張廣維，侯 穎，吳方麗，畢麗霞，李 爽，黨瑞杰，田蕭羽，朱 彪 火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心 口腔科，北京 00088； 首都醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)?fù)興醫(yī)院 口腔科，北京 0008； 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 口腔科，北京 0085

隨著全球人口老齡化的快速發(fā)展，老年性骨質(zhì)疏松癥患病率逐年升高，已成為嚴(yán)重威脅人類生存健康的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[1]。老年性骨質(zhì)疏松是口腔種植手術(shù)的相對(duì)禁忌，改善老年性骨質(zhì)疏松癥對(duì)于提高種植手術(shù)成功率具有重要意義[2]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone-marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨形成的重要細(xì)胞來(lái)源[3]。促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化是改善老年性骨質(zhì)疏松的重要手段。在機(jī)體衰老進(jìn)程中，BMSCs也表現(xiàn)出增殖緩慢、生長(zhǎng)停滯并喪失分化能力等特征[4]。多胺是一類廣泛分布于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的脂肪族小分子化合物，包括腐胺、精胺和精脒(Spermidine)等[5-6]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Spermidine可延長(zhǎng)老齡小鼠的壽命且具有心臟保護(hù)功能；臨床試驗(yàn)也表明，Spermidine可降低血壓并減少心血管疾病的患病率[7]。但Spermidine能否促進(jìn)衰老BMSCs成骨分化尚不清楚。因此，本研究擬探討Spermidine對(duì)衰老兔BMSCs成骨分化的影響及其作用機(jī)制，為臨床改善老年性骨質(zhì)疏松提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

1 細(xì)胞、試劑與儀器 凍存的新西蘭大白兔BMSCs(解放軍總醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室)；D-半乳糖組(D-galactose，D-gal；北京索萊寶科技有限公司)；Spermidine(美國(guó)Sigma公司)；α-MEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；MTT(國(guó)藥集團(tuán))；成骨誘導(dǎo)液(蘇州賽業(yè)生物科技有限公司)；小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；胰酶、錐蟲(chóng)藍(lán)(美國(guó)Sigma公司)；青霉素及鏈霉素(石家莊華北制藥)；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)/還原型NAD+(NADH)試劑盒(上海碧云天生物)；Sirt1抗體(貨號(hào)：Sc-15404，稀釋比例1∶300；美國(guó)Santa cruz公司)；β-actin抗體(貨號(hào)：BM0627，稀釋比例1∶200；武漢博士德生物工程有限公司)及山羊抗兔二抗(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；CD11b、CD44、CD45、CD31、CD34、CD73、CD90、CD105、CD29抗體(美國(guó)BD公司)；BCA測(cè)定試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)。Herocell 180型CO2恒溫培養(yǎng)箱(上海潤(rùn)度生物科技有限公司)；SW-CJ-1FD型生物凈化工作臺(tái)(蘇州安泰)；TD5K-Ⅱ型低速離心機(jī)(長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器)；Biophotometer核酸蛋白測(cè)定儀(德國(guó)Eppendorf公司)；CytoFLEX型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)；DYY-7C型電泳儀、DYCZ-40型轉(zhuǎn)膜儀(北京六一儀器廠)；LW300LFT型正置 熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定BMSCs表型 復(fù)蘇培養(yǎng)兔BMSCs，采用0.5%胰酶消化第3代BMSCs制成單細(xì)胞懸液備用。于BMSCs單細(xì)胞懸液中分別加入熒光標(biāo)記的抗CD11b、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105抗體[8]，4℃避光孵育30 min。PBS緩沖液洗去未結(jié)合的抗體 ，上機(jī)檢測(cè)并用FlowJo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3 NAD+/NADH比例測(cè)定 將第3代BMSCs分為3組：對(duì)照組(Vehicle，培養(yǎng)基中不加入任何藥物)，D-gal誘導(dǎo)衰老組(培養(yǎng)基中加入40 g/L D-gal誘導(dǎo)BMSCs衰老)，Spermidine組(培養(yǎng)基中加入40 g/L D-gal + 3 μmol/L Spermidine處理BMSCs)。加藥后各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)3 d，倒掉培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，每孔加入200 μL NAD+/NADH提取液，輕輕震蕩培養(yǎng)板促使細(xì)胞裂解。測(cè)定NAD+&NADH時(shí)，20 μL NAD+/NADH提取液加入90 μL現(xiàn)配的乙醇脫氫酶工作液，37℃避光孵育10 min(在無(wú)CO2的環(huán)境中操作)，再加入10 μL顯色液避光孵育30 min，于酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)吸光度值。測(cè)定NADH時(shí)，首先將NAD+/NADH提取液于60℃下水浴30 min，其余實(shí)驗(yàn)步驟同測(cè)定NAD+&NADH。N AD+/NADH=(NAD+&NADH-NADH)/NADH。

4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 將Vehicle組、Dgal誘導(dǎo)衰老組和Spermidine組細(xì)胞以1.0 × 103/孔的密度接種于96孔板，接種后連續(xù)9 d測(cè)定細(xì)胞的增殖活性。測(cè)定時(shí)，每孔加入20 μL 5% MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸出培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，置搖床上振蕩10 min，于酶標(biāo)儀492 nm處 檢測(cè)吸光值。

5 Western blot檢測(cè)Sirt1蛋白的表達(dá) 將Vehicle組、D-gal誘導(dǎo)衰老組和Spermidine組細(xì)胞成骨誘導(dǎo)7 d后檢測(cè)Sirt1的表達(dá)。以β-actin為內(nèi)參，檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)[9-10]。

6 qPCR檢 測(cè) 成 骨 相 關(guān) 基 因 的 轉(zhuǎn) 錄 表 達(dá) 將Vehicle組、D-gal誘導(dǎo)衰老組、Spermidine組、Sirt1基因沉默組(Si Sirt1，40 g/L D-gal + 3 μmol/L Spermidine + 50 nmol/L siRNA Sirt1)和基因沉默對(duì)照 組(Si Control，40 g/L D-gal + 3 μmol/L Spermidine + 50 nmol/L siRNA Control)細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后提取RNA。然后檢測(cè)Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(runt-related transcription factor 2，Runx2)、鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子(osterix，Osx)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和骨鈣素(osteocalcin，OCN)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)?；蛞镉缮虾Ｉ旯ず铣?，序列 見(jiàn)表1。

表1 成骨相關(guān)基因引物序列Tab. 1 Primer sequences of osteogenic genes

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，正態(tài)分布的計(jì)量資料以 x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，如果方差齊采用LSD法進(jìn)一步比較，如果方差不齊采用Tamhane’s T2法進(jìn)一步比較。方差齊性檢驗(yàn)采用Levene’s檢驗(yàn)，檢驗(yàn) 水準(zhǔn)α=0.1。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 體外衰老兔BMSCs細(xì)胞模型的建立 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示(圖1A)，BMSCs低表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD11b(4.84%)、CD31(1.09%)、CD34(1.23%)和CD45(3.72%)；高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29(99.0%)、CD44(99.6%)、CD73(91.9%)、CD90(99.4%)和CD105(99.5%)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們成功分離并培養(yǎng)出了兔BMSCs。細(xì)胞內(nèi)NAD+/NADH水平下降是細(xì)胞衰老的一個(gè)重要特征。圖1B顯示，與Vehicle組相比，D-gal誘導(dǎo)衰老組BMSCs細(xì)胞內(nèi)NAD+/NADH比例顯著降 低，這表明采用D-gal成功誘導(dǎo)兔BMSCs衰老。

圖1 兔BMSCs細(xì)胞衰老模型的建立A：兔BMSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物的鑒定；B：BMSCs細(xì)胞NAD+/NADH比例(aP < 0.05，vs Vehicle組；bP < 0.05，vs D-gal組)Fig.1 Cell senescence modeling of rabbit BMSCs A: Flow cytometric analysis of surface markers of rabbit BMSCs; B：NAD+/NADH (aP < 0.05, vs vehicle group; bP <0.05, vs D-gal group)

2 Spermidine對(duì)衰老BMSCs細(xì)胞增殖的影響 如圖2所示，各組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線均呈“S”形。與Vehicle組相比、D-gal誘導(dǎo)衰老組BMSCs的增殖活性顯著降低。在培養(yǎng)的第8天BMSCs的增殖活性達(dá)到峰值；Spermidine干預(yù)可顯著提高衰老B MSCs的增殖活性。

圖2 Spermidine對(duì)衰老BMSCs細(xì)胞增殖的影響(aP < 0.05, vs Vehicle組; bP < 0.05, vs D-gal組)Fig.2 Effect of spermidine on senescent BMSCs growth (aP < 0.05,vs vehicle group; bP < 0.05, vs D-gal group)

3 Spermidine對(duì)Sirt1蛋白表達(dá)的影響 如圖3所示，在成骨分化的過(guò)程中，與Vehicle組相比，D-gal誘導(dǎo)衰老組BMSCs細(xì)胞內(nèi)Sirt1蛋白的表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，而Spermidine組衰老BMSCs細(xì) 胞內(nèi)Sirt1表達(dá)有升高的趨勢(shì)。

圖3 Spermidine對(duì)衰老BMSCs細(xì)胞內(nèi)Sirt1表達(dá)的影響(aP <0.05, vs Vehicle組)Fig.3 Effect of spermidine on Sirt1 expression in senescent BMSCs(aP < 0.05, vs vehicle group)

4 Spermidine對(duì)成骨相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響 如圖4所示，在BMSCs成骨分化的過(guò)程中，與Vehicle組相比，D-gal組成骨相關(guān)基因Runx2、Osx和ALP的轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào)(P＜0.05)；而Spermidine干預(yù)可提高Runx2、Osx和ALP的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平(P＜0.05)；當(dāng)使用siRNA抑制Sirt1蛋白的表達(dá)后，Spermidine上調(diào)Runx2、Osx和A LP的轉(zhuǎn)錄表達(dá)的作用明顯減弱(P＜0.05)。

圖4 Spermidine對(duì)成骨相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響(aP < 0.05, vs Vehicle組; bP < 0.05, vs D-gal組；cP < 0.05, vs Spermidine組)Fig.4 Effect of spermidine on osteogenic gene expression (aP < 0.05, vs vehicle group; bP < 0.05, vs D-gal group, cP < 0.05, vs spermidine group)

討 論

本研究首次發(fā)現(xiàn)，Spermidine可提高衰老BMSCs細(xì)胞內(nèi)NAD+/NADH水平，促進(jìn)衰老BMSCs增殖與成骨分化。Spermidine促進(jìn)衰老BMSCs成骨分化的作用與激活Sirt1有關(guān)。

NAD+是活細(xì)胞內(nèi)糖酵解、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化等代謝途徑中脫氫酶的輔酶，具有傳遞氫和電子的功能[11]。NAD+廣泛參與機(jī)體物質(zhì)與能量代謝、DNA損傷修復(fù)等生理或病理過(guò)程的調(diào)節(jié)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，衰老BMSCs細(xì)胞內(nèi)的NAD+/NADH比例下降，而Spermidine可提高細(xì)胞內(nèi)NAD+/NADH水平。同時(shí)，NAD+也是多種NAD+依賴性水解酶的底物，如Sirt1與CD38等[13]。細(xì)胞內(nèi)NAD+/NADH比例升高可激活Sirt1。Sirt1這種NAD+依賴性的去乙?；冈谒ダ系倪^(guò)程中表達(dá)下調(diào)，而且Sirt1是抗衰老的關(guān)鍵酶之一[14]，激活Sirt1可改善高脂飲食小鼠的壽命并提高其生活質(zhì)量[15]。本研究在發(fā)現(xiàn)Spermidine可提高衰老BMSCs細(xì)胞內(nèi)NAD+/NADH水平的基礎(chǔ)上進(jìn)一步證實(shí)Spermidine可在某種程度上恢復(fù)衰老細(xì)胞內(nèi)Sirt1蛋白的表達(dá)水平。

增殖能力下降是細(xì)胞衰老的一個(gè)主要表型[16]。本研究顯示，D-gal誘導(dǎo)衰老后BMSCs增殖能力顯著下降，而Spermidine可提高衰老BMSCs的增殖能力。既往研究也發(fā)現(xiàn)，采用多胺合成的限速酶鳥(niǎo)氨酸脫羧酶抑制劑α-二氟甲基鳥(niǎo)氨酸降低細(xì)胞內(nèi)的腐胺和Spermidine水平后，BMSCs的增殖能力顯著下降[17]，這與本研究中MTT檢測(cè)BMSCs增殖活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。成骨分化能力下降是BMSCs衰老的另一個(gè)重要表型[18]。本研究qPCR結(jié)果顯示，D-gal誘導(dǎo)后BMSCs成骨分化能力減弱，而Spermidine可提高衰老BMSCs的成骨分化能力。且抑制Sirt1后，Spermidine提高衰老BMSCs成骨分化能力的作用明顯減弱，說(shuō)明Spermidine提高衰老BMSCs成骨分化的能力部分是通過(guò)激活Sirt1實(shí)現(xiàn)的。

D-gal是一種廣泛存在于水果和蔬菜中的單糖，在衰老研究中被用于誘導(dǎo)衰老[19]。文獻(xiàn)報(bào)道，D-gal誘導(dǎo)衰老的主要機(jī)制是誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激損傷[4,20-21]。但本研究未進(jìn)一步驗(yàn)證Spermidine提高衰老BMSCs成骨分化的能力是否與緩解細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，這是本研究的一個(gè)局限。氧化應(yīng)激損傷在Spermidine提高衰老BMSCs成骨分化能力中的作用值得深入探討。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Spermidine可在體外提高衰老BMSCs的成骨分化能力，且這種作用與激活Sirt1有關(guān)。