厚、有機(jī)質(zhì)豐富、投餌不足的池塘，發(fā)病率和死亡率在90%以上，河蟹互相殘傷又進(jìn)一步加劇了病原的傳播。而暫養(yǎng)條件較好的池塘死亡率約50%。2020年5月下旬河蟹進(jìn)入稻田后，即使部分河蟹攜帶病原，也未暴發(fā)“牛奶病”，推測(cè)該病的發(fā)生與病原及養(yǎng)殖環(huán)境密切相關(guān)。

目前針對(duì)水產(chǎn)真菌性病原，一般的抗菌素類藥物無(wú)作用，即便是抗真菌藥物其作用亦不顯著，且價(jià)格昂貴，也超過(guò)了對(duì)河蟹的藥物安全濃度，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中難以應(yīng)用[6]，王麟等以二尖梅奇酵母WCY為研究對(duì)象，篩選出5株能夠分泌嗜殺因子殺滅該病原菌的海洋酵母[17]，王祥紅等優(yōu)化了酵母菌生產(chǎn)嗜殺因子的最佳培養(yǎng)條件，純化后分析了其抑菌效果及特性，應(yīng)用海洋酵母嗜殺因子殺滅二尖梅奇酵母可以作為一個(gè)研究方向[5]。另有研究表明一種生物表面活性劑馬索亞內(nèi)酯在體外能夠有效殺滅病原酵母，最小抑菌濃度和最小殺菌濃度分別為0.15和0.34 mg/L，但未進(jìn)行河蟹體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，也未驗(yàn)證馬索亞內(nèi)酯在對(duì)河蟹的安全濃度[22]。從實(shí)際生產(chǎn)出發(fā)，河蟹“牛奶病”的防治應(yīng)主要從改善環(huán)境、提高河蟹抗病力入手，暫養(yǎng)期間加強(qiáng)投喂，保持良好的水質(zhì)條件，降低暫養(yǎng)密度，池塘清淤改底等措施是控制該病的關(guān)鍵。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究從患河蟹體內(nèi)分離病原菌，分別采用浸浴、注射、飼喂3種方式確認(rèn)了病原菌的致病性，排除了其它病原的混合感染，進(jìn)一步明確了河蟹“牛奶病”的病原為二尖梅奇酵母；調(diào)研了天津地區(qū)河蟹二尖梅奇酵母攜帶情況，推測(cè)“牛奶病”的發(fā)生與病原及養(yǎng)殖環(huán)境密切相關(guān)，研究結(jié)果為河蟹“牛奶病”的防治提供了參考。