鄒 靜，劉虹汝，張翠香，韓 宏，張鈺哲,3

(1.大理大學(xué) 第一附屬醫(yī)院, 云南 大理 671003； 2.大理大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 云南 大理 671003;3.云南省昆蟲醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南 大理671003)

0 引 言

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是除小細(xì)胞肺癌(SCLC)以外的任何類型的上皮肺癌.NSCLC約占所有肺癌的85%[1].與小細(xì)胞癌相比，非小細(xì)胞肺癌對(duì)化療相對(duì)不敏感.在可能的情況下，盡管手術(shù)前(新輔助化療)和術(shù)后(輔助化療)都越來越多地使用化學(xué)療法，但主要通過手術(shù)切除進(jìn)行治療.在過去的20年中，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的治療取得了重要進(jìn)展，增進(jìn)了我們對(duì)疾病生物學(xué)和腫瘤進(jìn)展機(jī)制的了解，并促進(jìn)了早期發(fā)現(xiàn)和多模式護(hù)理.小分子酪氨酸激酶抑制劑和免疫療法的使用已在選定的患者中帶來空前的生存獲益. 但是，NSCLC的總體治愈率和生存率仍然很低，尤其是在轉(zhuǎn)移性疾病中[2].因此，需要繼續(xù)研究新藥和聯(lián)合療法將臨床益處擴(kuò)展到更廣泛的患者群體，并改善NSCLC的預(yù)后.

扶正抗癌方(FZAF)為廣東省中醫(yī)院腫瘤科吳萬垠主任總結(jié)十余年的治療經(jīng)驗(yàn)擬定的，方劑組成: 黃芪30 g，太子參15 g，白術(shù)15 g，甘草10 g，炒薏苡仁30 g，山慈菇30 g，白花蛇舌草30 g，龍葵30 g，石見穿30 g，八月札30 g，蛇泡簕30 g，莪術(shù)15 g[3].該方以四君子湯為底，方中太子參補(bǔ)氣養(yǎng)陰生津，黃芪補(bǔ)氣升陽、益衛(wèi)固表，白術(shù)健脾燥濕化疲，炒薏苡仁健脾滲濕，甘草益氣補(bǔ)中、調(diào)和諸藥，五藥同用有健脾益氣補(bǔ)肺化痰之效；山慈茹清熱解毒、消痛散結(jié)，蛇舌草、龍葵清熱解毒，石見穿活血化瘀、清熱散結(jié)，八月扎活血理氣，蛇泡簕清熱散疲，莪術(shù)破血行氣消積，七藥同用有清熱解毒、祛瘀散結(jié)抑瘤之效.扶正抗癌方(FZAF)從整體觀念出發(fā)辨證論治，辨證與辨病相結(jié)合.辨證太子參、黃芪、白術(shù)、甘草、炒薏苡仁、義術(shù)健脾益氣、化濕祛痰，意在補(bǔ)益后天之本，有培土生金之效，以扶正抗癌.辨病以山慈菇、蛇舌草、龍葵、石見穿、八月扎、蛇泡簕清熱解毒、祛瘀散結(jié)抗瘤.全方扶正與祛邪相結(jié)合，辨病與辨證相結(jié)合.扶正則重視補(bǔ)益脾肺之氣，祛邪則以清熱解毒、祛痰散結(jié)為主，上藥合用共奏扶正抗癌之功[4-5].目前己廣泛用于臨床治療中.前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，扶正抗癌方(FZAF)治療晚期非小細(xì)胞肺癌時(shí)能顯著提高患者生活質(zhì)量，并且能夠延長(zhǎng)患者病情無進(jìn)展生存周期；同時(shí)，對(duì)于EGFR突變的晚期非小細(xì)胞肺癌，扶正抗癌方(FZAF)聯(lián)合吉非替尼治療患者的中位疾病無進(jìn)展生存時(shí)間也比吉非替尼單藥要長(zhǎng)[6].本研究旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出扶正抗癌方(FZAF)治療非小細(xì)胞肺癌的關(guān)鍵化合物和作用靶點(diǎn)以及作用通路，探討其抗非小細(xì)胞肺癌多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用機(jī)制，為后續(xù)多靶點(diǎn)藥物研發(fā)提供基礎(chǔ)依據(jù).

1 分析平臺(tái)與方法

1.1 預(yù)測(cè)配方中的關(guān)鍵化學(xué)成分及潛在作用靶點(diǎn)

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫分析平臺(tái)(TCMSP，Http://isp.nwu.edu.cn/index.php)，以方中各單味的標(biāo)準(zhǔn)中藥名稱來檢索扶正抗癌方(FZAF)中的全部化學(xué)成分，因?yàn)樯锢枚?Oral Bioavailability，OB)和類藥性(Drug-Likeness，DL)對(duì)中藥化學(xué)成分活性的評(píng)估具有重要意義[7].根據(jù)生物藥物動(dòng)力學(xué)(ADME)：生物利用度OB≧30%, 且DL≧0.18作為高活性關(guān)鍵化合物的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，得到扶正抗癌方(FZAF)有效成分及相應(yīng)的靶標(biāo)蛋白.其中在 TCMSP 未檢索到的中藥，從TCMID 數(shù)據(jù)庫、相關(guān)文獻(xiàn)予以補(bǔ)充.最后通過Uniprot[8]數(shù)據(jù)庫查詢靶蛋白對(duì)應(yīng)的基因名，對(duì)靶標(biāo)蛋白進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化，建立數(shù)據(jù)集.

1.2 收集扶正抗癌方(FZAF)治療非小細(xì)胞肺癌的潛在作用靶點(diǎn)

將上一步在TCMSP中篩選出來的有效化合物在DrugBank 數(shù)據(jù)庫(https://www.drug bank.ca/)中獲取每個(gè)化合物的有效作用靶點(diǎn)，再在Genecards、CTD和TTD數(shù)據(jù)庫中以 “Non-small Cell Lung Cancer”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，選擇物種為“Homo sapiens”，篩選出與非小細(xì)胞肺癌相關(guān)的蛋白靶點(diǎn)基因，使用Venny 2.1繪圖軟件，將藥物預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)與疾病的靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲得“扶正抗癌方(FZAF)”治療非小細(xì)胞肺癌潛在作用靶點(diǎn)，得到藥物-疾病靶點(diǎn)基因圖.

1.3 PPI蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和核心靶點(diǎn)的篩選

為進(jìn)一步明確潛在作用靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，將1.2篩選出的靶點(diǎn)信息導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins，https://string-db.org/)中 Multiple Proteins 的檢索，將蛋白種類定義為“Homo sapiens”，置信度>0.7,最低相互作用閾值為 0.4進(jìn)行篩選，剔除重復(fù)、非人源的靶點(diǎn)，規(guī)范靶點(diǎn)名稱.獲取蛋白相互作用信息，保存為TSV格式文件.將“node1、node2和Combine score”等中藥化合物和有效靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape-3.8.0 (http://www.cytoscape.org/) 中，并運(yùn)用其插件“Network Analyzer”分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，以節(jié)點(diǎn)度值、介數(shù)均超過平均值為標(biāo)準(zhǔn)篩選出核心靶點(diǎn)[9].其中，節(jié)點(diǎn)的大小、顏色的深淺代表度值的大小.

1.4 GO(geneontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)的富集分析

為了說明中藥化合物對(duì)應(yīng)的預(yù)測(cè)潛在靶點(diǎn)在基因功能和通路中的作用，將1.3收集的共同靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入DAVID6.8 數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)[10]，設(shè)置物種為“Homo Sapiens”，對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行 GO 功能富集分析和 KEGG 通路富集分析.

1.5 構(gòu)建活性成分-共同靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

利用 Cytoscape 3.8.0 軟件將“1.1”項(xiàng)下收集的藥物活性成分、“1.2”項(xiàng)下收集的交叉靶點(diǎn)及“1.4”項(xiàng)下得到的靠前的通路，繪制“活性成分-交叉靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖[11].

1.6 成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接

利用分子對(duì)接技術(shù)研究扶正抗癌方的活性成分及其治療非小細(xì)胞肺癌的相關(guān)靶點(diǎn)，能夠在一定程度上說明活性成分與靶點(diǎn)蛋白的作用機(jī)制與結(jié)合活性[12].從pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載SDF格式的化合物結(jié)構(gòu)并利用Chem 3D軟件將SDF格式轉(zhuǎn)化為mol2格式文件，從RCSB 數(shù)據(jù)庫( https://www.rcsb.org/)下載蛋白FN1(PDB ID: 4JEG)、PTGS2(PDB ID: 5F19)、CAT(PDB ID: 1DGF)、EGFR(PDB ID: 5GNK)、AKT1(PDB ID: 6HHG)、IL6(PDB ID: 1ALU)、MAPK3(PDB ID: 4QTB)、MAPK8(PDB ID: 2XRW)的PDB格式結(jié)構(gòu),使用Pymol 軟件去除溶劑分子與配體，使用AutoDock Tools 1.5.6 軟件加氫、計(jì)算電荷、分配原子類型等，保存為pdbqt格式.最后運(yùn)行Autodock vina 1.1.2進(jìn)行分子對(duì)接, 采用Discovery Studio 2020可視化分析對(duì)接構(gòu)象.

2 結(jié) 果

2.1 扶正抗癌方(FZAF)治療非小細(xì)胞肺癌活性化合物的篩選

根據(jù) TCMSP、TCMID數(shù)據(jù)庫中“OB≥30%、DL≥0.18”的界定值和去重處理后，結(jié)合已有文獻(xiàn)報(bào)道扶正抗癌方(FZAF)中化合物共有700個(gè)，篩選出關(guān)鍵活性化合物共165個(gè)，靶蛋白數(shù)量1 236個(gè)；靶向非小細(xì)胞肺癌的活性成分39個(gè)，方中各味藥活性成分和預(yù)測(cè)靶標(biāo)數(shù)量見表 1.

表1 扶正抗癌方(FZAF)“化合物-有效成分-靶蛋白”基本信息

2.2 非小細(xì)胞肺癌潛在靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

分別從Genecards、CTD和TTD數(shù)據(jù)庫搜索NSCLC的相關(guān)靶點(diǎn)，收集到非小細(xì)胞肺癌潛在靶點(diǎn)分別是4 350個(gè)、1 820個(gè)、115個(gè)，剔除重復(fù) 1 766個(gè)，共收集到4 519個(gè)非小細(xì)胞肺癌相關(guān)靶點(diǎn).

2.3 扶正抗癌方治療非小細(xì)胞肺癌潛在作用靶點(diǎn)

繼續(xù)通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢上述39種關(guān)鍵化合物的靶點(diǎn)信息，通過Uniprot進(jìn)行基因ID注釋.將藥物與疾病的靶點(diǎn)基因?qū)隕XCEL，映射得到扶正抗癌方-非小細(xì)胞肺癌的共同靶點(diǎn)，并通過R語言繪制Venny圖，共得到189個(gè)交叉靶點(diǎn)，即扶正抗癌方(FZAF)治療非小細(xì)胞肺癌潛在作用靶點(diǎn)，見圖 1.

圖1 扶正抗癌方和非小細(xì)胞肺癌靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 The Venny diagram of targets for non-small cell lung cancer with Fuzheng Anticancer’s Formula (FZAF)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)與核心靶點(diǎn)

將189個(gè)共同靶點(diǎn)上傳至STRING11.0(https://www.string-db.org/)，并規(guī)范基因靶點(diǎn)名稱，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，然后根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)將靶點(diǎn)按照度值由高到低排序(見表 2)，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度值(degree)和介數(shù)(betweenness)是網(wǎng)絡(luò)藥理分析中的重要參數(shù)，定義大于等于degree值中位數(shù)的2倍且具有較高介數(shù)(大于等于介數(shù)值的中位數(shù))的靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn).因此，綜合本方劑分析所得的所有靶點(diǎn)的度值和介值，我們依據(jù)以上定義，選擇節(jié)點(diǎn)度值>均值(12.28)且介數(shù)中心性值>均值(0.75)篩選得到核心靶點(diǎn)26個(gè).從而得出扶正抗癌方(FZAF)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2a和圖2b).在圖2a中共涉及107個(gè)節(jié)點(diǎn)、1 314條邊.度值、介值大的靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵的作用，其很可能是扶正抗癌方(FZAF)治療非小細(xì)胞肺癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)；具體見表 2.通過實(shí)驗(yàn)確定的已知相互作用的節(jié)點(diǎn)基因、預(yù)測(cè)的以及其他如文本挖掘，共表達(dá)和蛋白質(zhì)同源性相互作用分析得出的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)PPI(圖2b).此外，根據(jù)cytoscape插件2：cytoHubba對(duì)所有扶正抗癌方抗非小細(xì)胞肺癌靶點(diǎn)在整個(gè)抗非小細(xì)胞肺癌基因網(wǎng)絡(luò)中的作用直接性進(jìn)行排名，列出排名前10的核心靶基因(圖2c).這個(gè)插件是基于Degree，Edge percolated commponent邊過濾成分，Maximum neighborhood component，Density of Maximum Nerghborhuood Maximal Cliquecentrality and six centralities(Botteleneck,EcCentricity,Closeness,Radiality,Betweenness, Stress)等11種拓?fù)浞治龇ㄟM(jìn)行的.

表2 扶正抗癌方(FZAF)抗非小細(xì)胞肺癌核心靶點(diǎn)拓?fù)鋵傩詤?shù)

(a)扶正抗癌方抗非小細(xì)胞肺癌相關(guān)基因的“蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)”互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖

作用類型：激活抑制表型綁定催化反應(yīng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)翻譯后修飾 (b)扶正抗癌方抗非小細(xì)胞肺癌相關(guān)基因的“蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)”互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖

(c)扶正抗癌方抗非小細(xì)胞肺癌相關(guān)基因的“蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)”互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖注：圖a中，其中節(jié)點(diǎn)表示蛋白，節(jié)點(diǎn)越大度值越大，每條邊則表示蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系，線條越多表示關(guān)聯(lián)度越大，顏色由藍(lán)變黃程度與度值和介值均呈正相關(guān).圖b中，扶正抗癌方抗非小細(xì)胞肺癌的蛋白質(zhì)互作方式圖.圖c表示扶正抗癌方抗非小細(xì)胞肺癌的核心基因靶點(diǎn)圖.圖2 扶正抗癌方抗非小細(xì)胞肺癌相關(guān)基因的“蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)”互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 “Protein-protein”interaction (PPI) network diagram of Fuzheng Anticancer Formula (FZAF) against non-small cell lung cancer related genes

2.5 GO生物功能注釋分析及KEGG通路富集

將扶正抗癌方(FZAF)治療非小細(xì)胞肺癌189個(gè)潛在作用靶點(diǎn)上傳至DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫的GO富集分析功能,共富集出171條生物功能信息(P<0.01)，獲得GO生物學(xué)過程 134條，信號(hào)通路134條(見圖3a、圖3b和圖3c).排名靠前的生物學(xué)功能主要為核受體活性(13個(gè)靶點(diǎn)：AHR/AR/ESR1/ESR2/NR1I2/PGR/PPARA/PPARD/PPARG/RXRA/RXRB/ SREBF1/STAT3)、磷酸化結(jié)合(18個(gè)靶點(diǎn)：AKT1/BAD/BCL2/CTNNB1/ERBB2/HMGCR/MAPK1/MAPK14/MAPK3/MET/PPARA/PPARG/PTPN1/SLC6A3/SOD1/STAT1/STAT3/TP53)、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(16個(gè)靶點(diǎn)：AHR/AR/ATF2/CTNNB1/ELK1/ESR1/FOS/GSK3B/JUN/NFE2L2/PPARA/PPARD/PPARG/RB1/STAT3/TP53)，見圖3.這意味著扶正抗癌方可以通過多種生物學(xué)調(diào)控過程，發(fā)揮治療非小細(xì)胞肺癌的作用.為了更精準(zhǔn)了解扶正抗癌方(FZAF)治療非小細(xì)胞肺癌可能的作用機(jī)制，選KEGG通路前20條進(jìn)行分析(表3)，并繪制相應(yīng)氣泡圖(圖4).

(a)go-BP網(wǎng)絡(luò)圖

(b)go-cc

(c)go-MF

表3 20條KEGG通路

注：Y軸代表通路名稱，X軸代表所占百分比，氣泡面積代表通路富集基因數(shù)，氣泡顏色代表P值的大小.圖4 扶正抗癌方治療非小細(xì)胞肺癌KEGG通路富集的氣泡圖Fig.4 The KEGG pathway enriched bubble chart of Fuzheng Anticancer′s Fomula(FZAF) against non-small cell lung cancer

2.6 活性成分-共同靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

將以P<0.01篩選出的排名前20條信號(hào)通路及靶點(diǎn)和扶正抗癌方(FZAF)活性成分輸入Cytoscape-3.8.0 軟件中，繪制“活性成分-共同靶點(diǎn)-通路”圖(見圖5).圖中菱形代表活性成分、圓形代表作用靶點(diǎn)、正方形代表通路，靠近內(nèi)部正方形代表排名前20條通路.以度值調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)大小，節(jié)點(diǎn)越大說明越重要；每條邊代表靶點(diǎn)與活性成分、靶點(diǎn)與信號(hào)通路、活性成分與信號(hào)通路之間的關(guān)系.由網(wǎng)絡(luò)圖及節(jié)點(diǎn)信息可知：165個(gè)活性成分與排名前20條關(guān)鍵信號(hào)通路密切相關(guān)，根據(jù)“度值>均值”篩選出關(guān)鍵化合物38個(gè)，共涉及到189個(gè)靶點(diǎn).

2.7 扶正抗癌方通過“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”發(fā)揮抗非小細(xì)胞肺癌的作用

在扶正抗癌方治療非小細(xì)胞肺癌的核心網(wǎng)絡(luò)中，有39個(gè)作用成分、189個(gè)作用靶點(diǎn).我們利用分析平臺(tái)與方法部分中的成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接方法，驗(yàn)證了根據(jù)度值>均值篩選出來的前3個(gè)關(guān)鍵化合物槲皮素(QUE)、熊果酸(UA)、木樨草素(luteolin)與非小細(xì)胞肺癌密切相關(guān)的蛋白激酶AKT1(PDB ID: 4GV1)、白介素6 IL6(PDB ID: 1N26)和絲裂原激活蛋白激酶MAPK8(PDB ID: 2XRW)的結(jié)合情況，這在一定程度上說明活性成分與靶點(diǎn)蛋白的作用機(jī)制與結(jié)合活性，值越小，表明結(jié)合越緊密(表4) (圖6-圖8)，并分析扶正抗癌方中關(guān)鍵化合物與主要靶點(diǎn)蛋白的對(duì)接構(gòu)象，并挖掘了以MAPK8、AKT1為中心的信號(hào)通路(圖9 a 和圖9 b).

圖 5 扶正抗癌方活性成分-共同靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)Fig.5 The active ingredients of Fuzheng Anticancer′s Formula (FZAF)-Common Target-Pathway Network

表4 3個(gè)靶蛋白與3個(gè)關(guān)鍵化合物的分子對(duì)接結(jié)合活性

(a)AKTI蛋白與熊果酸的分子對(duì)接圖；(b)a環(huán)與Val164形成疏水作用，與Lys158形成氫鍵作用,b環(huán)與Phe161形成疏水作用.(c)AKT1蛋白中具體與熊果酸對(duì)接的氨基酸位置；(d)賦予氫鍵供體與受體結(jié)合的電勢(shì)圖圖6 AKTI蛋白與熊果酸的分子對(duì)接蛋白圖 Fig.6 The molecular docking protein map of AKTI protein and ursolic acid: a) The molecular docking diagram of AKTI protein and ursolic acid; b)Ring forms a hydrophobic interaction with Val164 and forms a hydrogen bond with Lys158,ring b and Phe161 forms a hydrophobic effect; c) The position of the amino acid docked with ursolic acid in the AKT1 protein; d) A diagram of the potential for binding the hydrogen bond donor and acceptor

a)IL6蛋白與熊果酸的分子對(duì)接圖；b)a環(huán)與Ser122、Thr124、Leu123形成氫鍵作用，與Leu69、Leu123形成疏水作用；b環(huán)與Leu123、Pro46形成疏水作用；c、d環(huán)均與Pro46形成疏水作用.c)IL6蛋白中具體與熊果酸對(duì)接的氨基酸位置；d)賦予氫鍵供體與受體結(jié)合的電勢(shì)圖圖7 IL6蛋白與熊果酸的相互作用 Fig.7 Interaction between IL6 protein and ursolic acid: a)The molecular docking diagram of IL6 protein and ursolic acid; b) The a ring forms a hydrogen bond with Ser122, Thr124, and Leu123, and forms a hydrophobic interaction with Leu69 and Leu123 ; B ring forms a hydrophobic interaction with Leu123 and Pro46; c and d rings both form a hydrophobic interaction with Pro46; c) is the position of the amino acid docking with ursolic acid in IL6 protein; d)The potential diagram that gives hydrogen bond donor and acceptor to bind

a)MAPK8蛋白與木樨草素的分子對(duì)接圖；b)a環(huán)與Ala113、Ile32形成疏水作用；b環(huán)與Val158、Ala53、Val40形成疏水作用，與Ile32形成-sigma作用，其羰基與Met111形成氫鍵作用；c環(huán)與Val158、Ala53形成疏水作用，與Val40、Leu168形成-sigma作用，與Met108形成硫-作用和氫鍵作用;c)MAPK8蛋白中具體與木樨草素對(duì)接的氨基酸位置；d)賦予氫鍵供體與受體結(jié)合的電勢(shì)對(duì)接圖圖8 MAPK8蛋白與木樨草素的相互作用 Fig.8 Interaction between MAPK8 protein and luteolin:a) The molecular docking diagram of MAPK8 protein and luteolin; b) Ring a forms hydrophobic interaction with Ala113 and Ile32; ring b forms hydrophobic interaction with Val158, Ala53, and Val40 Interaction, forming -sigma interaction with Ile32, the carbonyl group forming hydrogen bond interaction with Met111; c ring forming hydrophobic interaction with Val158 and Ala53, forming -sigma interaction with Val40 and Leu168, forming sulfur- interaction and hydrogen bonding interaction with Met108; c) The specific amino acid position of the MAPK8 protein docking with luteolin;d) The potential docking diagram that gives hydrogen bond donor and acceptor binding

3 討 論

在本項(xiàng)研究中，我們共篩選出扶正抗癌方(FZKA)中化合物1 769個(gè)，有效活性成分165個(gè)，潛在作用靶點(diǎn)1 236個(gè)，其中189個(gè)靶點(diǎn)與非小細(xì)胞肺癌重合，表明扶正抗癌方(FZKA)治療非小細(xì)胞肺癌具有多成分、多靶點(diǎn)的特征.根據(jù)圖5“活性成分-共同靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)”，按照“度值>均值”條件篩選出關(guān)鍵化合物34個(gè)，其中排名前9名關(guān)鍵化合物主要有槲皮素(quercetin)、熊果酸(Ursolic acid)、木犀草素(luteolin)、山萘酚(kaempferol)、刺槐素(locustin)、甘草查爾酮甲(licorice chalcone A)、β-谷固醇(β-sitosterol)、柚皮苷(naringenin)、β-胡蘿卜素(β-carotene)，其中槲皮素具有最高的度值和最多的靶點(diǎn)，表明其作用可能是最顯著的.根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)節(jié)點(diǎn)度值>均值(12.28)，且介數(shù)中心性>均值(0.75)，篩選的核心靶點(diǎn)共 26個(gè)，即AKT1、MAPK8、IL6、JUN、MAPK1、CCND1、CASP3、MAPK3、EGF、MAPK14、CXCL8、FOS、IL1B、BCL2L1、IL10、IL2、ESR1、CCL2、CTNNB1、AR、ICAM1、CASP8、IL4、CSF2、CDK2、MCL等.它們主要分為三類：炎性介質(zhì)，絲裂原活化蛋白激酶，其他等.其中炎性介質(zhì)主要細(xì)胞因子是白介素(IL6、IL1B、IL10、IL2、IL4)，趨化因子(CCL2)和黏附分子(ICAM1)構(gòu)成.GO和KEGG的通路富集分析結(jié)果主要集中在抑制P53、EMT、MAPK、PTEN/PI3K/AKT、Stat3/Mcl-1等途徑，因此可以推斷扶正抗癌方(FZKA)通過作用于該系統(tǒng)相關(guān)靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移和免疫力等.

a)MAPK(1、3、8、14)為中心的與非小細(xì)胞肺癌相關(guān)的信號(hào)通路

b)AKT1為中心的與非小細(xì)胞肺癌相關(guān)的信號(hào)通路圖9 扶正抗癌方抗非小細(xì)胞肺癌的兩大核心信號(hào)通路Fig.9 Two major signal pathways of Fuzheng Anticancer’s Formula(FZKF) against non-small cell lung cancer：a) Shows the signal pathways related to non-small cell lung cancer centered on MAPK (1, 3, 8, 14); b) Shows the signal pathways related to non-small cell lung cancer centered on AKT1

因此，基于以上分析，我們查詢了大量研究文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)：1)槲皮素及其衍生物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，并且槲皮素在腫瘤化學(xué)成分預(yù)防方面起著重要作用.如槲皮素可以抑制NCI-H1395細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其作用機(jī)制可能與激活外源凋亡通路Caspase-8和Caspase-3有關(guān)[13].也能抑制A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲具有重要作用，其機(jī)制可能與抑制STAT3信號(hào)通路有關(guān).槲皮素納米晶體可以通過抑制STAT3信號(hào)通路來抑制A549細(xì)胞的增殖和遷移，并且與大顆粒相比，小顆粒的槲皮素納米晶體在抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲方面具有更強(qiáng)的細(xì)胞生物學(xué)作用[14].槲皮素還可以抑制SAPK/JNK、p38、p44/p42的表達(dá)，阻斷MAPK信號(hào)通路的激活，阻止炎性因子的釋放，最終減少組織損傷，降低炎癥程度[15]，并對(duì)獲得性耐藥NSCLC細(xì)胞PC9/GR具有很強(qiáng)的抗腫瘤作用，其作用機(jī)制可能Stat3/Mcl-1途徑介導(dǎo)的胞凋亡密切相關(guān)[16].槲皮素是一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性的MMP-9抑制劑，能夠誘導(dǎo)MMP-9的活性降低，并導(dǎo)致MMP-9 mRNA、MMP-9蛋白和TGF-β1蛋白表達(dá)的降低，最終對(duì)肺癌腫瘤細(xì)胞株A549的凋亡起重要作用[17].2)熊果酸能抑制A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其作用機(jī)制可能是通過下調(diào)PTEN/PI3K/AKT通路上的miRNA-21[18]，上調(diào)miRNA-133a[19]來實(shí)現(xiàn)的，并發(fā)現(xiàn)熊果酸是以時(shí)間和劑量依賴的方式，其分子機(jī)制可能是上調(diào) p27、p16的表達(dá)和下調(diào)cyclinD1、cyclinE 的表達(dá)，而達(dá)到顯著抑制A549和SPCA1細(xì)胞增殖[20].熊果酸還具有抑制肺癌異種移植小鼠腫瘤生長(zhǎng)的作用，其機(jī)制可能與熊果酸對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Caspase-3，Bax，Bcl-2，AKT)的調(diào)控及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)[21].3)木犀草素可以有效抑制人肺癌H460細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能是通過激活p53信號(hào)通路，上調(diào)miR-34a-5p，最終影響凋亡相關(guān)蛋白 Bax/Bcl-2的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)[22].4)山奈酚可通過抑制ERRα降低NSCLC A549細(xì)胞侵襲和遷移能力，并抑制其EMT，為肺癌的臨床治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)[23].5)柚皮苷可增強(qiáng)人肺癌A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，這可能與柚皮苷上調(diào)Bax的蛋白水平和下調(diào)Bcl-2、P-gp、MRP1、p-Akt和CXCR4的蛋白水平有關(guān)[24].還可以通過下調(diào)p70S6K來抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[25].

此外，從該藥方的總體藥效來看，Wang S 等人發(fā)現(xiàn)扶正抗癌方還通過STAT3/Bcl-2/Caspase-3途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡[26].還有Li L等人發(fā)現(xiàn)扶正抗癌方通過滅活PI3-K/Akt介導(dǎo)的MUC1表達(dá)抑制作用來提高吉非替尼對(duì)人肺癌細(xì)胞的抑制作用[27],并還能通過STAT3/MMP9途徑抑制非小細(xì)胞肺癌的代謝[23].以上這些實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)均驗(yàn)證了我們網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析和推測(cè).

4 結(jié) 論

綜上所述，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的扶正抗癌方(FZKA)的關(guān)鍵化合物基本上都具有抑制細(xì)胞周期、上調(diào)某些MicroRNA的表達(dá)，并最終影響細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2表達(dá)，從而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和遷移并調(diào)節(jié)免疫力.結(jié)合目前已經(jīng)研究證實(shí)的以上9種化合物對(duì)非小細(xì)胞肺癌的作用機(jī)制，進(jìn)一步論證了扶正抗癌方(FZKA)具有抗非小細(xì)胞肺癌的作用.從而達(dá)到抗非小細(xì)胞肺癌的效果.上述實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)我們網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析和推測(cè).

可以看出，扶正抗癌方(FZKA)治療非小細(xì)胞肺癌的有效成分可能是槲皮素、熊果酸、木犀草素、山奈酚等.這些成分對(duì)炎性介質(zhì)、絲裂原活化蛋白激酶等靶點(diǎn)通過PI3K-Akt 信號(hào)傳導(dǎo)途徑、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、人T細(xì)胞白血病病毒1感染、IL-17信號(hào)傳導(dǎo)途徑、TNF信號(hào)傳導(dǎo)等途徑參與廣譜抗腫瘤和抑制癌細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等，但其機(jī)理仍具有一定局限性，有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步論證.