許志晟 朱伯平 黃思聰

梅毒是由梅毒螺旋體(Treponema pallidum，TP)引起的一種性傳播疾病，可通過(guò)性接觸、輸血和垂直傳播傳播。近年來(lái)，梅毒在中國(guó)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。梅毒患者從2005 年的135210 例增加到2014 年的441818 例，增幅超過(guò)其他27 例乙類法定傳染病，居全國(guó)第三位［1］。梅毒可導(dǎo)致神經(jīng)梅毒、心血管、多系統(tǒng)損傷，甚至死亡。因此，及時(shí)診斷和治療梅毒患者至關(guān)重要［2］。梅毒的診斷主要依據(jù)臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)檢查，血清學(xué)試驗(yàn)提供了梅毒的推定診斷，它可以分為非密螺旋體試驗(yàn)和密螺旋體試驗(yàn)。非密螺旋體檢測(cè)主要包括快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)(RPR)、性病研究實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)(VDRL)及甲苯胺紅血清不加熱試驗(yàn)(TRUST)，如果結(jié)果為陽(yáng)性，則進(jìn)行經(jīng)確認(rèn)的密螺旋體檢測(cè)，如TPPA。近年來(lái)，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室開始應(yīng)用密螺旋體免疫分析，如酶免疫分析(EIA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析(CIA)等。這些方法的靈敏度和特異性都很高，但梅毒檢測(cè)尚無(wú)公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)方法［3］。以往研究表明，TP15 蛋白在梅毒螺旋體中含量豐富，是一種具有較高特異性的外膜蛋白成分，在各期梅毒患者的血清中均能夠檢測(cè)到針對(duì)該蛋白的特異性免疫球蛋白G(IgG)抗體［4］。因此，本研究通過(guò)基因工程技術(shù)克隆表達(dá)TP15蛋白，并通過(guò)建立ELISA 方法評(píng)價(jià)其作為診斷抗原的應(yīng)用價(jià)值，為開發(fā)和優(yōu)化新一代梅毒診斷試劑盒提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 TP 模板：梅毒螺旋體Nichols 株基因組DNA 由廣州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)系實(shí)驗(yàn)室保存。載體及菌株:原核表達(dá)載體pET-28b 及大腸桿菌DH5A、大腸桿菌BL21 (DE3)保存于實(shí)驗(yàn)室。血清樣本：梅毒TPPA 陰陽(yáng)性血清由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院收集。主要試劑：購(gòu)自TAKARA 的預(yù)混Ex Taq DNA 聚合酶;購(gòu)自New England Biolabs 的核酸內(nèi)切酶NCOI、SALI和T4 DNA 連接酶。購(gòu)自Fermentas 的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品；購(gòu)自Tiagen 公司的質(zhì)粒提取和PCR 產(chǎn)物回收試劑盒，購(gòu)自JABES 公司30%丙烯酰胺(1∶29)、TRIS、SDS、IPTG 和TRICINE；鎳離子親和色譜柱(histrapgravity)購(gòu)自GE；購(gòu)自Abcam 的酶標(biāo)羊抗人IgG。

1.2 TP15 基因擴(kuò)增 以TP 基因組DNA 為模板設(shè)計(jì)引物forward：5’-CATGCCATGGGCATGGTGAAAAGAG GTGGCGC-3’；reverse：5’-ACGCGTCGACCCTGCTAAT AATGGCTTCCT-3’。TP 模板0.8 ng，上游和下游引物為0.8 μmol/L，2×Premix Ex Taq 為25 μl，蒸餾水為50 μl。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35 次，再72℃延伸5 min。擴(kuò)增PCR 產(chǎn)物和1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.3 pET28b-TP15 質(zhì)粒的構(gòu)建和測(cè)序 目的基因片段與經(jīng)相同雙酶切的pET-28b 載體連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到敏感大腸桿菌BL21 (DE3)中，使用卡那霉素進(jìn)行抗性篩選，獲得重組體，送公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 重組工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)和純化 在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中接種重組工程菌并振蕩培養(yǎng)，次日按1%比例轉(zhuǎn)種于卡那霉素LB 培養(yǎng)基中。當(dāng)OD600 達(dá)到0.8，最終濃度為1.0 mmol/L 時(shí)加入IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)。分別在誘導(dǎo)后0、1、2、3、4 h 收集細(xì)菌，用超聲波破菌。行SDS -PAGE 分析。提取IPTG 誘導(dǎo)與表達(dá)后包涵體沉淀物，用含2 M 尿素和1% Triton X-100 的洗滌液洗滌3 次，再用8 M 尿素沉淀包涵體。用親和層析對(duì)溶解的上清進(jìn)行純化，用450 mM 咪唑洗脫。

1.5 Western blot SDS-PAGE 后，在PVDF 膜上TP15重組蛋白進(jìn)行Western blotting 分析，其中一抗為TPPA陽(yáng)性梅毒血清，二抗為酶標(biāo)羊抗人IgG。

1.6 TP15-ELISA 法的建立 使用碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)將純化的TP15 蛋白稀釋到合適的濃度(由棋盤滴定法確定)，將其包被到空白酶標(biāo)板，4℃孵育過(guò)夜。使用1%BSA 在室溫條件下封閉2 h 后即可使用。血清經(jīng)1∶5 稀釋后37℃溫育1 h，酶標(biāo)抗體工作濃度為1∶20000。用于檢測(cè)臨床收集的44 例TPPA 陽(yáng)性和44 例TPPA 陰性血清，以檢測(cè)獲得的44 份TPPA 陰性血清的平均OD+3SD 為陽(yáng)性臨界值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)分析TPPA法與TP15-ELISA 對(duì)梅毒血清的檢測(cè)結(jié)果。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TP15 表達(dá)載體的測(cè)序和鑒定 TP15 基因片段經(jīng)PCR 擴(kuò)增后進(jìn)行AGE 分析，發(fā)現(xiàn)特異性DNA 條帶約為0.5 KB，與預(yù)期一致。電泳分析的原核表達(dá)載體pET28b-TP15 NCoI/SAII 酶切后顯示兩個(gè)條帶約5.3 KB 和0.5 KB。見圖1。表達(dá)載體的測(cè)序結(jié)果顯示，pET28b 載體克隆的基因序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中注冊(cè)TP15 基因序列是一致的。

圖1 TP15 基因擴(kuò)增產(chǎn)物和表達(dá)載體pET28b-TP15 雙酶切鑒定

2.2 TP15 誘導(dǎo)表達(dá)、純化與驗(yàn)證 經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)后，重組菌pET-28b-TP15-BL21 的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDSPAGE 分析，可見蛋白條帶約20 kDa 左右，隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng) 其表達(dá)量增加，4 h 時(shí)達(dá)到峰值，以包涵體為主要表達(dá)形式。見圖2A。UVP 分析顯示，約細(xì)菌總蛋白含量的30%是本實(shí)驗(yàn)的目的蛋白，純化重組蛋白可得到相對(duì)單一的目的蛋白帶。見圖2B。Western blotting表明TP15 蛋白與TPPA 陽(yáng)性血清具有良好的免疫反應(yīng)性，而與TPPA 陰性血清不發(fā)生反應(yīng)。見圖2C。

圖2 梅毒螺旋體TP15 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化與驗(yàn)證

2.3 ELISA 間接法的檢測(cè)結(jié)果 44 份TPPA 陰性樣品的平均OD 值為0.212，標(biāo)準(zhǔn)差為0.04，因此陽(yáng)性結(jié)果判斷參考值為0.332。在44 份TPPA 陽(yáng)性血清中發(fā)現(xiàn)2 份結(jié)果為陰性的標(biāo)本，在44 份TPPA 陰性血清中發(fā)現(xiàn)2 份結(jié)果為陽(yáng)性的標(biāo)本，TPPA 與TP15-ELISA 檢測(cè)梅毒特異性抗體的符合率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 TPPA 與TP15-ELISA 檢測(cè)臨床血清的結(jié)果(n)

3 討論

梅毒螺旋體是梅毒的病原體。梅毒是一種慢性、多期、全身性疾病，有三種主要傳播方式：性接觸、接觸感染性病變及宮內(nèi)感染。雖然梅毒使用青霉素治療治愈率高，但每年仍然約有1100 萬(wàn)新增感染［5］。先天性梅毒可導(dǎo)致自然流產(chǎn)、死胎、產(chǎn)后死亡或新生兒畸形，目前每年估計(jì)仍有140 萬(wàn)孕婦感染梅毒［6］。此外，已經(jīng)證實(shí)有癥狀的梅毒感染會(huì)使艾滋病毒傳播和獲得的風(fēng)險(xiǎn)增加2～5 倍，對(duì)全球公共衛(wèi)生構(gòu)成的威脅［7］。

目前對(duì)梅毒螺旋體感染的診斷主要依靠病原體的直接檢測(cè)［2］與血清學(xué)抗體檢查［3］。病原體的檢測(cè)取樣及檢測(cè)都比較繁瑣，因此限制了其在臨床上大規(guī)模的應(yīng)用；而在梅毒血清抗體的檢測(cè)中，RPR 和TPPA是診斷梅毒的經(jīng)典方法，但不適于大批量標(biāo)本的篩查。RPR 檢測(cè)梅毒非特異性抗體，存在一定比例的假陽(yáng)性反應(yīng)，且易漏診三期及治療后梅毒，僅適用于梅毒感染的初步篩查［8］。TPPA 是目前國(guó)內(nèi)許多醫(yī)院常用的梅毒確診試驗(yàn)，但檢測(cè)時(shí)標(biāo)本需要系列稀釋，操作煩瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，難以自動(dòng)化，同樣不適合大批量標(biāo)本的篩查［9］。

梅毒螺旋體TP15 脂蛋白是梅毒螺旋體含量豐富的外膜蛋白之一，具有較強(qiáng)的免疫原性，在梅毒感染的各個(gè)期間均可引起高抗體反應(yīng)，且與其他螺旋體疾病患者的血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，是一種針對(duì)梅毒特異性抗體檢測(cè)的新型位點(diǎn)［4］。而ELISA 靈敏度高，特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，可自動(dòng)化，是梅毒篩查的理想方法［10］。

由于梅毒螺旋體難以在體外培養(yǎng)，本研究中我們采用基因工程技術(shù)，構(gòu)建梅毒螺旋體TP15 基因的原核表達(dá)載體，通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)獲得TP15 重組蛋白，經(jīng)SDSPAGE 驗(yàn)證后顯示為單一的蛋白條帶，表明所采用的Ni-NTA 親和層析法可快速獲得高純度的TP15 蛋白，進(jìn)而我們利用TP15 重組蛋白建立了以TP15 為診斷抗原的間接ELISA 檢測(cè)方法。在與傳統(tǒng)梅毒血清學(xué)診斷方法比較中發(fā)現(xiàn)，TPPA 與TP15-ELISA 檢測(cè)梅毒特異性抗體的符合率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

綜上所述，通過(guò)基因工程獲得的TP15 蛋白具有良好的臨床應(yīng)用前景，可以作為研發(fā)新一代梅毒診斷試劑重要物質(zhì)基礎(chǔ)。