劉旭明，尚天甜，彭淑珍，魯強生，曾巧英*，彭婕*

(1. 甘肅農業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070；2. 蘭州市獸醫(yī)中心，甘肅 蘭州 730030)

由傳染性病原體引起的乳房炎被認為是奶牛的一種破壞性疾病，表現(xiàn)為乳汁發(fā)生理化性質及細胞學特性的改變，以及乳腺組織發(fā)生病理學變化，最終降低奶牛生產(chǎn)性能，給奶業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1-2]。無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)為蘭氏分群B群鏈球菌(group B streptococcus，GBS)，是引起奶牛乳房炎的主要病原之一，也是一種能夠引起人和其他動物發(fā)生嚴重感染的病原菌[3]。近些年，構建乳房炎模型成為研究相關致病機制的一個重要方向，若直接使用奶牛作為試驗動物，其成本較高，管控較復雜，因此，用小鼠構建乳房炎模型愈來愈成為研究熱點[4]。相對于奶牛，小鼠具有體積小、易操控、成本低等特點。本研究旨在分離并鑒定致病性無乳鏈球菌并構建小鼠乳房炎模型，為進一步研究該菌致乳房炎的相關致病機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

昆明系孕鼠購買于中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所。無乳鏈球菌參考株ATCC 13813、藥敏試驗質控菌株金黃色葡萄球菌ATCC 25923由本實驗室保存。無菌脫纖維綿羊血、瓊脂粉末購自北京索萊寶科技有限公司，PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)購自TaKaRa公司，AceQ?qPCR SYBR Green Master mix、2×TaqPlusMasterMix(Dye Plus)購自諾唯贊生物科技股份有限公司，胰酪大豆胨粉末(TSB)購自BD公司。藥敏試紙及生化反應管均購自杭州濱和微生物試劑有限公司，TRIzol?Reagent購自Ambion公司，分析純甲醛溶液、分析純無水乙醇溶液購自天津市百世化工有限公司。

1.2 無乳鏈球菌分離鑒定

1.2.1 奶樣采集

觀察奶牛健康狀況、乳房情況，同時與廠區(qū)奶工溝通，采集患有乳房炎的奶牛乳汁。分別對奶牛乳房4個乳區(qū)進行消毒，棄去前3把牛乳，用無菌試管接取5～10 mL乳汁，并做好標記。

1.2.2 細菌的分離鑒定

取奶樣20 μL涂布于含5%綿羊血TSB瓊脂平板，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，挑取不同形態(tài)菌落劃線于TSB瓊脂平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，挑取單菌落經(jīng)革蘭染色后鏡檢。鏡檢純一的菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基，220 r/min培養(yǎng)過夜，4 ℃保存。

1.2.3 生化鑒定

對分離菌株進行40%膽汁、七葉苷、MR試驗、VP試驗、硝酸鹽還原試驗、蕈糖、乳糖、棉子糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、阿拉伯糖、山梨醇等15種生化試驗，根據(jù)細菌微量生化反應管說明書，將已純化的菌落接種于生化反應管，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結果并記錄。CAMP試驗：在5% TSB血瓊脂平板兩側以金黃色葡萄球菌作一橫線接種，垂直處用被檢菌接種1條線，兩線不能相交，同時做一陰性對照。

觸酶試驗：取一干凈載玻片，加1滴3% H2O2于載玻片中央，用接種環(huán)挑一單菌置于3% H2O2，觀察有無氣泡產(chǎn)生。

1.2.4 細菌16S rDNA PCR擴增鑒定

挑取已純化單菌落于TSB液體培養(yǎng)基，37 ℃ 220 r/min培養(yǎng)過夜，取50 μL細菌液體培養(yǎng)物煮沸后，以此為模板，利用引物對UNI-16s-seqF：CVACGATVCVTAGCYGRYCTG，UNI-16s-seqR：ACGGYTACCTTGTTACGACT進行PCR擴增，PCR條件為:94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 20 s，30個循環(huán)；72 ℃終末延伸5 min。取4 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，目的條帶大小為1 237 bp，將PCR產(chǎn)物送至金唯智生物科技有限公司測序。測序結果提交NCBI中BLAST軟件比對，確定細菌種屬。

1.2.5 藥敏檢測

參照 Kirby-Baueer 氏法，將分離純化得到的菌株進行藥敏試驗，以金黃色葡萄球菌ATCC 25923為質控菌株，取20 μL細菌液體培養(yǎng)物涂布于TSB瓊脂，靜置5 min，用鑷子取藥敏紙片貼于平板，輕壓使其固定，37 ℃倒置培養(yǎng)16 h，測量抑菌圈直徑，做好相應數(shù)據(jù)記錄。判定標準：抑菌環(huán)直徑≥20 mm為高度敏感，15 mm ≤抑菌環(huán)直徑<20 mm為中度敏感， 抑菌環(huán)直徑<15 mm為耐藥[5]。具體藥敏試紙種類及濃度見表1。

表1 藥敏試紙種類及濃度

1.3 乳房炎模型的構建

1.3.1 人工感染

將產(chǎn)后7～10 d小鼠隨機分為空白組，陰性對照組， HZ-032感染組和ATCC13813感染組，每組3只。攻毒前1～2 h隔開母鼠與仔鼠，使得母鼠乳房充盈，母鼠麻醉后經(jīng)乳腺管于第四對乳腺分別注射104CFU菌懸液；陰性對照組注射相同體積的無菌PBS；空白組不做處理。

1.3.2 病料采集與處理

攻毒48 h后將小鼠經(jīng)安樂法處死，剝離乳腺組織，一側固定于10%中性甲醛，送至武漢賽維爾生物科技有限公司進行HE染色組織切片制備，另一側分別保存于無菌PBS和TRIzol試劑，用于檢測乳腺組織內細菌載量及炎性因子表達量。

1.3.3 乳腺組織中載菌量測定

稱取0.1 g乳腺組織，加入0.9 mL無菌PBS，組織勻漿后梯度稀釋，每個梯度各吸取100 μL懸液涂布于TSB瓊脂平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，菌落計數(shù)計算乳腺組織中細菌載量。

1.3.4 熒光定量PCR檢測炎性因子

根據(jù)NCBI公布的參考序列，利用軟件Primer 5.0設計熒光定量PCR引物，引物序列見表2。用TRIzol法提取乳腺組織RNA[6]，使用PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒對提取的RNA進行反轉錄獲得cDNA。使用AceQ?qPCR SYBR?Green Master mix(High ROX Premixed)熒光定量PCR試劑盒，采用兩步法進行熒光定量PCR檢測乳腺組織中炎性因子IL-1α、IL-10、IL-6及TNF-α的表達量，結果用2-ΔΔCt值表示。

表2 熒光定量PCR引物序列

2 結果

2.1 菌落特征及染色特性

乳樣劃線接種于含5%綿羊血的TSB瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)基表面可見乳白色，圓形光滑菌落，β溶血(圖1)。革蘭染色鏡檢可觀察到以短、長鏈排列的革蘭陽性球菌(圖2)。將分離菌株命名為HZ-032。

圖1 HZ-032在血平板上生長的菌落特征

圖2 HZ-032染色鏡檢(革蘭染色，1 000×)

2.2 生化試驗

挑取純化后的單菌落接種于生化反應管，37 ℃，24 h后根據(jù)說明書判定菌株生化特性。由表3可以看出，HZ-032菌株40%膽汁、MR、蕈糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、馬尿酸鹽、觸酶試驗呈陽性，七葉苷、VP、棉子糖、阿拉伯糖、山梨醇、硝酸鹽還原試驗為陰性；ATCC13813菌株40%膽汁、MR、觸酶試驗、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、馬尿酸鹽試驗呈陽性，七葉苷、VP、蕈糖、棉子糖、蔗糖、阿拉伯糖、山梨醇、硝酸鹽還原試驗為陰性。CAMP試驗可見HZ-032(圖3)、ATCC 13813(圖4)在與金黃色葡萄球菌交界處出現(xiàn)明顯的矢狀溶血。綜上生化鑒定結果，HZ-032符合鏈球菌特征性生化反應，疑似無乳鏈球菌。

A，B. 金黃色葡萄球菌；C. HZ-032；D. 陰性對照

A，B. 金黃色葡萄球菌；C. ATCC 13813；D. 陰性對照

表3 生化試驗

2.3 細菌16S rDNA PCR檢測

使用16S rDNA通用引物對分離菌株基因組進行PCR擴增，有條帶的 PCR產(chǎn)物送至金唯智生物科技有限公司進行測序，測序結果提交NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，結果顯示分離菌株為無乳鏈球菌。根據(jù)測序結果，利用MegAlign軟件繪制分離株HZ-032親源關系圖。由圖5可見，菌株HZ-032與無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)(GenBank登錄號：NZ_LR134512)處于同一分支。

?本研究分離菌株

2.4 藥敏檢測

選取林可霉素、四環(huán)素、慶大霉素、萬古霉素等10種抗生素，采用紙片擴散法進行藥敏試驗，結果(表4)顯示，質控菌株ATCC25923僅對慶大霉素及萬古霉素表現(xiàn)中度敏感，其余均表現(xiàn)高度敏感；HZ-032僅對慶大霉素表現(xiàn)出中度敏感，而對其余9種抗生素均表現(xiàn)高度敏感；參考株ATCC13813對慶大霉素及萬古霉素表現(xiàn)中度敏感，其余均表現(xiàn)高度敏感。

表4 藥敏試驗 mm

2.5 小鼠感染后臨床癥狀

小鼠經(jīng)乳頭感染，空白組和陰性對照組小鼠精神活躍，被毛光滑，采食、飲水較頻繁；HZ-032和ATCC13813處理組小鼠表現(xiàn)反應遲鈍，被毛凌亂，采食、飲水次數(shù)減少，乳頭周圍未表現(xiàn)出明顯癥狀。

2.6 小鼠乳腺組織細菌載量測定

稱取0.1 g乳腺組織勻漿后倍比稀釋，涂布于TSB瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，對乳腺組織內細菌含量進行計數(shù)，計算1g乳腺組織載菌量，使用軟件GraphPad Prism8繪制柱狀圖并進行顯著性分析。結果顯示，空白組和陰性對照組未檢測到細菌，而HZ-032和ATCC13813處理組細菌載量達1010CFU/g左右(圖6)。

注：****表示P<0.000 1。下同

2.7 病理變化及組織切片觀察

剖檢小鼠過程中可觀察到空白組、陰性對照組乳腺組織均呈乳白色，并伴有大量乳汁，未觀察到病理變化；處理組乳腺組織呈暗黃色，出血，乳汁減少(圖7)。組織切片結果顯示，空白組、陰性對照組乳腺組織結構完整，腺泡界限清晰，腺泡內含有乳汁；處理組乳腺腺泡無明顯邊界，充滿大量中性粒細胞，腺泡上皮出現(xiàn)脫落、壞死(圖8)。

1，2．乳汁；3，4．出血

1，2．乳汁；3，5．中性粒細胞；4．腺泡上皮脫落、壞死

2.8 小鼠乳腺組織炎癥因子表達量檢測

TRIzol法提取不同處理組小鼠乳腺組織RNA，反轉錄獲得cDNA，通過熒光定量PCR檢測乳腺組織中IL-1α、IL-6、IL-10、TNF-α等4種炎性因子的表達量。使用軟件GraphPad Prism8繪制柱狀圖并進行顯著性分析。結果表明，HZ-032和ATCC13813感染組IL-1α、IL-10、TNF-α表達量較陰性對照組及空白組均顯著升高，HZ-032感染組IL-6水平明顯高于其他各組(圖9)。

注：*表示P<0.05，***表示P<0.001，ns表示P>0.05

3 討論

奶牛乳房炎的發(fā)展可分為病原體入侵機體、感染和產(chǎn)生炎性反應3個階段，當乳頭接觸到來自受感染乳腺牛奶中的細菌時，這些病原菌會以傳染性的方式在奶牛中傳播[7]。盡管許多細菌被認為能夠引起乳房炎，但無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌被認為是最重要的傳染性病原體[8]。本研究從乳房炎發(fā)病牛奶樣中分離獲得1株鏈球菌，經(jīng)16S rDNA測序鑒定為無乳鏈球菌。小鼠乳腺結構與奶牛乳腺結構類似，較易控制，成本較低，因此成為研究乳房炎模型的最佳實驗動物[9]。將分離株HZ-032經(jīng)乳腺管注射至哺乳期小鼠乳腺內，可引起小鼠乳腺組織呈暗黃色、充血出血和乳汁減少。感染后小鼠乳腺組織切片較正常組可明顯觀察到乳腺上皮細胞溶解，腺泡內有大量中性粒細胞浸潤，以上病理變化與倫艷霞等[10]構建無乳鏈球菌性乳房炎BALB/c小鼠模型的病理變化一致。HZ-032菌株感染48 h內可從乳腺組織中分離到大量細菌，表明該菌可造成局部感染，并在乳腺組織中繁殖。該結果與Trigo等[11]的研究結果一致。Bannerman等[12]研究表明，無乳鏈球菌感染后可在乳腺中誘發(fā)促炎性細胞因子，并且其組織學改變類似于在患有無乳鏈球菌乳房炎的母牛乳腺組織病變。而本研究中無乳鏈球菌分離株HZ-032誘發(fā)小鼠乳腺炎過程與之前文獻中描述的牛無乳鏈球菌乳房炎非常相似。先天免疫反應在感染的早期階段占主導地位，并受促炎性細胞因子的調節(jié)，促發(fā)中性粒細胞募集到感染的乳腺。當巨噬細胞識別細菌時，它們會釋放促炎性細胞因子，例如IL-1、IL-10和TNF-α等，這對于有效抵抗原發(fā)感染至關重要[10,12]。IL-6是一種引起炎癥的主要細胞因子，能夠促進肝臟合成急性期蛋白，誘導炎癥反應[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，HZ-032感染小鼠后能夠顯著引起乳腺組織中IL-1α、IL-10、IL-6和TNF-α升高，表明HZ-032感染能夠引起小鼠乳腺組織中強烈的炎癥反應[14]。

4 結論

本研究從患病奶牛乳樣中分離1株致病性無乳鏈球菌，并成功構建小鼠乳房炎模型，對于研究無乳鏈球菌致乳房炎的相關致病機制有重要意義，同時也為進一步尋找有效的抗菌藥物奠定基礎。