李 錦，李 晶，李娜娜，陳 寧，孟 巖，潘亭亭，張蔓麗，朱 軍，田亞平 解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究部 出生缺陷防控技術(shù)研究中心，北京 00853； 四川大學(xué)華西第二醫(yī)院 國(guó)家出生缺陷監(jiān)測(cè)中心，四川成都 60000

苯丙酮尿癥(phenylketonuria，PKU)是一種常染色體隱性遺傳的氨基酸代謝病，由苯丙氨酸羥化酶(phenylalanine hydrozylase，PAH)活性的部分或完全缺失引起，會(huì)使苯丙氨酸在體內(nèi)蓄積，導(dǎo)致患兒出現(xiàn)多系統(tǒng)損害[1-3]。PAH基因編碼苯丙氨酸羥化酶，該基因突變可引起酶活性異常[1-3]。世界范圍內(nèi)，PKU發(fā)病率在性別上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但突變種類(lèi)和頻率存在明顯地域和種族差異。美國(guó)白種人新生兒PKU發(fā)病率為1∶10 000，土耳其新生兒PKU發(fā)病率為1∶2 600，為全世界最高；芬蘭和日本的新生兒PKU發(fā)病率最低，不足1∶100 000[4-6]。1985-2018年中國(guó)大陸研究顯示PKU發(fā)病率為1∶11 144～11 614，且呈現(xiàn)“北高南低”趨勢(shì)[7-13]。另外，歐美白種人PKU常見(jiàn)突變位點(diǎn)位于外顯子12和內(nèi)含子12，而中國(guó)大陸人群常見(jiàn)突變位點(diǎn)位于外顯子7、外顯子6和外顯子12。可見(jiàn)PKU致病基因PAH的高度異質(zhì)性[7-13]。突變種類(lèi)和頻率存在明顯地域和種族差異，因此針對(duì)不同地域的基因突變檢測(cè)是有必要的。PAH基因定位于常染色體12q23.2[14]。目前PAH突變數(shù)據(jù)庫(kù)中已收錄了100多種致病突變位點(diǎn)(http://www.biopku.org/pah)，突變類(lèi)型多樣，包含錯(cuò)義突變和無(wú)義突變(65.4%)、小缺失(11.2%)、剪切位點(diǎn)突變(12.8%)以及小插入(2.3%)。我國(guó)吉林、遼寧兩省PAH 基因突變情況尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本文對(duì)80例患兒進(jìn)行PAH基因1～13號(hào)外顯子及其側(cè)翼序列的一代測(cè)序，檢測(cè)到的突變位點(diǎn)在患兒家系中進(jìn)行驗(yàn)證，而后行突變位點(diǎn)分析，了解其突變特征。

對(duì)象與方法

1 研究對(duì)象 選取2016 - 2018年在吉林省婦幼保健院、長(zhǎng)春市婦幼保健院、延邊州幼保健院、松原市婦幼保健院、四平市婦幼保健院、白城市婦幼保健院、遼寧省婦幼保健院確診為苯丙酮尿癥的患兒及家系為研究對(duì)象。研究對(duì)象入選要求：1)血液及尿液標(biāo)本進(jìn)行苯丙氨酸濃度測(cè)定、血二氫蝶呤還原酶測(cè)定、BH4負(fù)荷試驗(yàn)(Phe濃度＞600 μmol/L)或Phe和BH4聯(lián)合負(fù)荷試驗(yàn)(Phe濃度 ≤ 600 μmol/L)、尿蝶呤譜分析，確認(rèn)治療前血液苯丙氨酸濃度持續(xù)高于120 μmol/L，且排除四氫生物蝶呤缺乏癥、一過(guò)性高苯丙氨酸血癥和酪氨酸血癥。2)年齡0～10歲。該實(shí)驗(yàn)已通過(guò)中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理審查，所有受試者患者及家長(zhǎng)均簽署知情同意書(shū)。對(duì)患兒進(jìn)行PAH基因1 ～ 13號(hào)外顯子及其側(cè)翼序列一代測(cè)序，檢測(cè)到的突 變位點(diǎn)在患兒家系中進(jìn)行一代測(cè)序驗(yàn)證。

2 樣本采集及DNA提取 采集患兒及父母外周靜脈血2 mL，按照QIAamp?DNA Blood Mini Kit操 作流程提取樣本基因組DNA。

3 PCR擴(kuò)增及一代測(cè)序 PAH基因1～13號(hào)外顯子區(qū)域及其側(cè)翼序列引物序列見(jiàn)表1，PCR擴(kuò)增條件及體系見(jiàn)表2，PCR產(chǎn)物純化按照OMEGA?Cycle-Pure Kit說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行純化，測(cè)序采用T hermoFisher?3500DX基因分析儀。

表1 PAH基因外顯子1～13引物序列Tab. 1 Primer sequences for PKU exons 1 - 13

表2 PCR反應(yīng)條件體系和擴(kuò)增條件Tab. 2 PCR amplification system and amplified conditions

4 突變命名及驗(yàn)證 結(jié)合BIOPKU數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.biopku.org/pah)命名已知突變點(diǎn)，新的突變點(diǎn)通過(guò)對(duì)比數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI(http://www.ncbi.nlm.nig.gov)和BIOPKU確定為新突變。新突變命名依據(jù)HGVS命名規(guī)則(http://www.hgvs.org/mutnomen)。c代表編碼蛋白的DNA序列，p代表蛋白質(zhì)序列 ，參考序列為 NM_000277.3。

5 突變位點(diǎn)的蛋白功能預(yù)測(cè) 將突變的氨基酸序列輸入到在線軟件PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2)和SIFT (http://sift.jcvi.org)，軟件自 行進(jìn)行突變位點(diǎn)的蛋白功能預(yù)測(cè)。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義。

結(jié) 果

1 該 地 區(qū)PAH基 因 突 變 頻 率 最 高 的 位 點(diǎn)為R243Q 共納入80例PKU患兒，其中男32例，女48例。我們將80例PKU患兒PAH基因外顯子1 ～ 13的一代測(cè)序序列，與GenBank cDNA(GI：209364518)進(jìn)行比對(duì)，而后對(duì)患者家系進(jìn)行突變位點(diǎn)的家系驗(yàn)證。80例患者中15例為純合子，64例為復(fù)合雜合子，1例為三個(gè)雜合子，共檢測(cè)292個(gè)等位基因(表3、表4)。結(jié)果顯示，有3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNPs)[Q232(CAA＞CAG)、V245V(GTG＞GTA)及L385L(CTG＞CTC)]；發(fā)現(xiàn)了161個(gè)突變位點(diǎn)，占292個(gè)突變等位基因的55.14%，46種突變類(lèi)型(41種集中在外顯子區(qū)域，余5種位于內(nèi)含子區(qū)域)?；颊咄蛔冾l率最高的位點(diǎn)為R243Q(15.75%)，其次為IVS11-3A＞T(4.11%)、R413P(3.42%)、IVS4-1G＞A(3.08%)、EX6-96A＞G(3.08%)、Y356*(2.74%)、R111*(2.74%)、R241C(2.4%)、R53H(1.03%)、IVS2 +19T＞C(1.03%)。余36種突變類(lèi)型突變頻率小于1%。在46種突變位點(diǎn)中，有29種為錯(cuò)義突變、7 種剪切位點(diǎn)突變、5種無(wú)義突變和5種小缺失。

表3 吉林和遼寧省80例患兒PAH基因外顯子1～13突變點(diǎn)匯總Tab. 3 PAH 1-13 exon mutations in 80 cases from Jilin and Liaoning province

表4 80例患兒PAH基因突變點(diǎn)詳表Tab. 4 Mutations identified in 80 PKU patients

2 F294S為PAH基因新發(fā)現(xiàn)的突變點(diǎn)。 我們?cè)诩?個(gè)家系樣本中發(fā)現(xiàn)了新的突變位點(diǎn)F294S(表4、圖1)，該位點(diǎn)之前未見(jiàn)報(bào)道過(guò)，其余突變位點(diǎn)均已被收錄在 PAH Mutation Analysis Consortium Database (HGMD)數(shù) 據(jù) 庫(kù) 中。依據(jù)ACMG發(fā)布的《遺傳變異分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)與指南》進(jìn)行評(píng)估。該位點(diǎn)為錯(cuò)義突變，附近的51對(duì)堿基所報(bào)道的變異有16個(gè)致病性0個(gè)良性變異，位于已知無(wú)良性變異的關(guān)鍵功能域，符合證據(jù)PM1。在gnomAD外顯子和基因庫(kù)中均未記錄該變異位點(diǎn)，人群數(shù)據(jù)庫(kù)中缺失，符合證據(jù)PM2。苯丙酮尿癥為常染色體隱形疾病，該患者確證為苯丙酮尿癥，且經(jīng)一代驗(yàn)證患者F294S突變?yōu)楦冈赐蛔?，另一突變點(diǎn)R111*為母源突變，符合證據(jù)PM3。此外，我們分別用在線軟件PolyPhen-2和SIFT進(jìn)行突變位點(diǎn)的蛋白功能預(yù)測(cè)，PolyPhen-2結(jié)果顯示為Probably Damaging(很可能損害)，Hum Var結(jié)果的分?jǐn)?shù)越接近1.0，損害的可能性就越大(圖2)；SIFT結(jié)果顯示Damaging(有害)(圖3)，符合證據(jù)PP3。該突變點(diǎn)符合3個(gè)中等(PM1、PM2、PM3)和1個(gè)支持(PP3)證據(jù)，依據(jù)指南，目前致病性評(píng)估為可能致病(likely pathogenic，LP)。

圖1 F294S一代測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果A：患兒F294S電泳結(jié)果：Exon8 c.881T > C，p.F294S，雜合突變；B：患兒父親相同位點(diǎn)一代驗(yàn)證電泳結(jié)果：Exon8 c.881T> C，p.F294S，雜合突變；C：患兒母親相同位點(diǎn)一代驗(yàn)證電泳結(jié)果，為野生型Fig.1 Sanger Sequencing results of the F294S mutation A: The electropherogram of the patient sample shows one adenine nucleotide missense mutation in a heterozygotea manner; B, C: The electropherogram of the patient's father and mother samples, respectively

圖2 PolyPhen-2對(duì)突變點(diǎn)的預(yù)測(cè)Fig.2 This mutation is predicted by PolyPhen-2

圖3 SIFT對(duì)突變點(diǎn)的預(yù)測(cè)Fig.3 This mutation is predicted by SIFT

討 論

迄今，人類(lèi)有8000余種單基因病被發(fā)現(xiàn)，其中由PAH基因突變導(dǎo)致的PKU是中國(guó)最常見(jiàn)的新生兒?jiǎn)位蜻z傳代謝病之一[15]。目前尚無(wú)方法可以根治PKU，最常見(jiàn)的方法是在新生兒篩查中做到“早發(fā)現(xiàn)早治療”，減少對(duì)患兒生長(zhǎng)發(fā)育及智力發(fā)育等方面損害。因此快速、有效、精準(zhǔn)的基因診斷對(duì)PKU患兒的盡早治療十分有意義。PAH基因的突變類(lèi)型有明顯的地域和種族差異，因此針對(duì)不同地區(qū)的PKU患兒發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)豍AH基因突變特點(diǎn)，尋找突變熱點(diǎn)，有助于患兒的早期診斷，對(duì)患兒家族的再生育有指導(dǎo)意義。

在此次檢測(cè)中，我們檢測(cè)了80例來(lái)自吉林遼寧省的PKU患兒家系，發(fā)現(xiàn)了46種突變類(lèi)型，其中R243Q突變頻率最高(15.75%)，隨后是

IVS11-3A＞T、R413P、IVS4-1G＞A和EX6-96A＞G(4.11%、3.42%、3.08%、3.08%)。歐美白種人PAH常見(jiàn)突變位點(diǎn)位于外顯子12(R408W)和內(nèi)含子12(IVS12 + 1G＞A)[16-17]；亞洲國(guó)家，伊朗突變熱點(diǎn)IVS10-11G＞A[18]，日本常見(jiàn)突變位于R413P、R243Q和R241C[19]，朝鮮主要類(lèi)型為IVS4-1G＞A和R243Q[20]，中國(guó)臺(tái)灣最常見(jiàn)的PAH突變是R241C(36%)[21]。本研究人群的突變熱點(diǎn)依然位于外顯子7(R243Q)，這也支持之前研究的結(jié)論，與前期中國(guó)大陸的突變位點(diǎn)南北差異趨勢(shì)相符，中國(guó)大陸人群常見(jiàn)突變位點(diǎn)位于外顯子7、外顯子12和外顯子6(R243Q、EX6-96A＞G、V399V、R241C、R111*、Y356*、R413 P和IVS4-1G＞A)[22-23]。但此次研究的R241C(2.4%)高于IVS7 + 2T＞A(0.34%)，與以往研究略有不同。在此前研究中R241C，R408Q和p.Y166*南方人群略高，推測(cè)可能與觀測(cè)樣本量的數(shù)目有關(guān)。在致病性突變中，與無(wú)義突變、剪切位點(diǎn)突變、小缺失、小插入和大片段缺失相比，錯(cuò)義突變?nèi)允亲畛Ｒ?jiàn)的致病突變。本組觀察到46種突變，有29種為錯(cuò)義突變，這一點(diǎn)與前期研究相符。

此外我們發(fā)現(xiàn)了PAH基因一個(gè)新的突變位點(diǎn)F294S，該位點(diǎn)未在BIOPKU數(shù)據(jù)庫(kù)中記錄。突變點(diǎn)F294S位于8號(hào)外顯子，為錯(cuò)義突變，編碼區(qū)c.881核苷酸由胸腺嘧啶(T)變?yōu)榘奏?C)，引起第294號(hào)氨基酸錯(cuò)義突變，由苯丙氨酸(phenylalanine/phethe)變?yōu)榻z氨酸(serine/ser)，該位點(diǎn)所在區(qū)域?yàn)闊o(wú)良性變異的功能域，極有可能引起苯丙氨酸羥化酶結(jié)構(gòu)改變和酶活性降低。目前我們依據(jù)ACMG發(fā)布的《遺傳變異分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)與指南》進(jìn)行評(píng)估，該位點(diǎn)為可能致病，后續(xù)隨著病例積累，如該位點(diǎn)頻率顯著高于對(duì)照，可符合證據(jù)PS4；完善功能研究表明有害作用，可符合證據(jù)PS3；已完整鑒定的致病變異有相同氨基酸改變，符合證據(jù)PS1。符合上述其中的一條，該變異致病性可上升為致病。

目前吉林、遼寧兩省PAH基因突變情況還沒(méi)有報(bào)道過(guò)。本研究只是針對(duì)PAH基因進(jìn)行一代測(cè)序檢測(cè)，顯示點(diǎn)突變、小缺失/插入/重復(fù)，對(duì)于PAH基因大片段缺失無(wú)法檢測(cè)到，可繼續(xù)補(bǔ)充MLPA檢測(cè)方法；新的突變點(diǎn)可以進(jìn)行功能驗(yàn)證。盡管PKU無(wú)法治愈，目前公認(rèn)早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療可以延緩病情進(jìn)展[24]。患兒出生后通過(guò)嚴(yán)格的飲食限制或飲食結(jié)合藥物治療，將外周血苯丙氨酸濃度控制在正常水平，不會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常[25]。綜上，本研究發(fā)現(xiàn)吉林、遼寧地區(qū)80例PKU患兒PAH基因的突變特點(diǎn)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的突變位點(diǎn)F294S，為該地區(qū)預(yù)防PKU出生缺陷提供了一定的參考。