蔡云龍 劉宇希 陳曉 孫曉雨 盧方晉

腎細(xì)胞癌下調(diào)蛋白 1(Down-regulated in renal cell carcinoma 1，DRR1)是一種新的肌動蛋白的結(jié)合蛋白，可以促進(jìn)絲狀肌動蛋白(F-actin)的形成［1，2］。同時，DRR1 在腫瘤以及在神經(jīng)系統(tǒng)中的生物學(xué)作用已被廣泛報道［3-7］，然而關(guān)于DRR1 的相關(guān)作用機(jī)制仍尚不明確。DRR1 的氨基酸序列中存在卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域 (coiled-coil domain)，表明其可以與其他蛋白質(zhì)相互結(jié)合［8］。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)DRR1 可以與F-actin 結(jié)合并促進(jìn)F-actin 的形成［6］，F(xiàn)-actin 是一種高度保守的蛋白，參與機(jī)體多種生物學(xué)活動［9，10］。最近，通過GST pull down 實(shí)驗(yàn)篩選與DRR1 相互作用的蛋白質(zhì)，質(zhì)譜分析結(jié)果確定TMOD2 是與DRR1 相互結(jié)合的蛋白之一［11］。結(jié)果顯示，TMOD2 與DRR1 在原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞中相結(jié)合，并且共同參與調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞軸突的形成［11］。TMOD 是一個肌動蛋白結(jié)合蛋白家族，包括四個成員(TMOD1，TMOD2，TMOD3 和TMOD4)［12］，其中TMOD1 和TMOD3 在各種組織中高表達(dá)，而TMOD2 和TMOD4 分別在神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼肌中表達(dá)，TMOD2 現(xiàn)已被證明能調(diào)節(jié)神經(jīng)元的神經(jīng)突延伸和突觸密度［13］。另外，有研究證明，TMOD 蛋白家族可以通過與F-actin 結(jié)合從而調(diào)節(jié)肌動蛋白動力學(xué)［14］。本研究中，利用免疫共沉降技術(shù)深入分析不同長度的DRR1片段與TMOD2 之間在細(xì)胞內(nèi)的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同長度的DRR1 片段與TMOD2 的結(jié)合能力存在差異。本研究成果為揭示DRR1 與TMOD2 之間的相互作用，以及兩者結(jié)合后的生物學(xué)功能提供了新的線索。

1 材料與方法

1.1 材料 兔抗Venus 抗體(日本MBL 公司)和小鼠抗血凝素抗體(抗HA、美國sigma-aldrich 公司)，蛋白G 瓊脂糖凝膠(protein G sepharose，美國GE Healthcare公司)，胎牛血清(美國Gibco 公司)。不同長度的DRR1 表達(dá)載體與TMOD2-HA 表達(dá)載體的構(gòu)建方法按照前期研究進(jìn)行［6，10］。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HeLa 細(xì)胞購自碧云天公司，用含有10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)使用Lipofectamine 3000(美國Invitrogen 公司)按照說明書要求進(jìn)行。

1.3 免疫共沉降 用RIPA 裂解緩沖液(50 mM Tris-Hcl，pH 7.4，150 mM NaCl，1% NP-40，1% sodium dexycholate，0.1% SDS)制備細(xì)胞裂解液。將細(xì)胞裂解液與相應(yīng)的抗體在4℃ 孵育4 h 后，與蛋白質(zhì) G 瓊脂糖凝膠混合，然后在4℃下再孵育2 h?；旌衔镌?℃下以15000 rpm 轉(zhuǎn)速離心10 min，用冷磷酸鹽緩沖液洗滌沉淀3 次。在最后一次清洗后，將樣品緩沖液加入到沉淀中，并將樣品煮沸5 min，再次在4℃下以15000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min，收集上清液進(jìn)行免疫印跡分析。

2 結(jié)果

2.1 制備不同長度的DRR1 蛋白片段 DRR1 蛋白質(zhì)由144 個氨基酸組成，通過蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)分析軟件分析，確認(rèn)了DRR1 蛋白質(zhì)中有一個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域 (coiled-coil domain)和一個核定位信號(nuclear localization signal，NLS)。根據(jù)這兩個結(jié)構(gòu)域存在的位置，設(shè)計了4 個不同長度的DRR1 片段，并構(gòu)建了相應(yīng)的表達(dá)載體。見圖1。

圖1 不同長度的DRR1 蛋白質(zhì)片段示意圖

為了檢測不同DRR1 區(qū)域與TMOD2 在細(xì)胞中相互結(jié)合的情況，首先構(gòu)建了4 種表達(dá)不同長度DRR1蛋白的表達(dá)載體：DRR1(1-62)-Venus，DRR1(1-90)-Venus，DRR1(1-120)-Venus 和DRR1(1-144)-Venus。將不同的表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染到HeLa 細(xì)胞，3 d 后裂解細(xì)胞獲得裂解液并進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)。結(jié)果顯示，各個不同長度DRR1 蛋白片段在免疫印跡中的條帶位置與理論預(yù)測分子量一致。見圖2。

圖2 在HeLa 細(xì)胞中表達(dá)的不同長度的DRR1 蛋白片段

2.2 DRR1 與TMOD2 相互結(jié)合 前期通過GST pull down 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TMOD2 是DRR1 的結(jié)合蛋白，并通過免疫共沉降實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。為了進(jìn)一步確認(rèn)DRR1與TMOD2 結(jié)合的區(qū)域，將表達(dá)不同長度DRR1 片段的載體分別與TMOD2-HA 載體共轉(zhuǎn)染至HeLa 細(xì)胞，3 d 后收集細(xì)胞獲得細(xì)胞裂解液，利用抗Venus 抗體進(jìn)行免疫共沉降，再利用免疫印跡實(shí)驗(yàn)對沉降蛋白進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示各個樣本中不同長度的DRR1 蛋白片段均能被沉降下來，其中DRR1(1-90)蛋白片段組、DRR1(1-120)蛋白片段組和全長DRR1(1-144)蛋白組，都可見TMOD2-HA 陽性條帶，而DRR1(1-62)蛋白片段組和陰性對照CMV-Venus 組未見TMOD2-HA 陽性條帶。見圖3。

圖3 TMOD2 與DRR1 在HeLa 細(xì)胞中結(jié)合

為了進(jìn)一步確認(rèn)上述結(jié)果，在載體轉(zhuǎn)染后，利用抗HA 抗體進(jìn)行免疫共沉降，并利用免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示各個樣本中的TMOD2-HA 都成功地被沉降下來，其中DRR1(1-90)蛋白片段組、DRR1(1-120)蛋白片段組和全長DRR1(1-144)蛋白組，可見相應(yīng)的DRR1 蛋白片段的條帶，而陰性對照CMV-Venus 組和DRR1(1-62)蛋白片段組未見相應(yīng)的DRR1 蛋白片段的條帶。見圖4。

圖4 DRR1 與TMOD2 在HeLa 細(xì)胞中結(jié)合

3 討論

目前為止，多項研究結(jié)果已經(jīng)證明DRR1 是肌動蛋白的結(jié)合蛋白，且已證實(shí)DRR1 與F-actin 的正端(barded end)結(jié)合［2］。而TOMD2 也是肌動蛋白的一個結(jié)合蛋白，與絲狀肌動蛋白F-actin 的負(fù)端(pointed end)結(jié)合［12］。

本研究發(fā)現(xiàn)DRR1(1-90)蛋白片段、DRR1(1-120)蛋白片段和全長DRR1(1-144)蛋白可以與TOMD2 結(jié)合，而DRR1(1-62)蛋白片段不能與TOMD2 結(jié)合。通過分析DRR1 蛋白質(zhì)的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)DRR1(1-90)蛋白片段、DRR1(1-120) 蛋白片段和全長DRR1(1-144)蛋白均含有完整卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，而DRR1(1-62)蛋白片段不含有該結(jié)構(gòu)域，提示TMOD2 可能與DRR1 蛋白的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域結(jié)合。

DRR1 和TMOD2 均為肌動蛋白的結(jié)合蛋白，都參與F-actin 的形成，但目前的研究發(fā)現(xiàn)二者在某些生物學(xué)功能上呈現(xiàn)相反的作用。通過過表達(dá)DRR1 會導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞棘狀突起的密度降低［15］，然而過表達(dá)TMOD2 則會增加神經(jīng)元細(xì)胞棘狀突起的密度［14］。研究結(jié)果顯示，敲除DRR1 和TMOD2 基因?qū)ｑR神經(jīng)元細(xì)胞早期軸突形成也起到相反的作用，DRR1 基因下調(diào)抑制神經(jīng)元細(xì)胞軸突生長，而TMOD2 基因下調(diào)促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞軸突生長，同時，TMOD2 的表達(dá)下調(diào)對DRR1 shRNA 誘導(dǎo)的異常軸突形成具有保護(hù)作用［11］。

以上結(jié)果提示DRR1 和TMOD2 共同參與調(diào)節(jié)肌動蛋白動力學(xué)，并且兩者對肌動蛋白動力學(xué)的調(diào)節(jié)存在一定的差異，關(guān)于TMOD2 與DRR1 在細(xì)胞中結(jié)合后如何調(diào)節(jié)肌動蛋白動力學(xué)是值得進(jìn)一步研究的問題。