朱 萌，張 寧，陶 偉

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004； 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 2.病理科； 3.消化內(nèi)科，寧夏 銀川 750004)

胃癌(gastric cancer)腹膜轉(zhuǎn)移發(fā)生機(jī)制不明，治療手段欠缺、預(yù)后差、病死率高。當(dāng)前針對(duì)腹膜轉(zhuǎn)移的研究，多集中在癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力和轉(zhuǎn)移的分子調(diào)控上，對(duì)于轉(zhuǎn)移的受體，腹膜細(xì)胞成分的變化卻較少深入闡明，而腹膜間皮細(xì)胞的損傷或暴露引起的表型變化卻是癌細(xì)胞能否種植于腹膜上的必要環(huán)節(jié)[1]。本研究前期工作表明胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS富集外泌體，且miRNA-106a(miR-106a)在胃癌中特異性表達(dá)，并鑒定直接靶點(diǎn)Smad7和TIMP2[2-3]。但是關(guān)于外泌體miR-106a靶向Smad7/TIMP2對(duì)腹膜間皮表型的影響并不清楚。本研究在此基礎(chǔ)上，從轉(zhuǎn)移的受體腹膜間皮細(xì)胞入手，考察AGS細(xì)胞外泌體源miR-106a對(duì)腹膜間皮細(xì)胞系HMrSV5增殖、凋亡、遷移等表型以及靶基因Smad7、TIMP2和下游效應(yīng)分子MMP2、MMP9、α-SMA表達(dá)的影響，探索外泌體miR-106a在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑及細(xì)胞

主要試劑：胎牛血清(Gibco公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胰蛋白酶(Genview公司)；LipofectamineTM2000和外泌體提取試劑盒(Invitrogen公司)；EdU檢測(cè)試劑盒(Ribobio公司)；Transwell小室(Costor公司)；Matrigel基底膜基質(zhì)(Corning公司)；GW4869≥90%純度、重組人TGF-beta 1蛋白(Aldrich-Sigma公司)；hsa-miR-106a mimic/inhibitor (Genepharma公司)；TRIzol(TaKaRa公司)；qPCR檢測(cè)試劑盒(DBI公司)；Smad7兔多克隆抗體(Proteinteck公司)；Smad2/3兔多克隆抗體(CST公司)；p-Smad2/3兔單克隆抗體(R&D公司)；TIMP2、MMP9兔多克隆抗體(Immunoway公司)；MMP2、α-SMA兔多克隆抗體(SAB公司)。人源胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS和腹膜間皮細(xì)胞系HMrSV5購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.2 方法

1.2.1 外泌體的提?。吼囸I培養(yǎng)AGS細(xì)胞2 d后，吸棄上清液，2 000 r/min離心20 min，用微孔濾膜過濾，去除細(xì)胞和其他亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)；加入外泌體提取試劑(1∶2)，顛倒混勻；4 ℃孵育過夜；次日4 ℃ 10 000×g離心1 h；棄上清，PBS重懸，獲得外泌體于-80 ℃冰箱保存1周備用。PBS重懸外泌體，得到PBS-Exo，工作劑量8 μg。

1.2.2 細(xì)胞的分組及處理：本研究分3個(gè)部分：1)AGS細(xì)胞來源外泌體與HMrSV5細(xì)胞共培養(yǎng)。分組：Exo-control和Exo-GW4869。GW4869藥物濃度為10 μmol/L，作用時(shí)間24 h。2)AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-106a mimic或inhibitor后與HMrSV5細(xì)胞共培養(yǎng)。分組：Exo-control、Exo-mimic、Exo-inhibitor。miRNA mimic/inhibitor采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染，濃度50 nmol/L。3)AGS細(xì)胞來源外泌體與TGF-β處理后HMrSV5細(xì)胞共培養(yǎng)。分組：TGF-β、TGF-β-Exo。TGF-β重組蛋白濃度10 ng/mL，作用時(shí)間48 h。

1.2.3 qPCR檢測(cè)細(xì)胞miR-106a表達(dá)：TRIzol法提取RNA?？俁NA模板量1 μg，加入RNase-free H2O，總體系10 μL。取7.0 μL，加入5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液 2.0 μL，miRNA RT 0.25 μL，U6 R 0.25 μL，RT反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，總體系10 μL。37 ℃ 15 min，98 ℃ 5 min，合成cDNA第一鏈。取cDNA 1 μL，加入Bestar? SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL，miRNA F(10 μmol/L)0.5 μL，ALL R(10 μmol/L)0.5 μL，ddH2O 8 μL，總體系20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。融解曲線分析：94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，94 ℃ 30 s。PCR使用Agilent Stratagene熒光定量PCR儀Mx3000P進(jìn)行。miR-106a 反轉(zhuǎn)錄引物：5′-CTCAA CTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTACCTG C-3′；miR-106a 正向引物：5′-ACACTCCAGCTGGG AAAAGTGCTTACAGTGCA，反向引物：5′-CTCAACT GGTGTCGTGGA-3′。按照2-△△Ct方法處理數(shù)據(jù)。

1.2.4 EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖：將HMrSV5細(xì)胞置于96孔板，每孔加入100 μL 濃度為50 μmol/L EdU培養(yǎng)基孵育2 h；棄培養(yǎng)基，PBS清洗，4%多聚甲醛固定30 min，50 μL甘氨酸2 mg/mL孵育5 min，100 μL滲透劑(0.5% TritonX-100的PBS)孵育10 min；PBS清洗后加入100 μL 1×Apollo染色液，避光孵育30 min，棄染色反應(yīng)液；加入100 μL滲透劑(0.5% TritonX-100的PBS)脫色搖床清洗2～3次，每次10 min，棄滲透劑；加入100 μL 1× Hoechst 33342反應(yīng)液，避光孵育30 min，棄染色反應(yīng)液；PBS清洗，倒置熒光顯微鏡(Leica DMI6000B)觀察拍照。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.5 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：將HMrSV5細(xì)胞置于6孔板，胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液；將單細(xì)胞懸液移至流式管，PBS洗滌2次，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用500 μL 1×緩沖液重懸細(xì)胞，然后取兩管樣本分別加入5 μL annexin V-FITC 和 10 μL PI，避光孵育15 min，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移：無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)HMrSV5細(xì)胞12 h，胰蛋白酶消化，用含0.2% BSA的無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL，取100 μL加入Transwell上室，下室加入700 μL 10% FBS完全培養(yǎng)基；5% CO2、37 ℃常規(guī)培養(yǎng)48 h；PBS洗滌，4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色5～10 min，封片鏡檢。

1.2.7 Western blot檢測(cè)Smad7、TIMP2、MMP2、MMP9、α-SMA、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表達(dá)：將HMrSV5細(xì)胞按5×105個(gè)/mL接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)48 h后提取總蛋白，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行BCA蛋白定量。經(jīng)SDS-PAGE進(jìn)行分離，上樣量20 μg，100 V恒壓電泳，待樣品進(jìn)入分離膠后，升壓至120 V，總時(shí)長(zhǎng)1.5 h。300 mA恒流轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉-TBS封閉。孵育一抗(Smad7 1︰1 000，TIMP-2 1︰2 000，MMP2 1︰2 000，MMP9 1︰2 000，α-SMA 1︰2 000，Smad2/3 1︰1 000，p-Smad2/3 1︰500，GAPDH 1︰10 000)，孵育二抗(HRP山羊抗兔IgG 1︰20 000)，TBST洗滌?；瘜W(xué)發(fā)光、顯影、定影。凝膠圖像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 AGS細(xì)胞源外泌體miR-106a表達(dá)及對(duì)HMrSV5細(xì)胞增殖和凋亡的影響

AGS細(xì)胞內(nèi)和外泌體內(nèi)miR-106a的差異表達(dá)，與AGS-control組相比，AGS-Exo組miR-106a表達(dá)量增高(P<0.01)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，與Exo-control組相比，Exo-GW4869處理后，HMrSV5細(xì)胞EdU標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)(圖1)。早期凋亡率兩組相比，Exo-GW4869組明顯降低(P<0.05)(圖2)。

圖1 EdU法檢測(cè)HMrSV5細(xì)胞增殖能力Fig 1 Proliferation ability of HMrSV5 cells was detected by EdU assay (scale bar=50 μm)

2.2 AGS細(xì)胞源外泌體miR-106a對(duì)HMrSV5細(xì)胞遷移的影響

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，與Exo-control組相比，Exo-mimic組HMrSV5細(xì)胞遷移率明顯增強(qiáng)(P<0.001)，Exo-inhibitor組明顯下降(P<0.001)(圖3)。

2.3 AGS細(xì)胞源外泌體miR-106a對(duì)HMrSV5細(xì)胞Smad7及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與Exo-control相比，Exo-mimic組HMrSV5細(xì)胞Smad7、TIMP2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.001)，MMP2、MMP9、α-SMA蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.001)；Exo-inhibitor組Smad7表達(dá)升高(P<0.01)，MMP2、MMP9、α-SMA表達(dá)明顯降低(P<0.001)(圖4)。

2.4 TGF-β處理后外泌體對(duì)Smad7及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與TGF-β處理組相比，TGF-β-Exo組HMrSV5細(xì)胞Smad7蛋白表達(dá)降低(P<0.001)，而Smad2/3及磷酸化p-Smad2/3蛋白表達(dá)升高(P<0.001)(圖5)。

*P<0.05 compared with Exo-control group圖2 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)HMrSV5細(xì)胞凋亡率Fig 2 Apoptosis rate of HMrSV5 cells was detected by flow cytometry n=3)

*P<0.001 compared with Exo-control group圖3 Transwell小室法檢測(cè)HMrSV5細(xì)胞遷移能力Fig 3 Migration ability of HMrSV5 cells was detected by Transwell assay(scale bar=100 μm) n=3)

3 討論

外泌體是一種細(xì)胞外物質(zhì)，在其生物發(fā)生過程中會(huì)包裹起源細(xì)胞重要信息分子如蛋白質(zhì)、核酸、脂類及其他代謝物等，可能參與了腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的細(xì)胞間通訊[4-5]。其中， 核酸類分子中的miRNA就是外泌體的重要包裹物。關(guān)于外泌體miRNA在腫瘤轉(zhuǎn)移中的研究顯示miRNA經(jīng)由外泌體的定向轉(zhuǎn)運(yùn)參與調(diào)控惡性腫瘤的器官特異性轉(zhuǎn)移，但具體的作用機(jī)制仍有待于深入探索。胃癌腹膜轉(zhuǎn)移是一種器官特異性的轉(zhuǎn)移方式，是由癌細(xì)胞出發(fā)，到腹膜移植瘤形成的過程。本研究以外泌體為介質(zhì)，檢測(cè)外泌體內(nèi)miR-106a的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的miR-106a分子尤其富集于AGS細(xì)胞源外泌體中，提示miR-106a可能參與了外泌體所介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊，進(jìn)而可能在胃癌的腹膜轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。

*P<0.001, #P<0.01 compared with Exo-control group圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)HMrSV5細(xì)胞Smad7及相關(guān)蛋白表達(dá)

*P<0.001 compared with TGF-β group圖5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)HMrSV5細(xì)胞TGF-β干預(yù)后Smad7、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表達(dá)

腹膜細(xì)胞構(gòu)成中最表層的是間皮細(xì)胞，間皮細(xì)胞的完整性和表型的維持是阻止胃癌等惡性腫瘤發(fā)生癌性腹膜播散的屏障[6]。腹膜完整性的保存是間皮細(xì)胞增殖和凋亡平衡的結(jié)果。本研究顯示AGS細(xì)胞外泌體抑制HMrSV5細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可能是破壞間皮完整性的一種介質(zhì)。關(guān)于間皮細(xì)胞遷移率的實(shí)驗(yàn)表明AGS細(xì)胞miR-106a表達(dá)調(diào)控功能增強(qiáng)或減弱的同時(shí)，其來源外泌體也能夠增強(qiáng)或減弱HMrSV5細(xì)胞的遷移能力。間皮細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等表型可能至少在胃癌AGS細(xì)胞外泌體源miR-106a的作用下發(fā)生改變，這將是腹膜完整性損傷的一種促進(jìn)因素。為進(jìn)一步考察發(fā)生此類表型轉(zhuǎn)化的原因，本研究檢測(cè)miR-106a雙靶點(diǎn)Smad7和TIMP2及相關(guān)效應(yīng)分子。Smad7是屬于SMAD家族的一種結(jié)合E3泛素連接酶的核蛋白，能夠與TGF-β相互作用導(dǎo)致TGF-β降解[7-8]，據(jù)報(bào)道TGF-β在Smad依賴的情況下介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT、MMT轉(zhuǎn)化[9-10]。MMP與相應(yīng)的TIMP表達(dá)之間具有負(fù)相關(guān)性，MMPs/TIMPs平衡主要參與對(duì)腫瘤侵襲性的抑制作用。MMP2/TIMP2有利于維持ECM的平衡和降解[11]。本研究發(fā)現(xiàn)Smad7、TIMP2隨miR-106a表達(dá)的干預(yù)而增強(qiáng)或減弱的同時(shí)間質(zhì)標(biāo)志物α-SMA，及MMP2/9發(fā)生相反變化，而TGF-β重組蛋白的逆向觀察發(fā)現(xiàn)Smad7表達(dá)減低的同時(shí)Smad2/3及p-Smad2/3表達(dá)升高。這些結(jié)果一方面表明AGS細(xì)胞外泌體具有促使腹膜間皮細(xì)胞獲得間質(zhì)樣表型的作用[12]，另一方面也表明外泌體對(duì)間皮細(xì)胞的作用在于其轉(zhuǎn)運(yùn)的miR-106a對(duì)靶基因及相關(guān)效應(yīng)通路的影響。