秦那日蘇 包小蘭

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特 010018)

葵花籽是世界上四大主要油料種子之一[1]?？ㄗ哑墒强ㄗ阎朴秃蟮母碑a(chǎn)物，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，其蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)29%～43%[2]，抗?fàn)I養(yǎng)化合物含量低且不含有毒物質(zhì)，因此是一種極好的蛋白質(zhì)來源[3]。然而，葵花籽蛋白的應(yīng)用仍然局限于動(dòng)物飼料，盡管葵花籽蛋白的功能特性被證明與大豆和其他豆類的蛋白相當(dāng)[4]。一個(gè)主要的原因是葵花籽中含有酚類化合物，它們很容易在傳統(tǒng)的堿性蛋白質(zhì)提取過程中被氧化導(dǎo)致蛋白質(zhì)變成墨綠色或灰色，不僅顏色很難讓消費(fèi)者接受，而且還會(huì)降低蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能特性[5，6]。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)葵花籽蛋白的脫色方法主要有活性炭吸附法[7，8]、有機(jī)溶劑萃取法[9]、雙氧水氧化法[10，11]及大孔樹脂吸附法[12]。大孔樹脂吸附法具有選擇性好、吸附容量大、樹脂易再生、環(huán)保及蛋白損失率低等優(yōu)點(diǎn)[13]。Pickardt等[5]在酸性條件下通過XAD-16 大孔樹脂吸附來提取低多酚葵花籽蛋白，發(fā)現(xiàn)大孔樹脂吸附處理后脫色效果顯著，其白度值(L*)為77.3，而且功能性質(zhì)也有所提高。為了提升植物蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能性質(zhì)，目前多數(shù)通過酶法改性來實(shí)現(xiàn)，酶解能夠正向修飾蛋白質(zhì)，可以破壞特定的肽鍵，從而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，酶解法的優(yōu)點(diǎn)是pH和溫度條件溫和、反應(yīng)副產(chǎn)物少、特異性高，易控制，安全等優(yōu)點(diǎn)，從而改善蛋白質(zhì)的提取率和功能性質(zhì)。近年來，人們通過酶解結(jié)合吸附劑來提取植物蛋白或多糖，發(fā)現(xiàn)這個(gè)方法不僅可以提高功能性質(zhì)，還對(duì)脫色效果具有顯著的影響。鄒東恢[14]使用纖維素酶和木瓜蛋白酶的混合酶結(jié)合活性炭吸附來提取枸杞多糖，發(fā)現(xiàn)提取出來的枸杞多糖脫色效果顯著，脫色率為72.4%。張曉平等[15]利用堿性蛋白酶結(jié)合YD-303活性炭吸附來提取脫色燕麥蛋白，發(fā)現(xiàn)在最佳工藝條件下燕麥蛋白的脫色率高達(dá)85.36%。

本研究旨在通過限制性酶解后再結(jié)合大孔樹脂進(jìn)行吸附處理來提取葵花籽蛋白，促進(jìn)葵花籽粕在人體營(yíng)養(yǎng)方面的應(yīng)用，同時(shí)分離出酚類化合物的來提高整個(gè)工藝的經(jīng)濟(jì)性，以期獲得感官特性和功能特性都較好的葵花籽蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫脫脂葵花籽粕;AB-8、DA01和DA201型大孔樹脂;堿性蛋白酶(Alcalase 2.4L)、風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme500 MG)、中性蛋白酶(Neutrase 1.5MG);所用化學(xué)試劑均為分析純，用蒸餾水制備所有溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

LCJ-25C型冷凍干燥機(jī)，CR-10型色差計(jì)，K116型凱氏定氮儀，UV-2300型紫外分光光度計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 葵花籽蛋白的制備

稱取低溫脫脂葵花籽粉50 g，加500 mL無水乙醇1∶10 (g/mL)混合攪拌均勻，在25 ℃恒溫水浴鍋中攪拌1 h，離心(4 000 r/min，15 min)，取沉淀加750 mL (15倍)蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?，?.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH 7.0，在50 ℃恒溫水浴鍋中攪拌1 h，離心(4 000 r/min，15 min)，取上清液，用0.1 mol/L HCl調(diào)pH至4.0進(jìn)行蛋白酸沉，離心(4 000 r/min，15 min)取沉淀，沉淀水洗3次，收集沉淀用0.1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0，冷凍干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 大孔樹脂吸附脫色葵花籽蛋白的制備

稱取低溫脫脂葵花籽粉50 g，加500 mL 1.3 mol/L的氯化鈉溶液(1∶10，g/mL)混合攪拌均勻，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至6.0，然后在25 ℃恒溫水浴鍋中攪拌1h，離心(4 000 r/min，15 min)收集上清液，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至7.0，用AB-8型、D101和DA201大孔樹脂進(jìn)行吸附(10%大孔樹脂，120 min)，過濾樹脂收集上清液，用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至3.8酸沉，離心(4 000 r/min，15 min)取沉淀，用蒸餾水將沉淀水洗3次，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至7.0，冷凍干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 限制性酶解結(jié)合大孔樹脂吸附脫色葵花籽蛋白的制備

稱取低溫脫脂葵花籽粉50 g，加500 mL 1.3 mol/L的氯化鈉溶液(1∶10，g/mL)混合攪拌均勻，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至6.0，然后在25 ℃恒溫水浴鍋中攪拌1 h，離心(4 000 r/min，15 min)收集上清液，加堿性、中性和風(fēng)味蛋白酶限制性酶解10 min (1%酶添加量，最適酶解 pH和溫度)，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至7.0，用AB-8型、D101和DA201大孔樹脂進(jìn)行吸附(10%大孔樹脂，120 min)，過濾樹脂收集上清液，用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至3.8酸沉，離心(4 000 r/min，15 min)取沉淀，用蒸餾水將沉淀水洗3次，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至7.0，冷凍干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 葵花籽蛋白色澤的測(cè)定

采用CR-10色差儀進(jìn)行葵花籽蛋白色澤的測(cè)定，首先進(jìn)行黑白板自動(dòng)校正，自動(dòng)校正完成后進(jìn)入標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量界面，按測(cè)試鍵，讀出標(biāo)準(zhǔn)樣的L*、a*、b*值，進(jìn)行樣品色澤的測(cè)定(取3次平均值)。

1.3.5 葵花籽蛋白得率及含量的測(cè)定

含量與得率的測(cè)定:蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用凱氏定氮法。

式中:m1為提取蛋白質(zhì)質(zhì)量/g；m0為葵花籽粕粉質(zhì)量/g。

1.3.6 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以L*值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別對(duì)pH(5、6、7、8、9)，加酶量(0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%)、酶解時(shí)間(0、5、10、15、20 min)、酶解溫度(40、45、50、55、60 ℃)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，以確定各因素的適宜范圍和影響效果。

1.3.7 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇酶解溫度、酶解pH、酶解時(shí)間、酶添加量為影響因素，固定料液比為1∶10(g/mL)，pH為6.0，使用色差計(jì)測(cè)定葵花籽蛋白的白度值(L*值)，以葵花籽蛋白質(zhì)白度值(L*)為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行正交工藝參數(shù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，并確定四因素三水平的最佳參數(shù)進(jìn)行正交設(shè)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.4 溶解性的測(cè)定

根據(jù)Bera等[16]的方法并稍作修改測(cè)定葵花籽蛋白的溶解度，用蒸餾水配制1 g/mL的蛋白樣品溶液，用0.1 mol/L HCl或NaOH調(diào)pH為7，室溫?cái)嚢? h后，離心(4 000 r/min，15 min),利用凱式定氮儀測(cè)定蛋白質(zhì)含量。通過公式計(jì)算：

1.5 起泡性及泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定

參照 Motoi等[17]的方法并做一定調(diào)整，用蒸餾水配制1 g/mL的蛋白質(zhì)樣品溶液。取50 mL置于高速組織攪拌機(jī)內(nèi)，以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速攪打2 min。記錄泡沫體積，靜置30 min后，再次記錄泡沫體積。起泡性(FC)及泡沫穩(wěn)定性(FS)通過公式計(jì)算：

式中:V0是攪打剛停止時(shí)泡沫體積/mL；VL是樣品溶液體積/mL；V30是靜置30 min后的泡沫體積/mL。

1.6 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

用Yust等[18]的方法來測(cè)定乳化性及乳化穩(wěn)定性，用蒸餾水配制濃度為1 mg/mL的蛋白樣品溶液，將15 mL蛋白質(zhì)溶液與5 mL大豆油(3∶1)攪拌混合，在12 000 r/min的條件下均質(zhì)2 min，分別在0 min (A0)和靜置10 min (A10)后從容器底部取50 μL乳濁液，與5 mL(0.1%，g/mL)的SDS溶液混合均勻，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定吸光度值。使用公式計(jì)算乳化性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)：

式中:Φ為0.01；θ為溶液中油的體積分?jǐn)?shù)(0.25)；C為樣品的溶液質(zhì)量濃度/g/mL。

1.7 持油性及持水性的測(cè)定

根據(jù)Wani等[19]方法測(cè)定持油性及持水性，稱取0.5 g 樣品(m0)置于 50 mL 離心管中，稱重(m1)，加入10 mL大豆油(水)，漩渦振動(dòng) 5 min使其混合均勻，室溫下靜置30 min后，4 000 r/min離心30 min，移除上清大豆油(水)，再稱重(m2)。持油性/持水性(mL/g)計(jì)算公式為：

持油性/持水性=(m2-m1)/m0×100

式中:m0為蛋白質(zhì)量/g；m1為離心管質(zhì)量/g；m2為去掉上清液后的離心管質(zhì)量/g。

1.8 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件里的方差分析(ANOVA) 進(jìn)行兩組間的數(shù)據(jù)分析，P<0.05表示兩組之間具有顯著性差異，采用 Origin 2017作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型蛋白酶結(jié)合大孔樹脂吸附對(duì)葵花籽蛋白脫色效果的影響

選擇堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶限制性酶解10 min(最適pH及溫度)結(jié)合D101型大孔樹脂、AB-8型大孔樹脂及DA201型大孔樹脂(10%大孔樹脂，吸附120 min)吸附處理對(duì)葵花籽蛋白脫色效果的影響，不同類型蛋白酶結(jié)合大孔樹脂吸附對(duì)葵花籽蛋白脫色效果的影響見表2。

表2 不同類型蛋白酶結(jié)合大孔樹脂吸附對(duì)葵花籽蛋白脫色效果的影響

由表2可知，未脫色葵花籽蛋白白度值(L*)為55.7，呈深灰色；經(jīng)不同類型的大孔樹脂吸附處理后脫色效果顯著，蛋白顏色均有不同程度的改善，其中AB-8型大孔樹脂吸附脫色葵花籽蛋白的L*值最高，為72.2，先通過不同蛋白酶進(jìn)行限制性酶解再結(jié)合大孔樹脂吸附處理后發(fā)現(xiàn)具有更好的脫色效果，堿性蛋白酶限制性酶解后再結(jié)合AB-8型大孔樹脂的吸附處理的脫色效果最好，其白度值最高為80.8，與其他蛋白酶和大孔樹脂相比具有顯著性差異(P<0.05)，表明限制性酶解后再結(jié)合大孔樹脂吸附對(duì)葵花籽蛋白脫色效果具有顯著的影響。因此選用堿性蛋白酶限制性酶解結(jié)合AB-8型大孔樹脂處理進(jìn)行下一步工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.2 單因素條件對(duì)葵花籽蛋白脫色效果的影響

2.2.1 酶解溫度對(duì)葵花籽蛋白脫色效果的影響

在pH為7.0、酶解時(shí)間為10 min和酶添加量為1.0%的固定條件下，改變酶解溫度分別為40、45、50、55、60 ℃，探討酶解溫度對(duì)葵花籽蛋白脫色效果的影響，其結(jié)果如圖1所示。酶解溫度從40 ℃升高至50 ℃過程中，葵花籽蛋白L*值呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，在酶解溫度為50 ℃時(shí)白度值L*達(dá)到最高，這是由于適宜的溫度可以增加蛋白質(zhì)在水中的溶解度，而且溫度的升高在一定程度上有利于大孔樹脂的吸附作用，從而促使葵花籽蛋白的白度值(L*)升高。隨著酶解溫度的升高，蛋白白度值發(fā)生驟降，這是由于蛋白質(zhì)對(duì)溫度敏感，過高的溫度可使其發(fā)生變性，繼續(xù)升高溫度不利于酶作用的最適條件以及蛋白凝膠的穩(wěn)定性，故選擇酶解溫度為50 ℃。

圖1 不同處理對(duì)葵花籽蛋白脫色效果的影響

2.2.2 酶解pH對(duì)葵花籽分離蛋白脫色效果的影響

在酶解溫度為50 ℃、酶解時(shí)間為10 min和酶添加量為1.0%的固定條件下，改變pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，探討pH對(duì)葵花籽蛋白脫色效果的影響，其結(jié)果如圖1所示。在pH 5.0～6.0之間，葵花籽粕蛋白質(zhì)白度值(L*)不斷提高，因此一定的pH值有利于葵花好柏蛋白質(zhì)提取，在其他條件保持不變的情況下，在酶解 pH為6.0的時(shí)候葵花籽蛋白的白度值(L*)達(dá)到最高，但隨著pH的增大，葵花籽蛋白質(zhì)的L*值開始持續(xù)下降，脫色效果降低，因?yàn)楫?dāng)pH接處于等電點(diǎn)附近時(shí)，溶液中存在大量蛋白顆粒，不利于蛋白酶作用；當(dāng)pH遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，葵花蛋白分子所帶有的同種電荷量增多，分子間的主要作用力為靜電排斥力，而蛋白質(zhì)被酶解后，會(huì)暴露出部分疏水基團(tuán)，其與靜電斥力產(chǎn)生相互吸引。當(dāng)pH為6.0時(shí)白度值L*達(dá)到最大值，說明在此條件下，大孔樹脂對(duì)蛋白的吸附作用最為適宜，故選擇pH為6.0。

2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)葵花籽蛋白脫色效果的影響

在酶解溫度為50 ℃、pH為7.0和酶添加量為1.0%的固定條件下，改變酶解時(shí)間分別為0、5、10、15、20 min，探討酶解時(shí)間對(duì)葵花籽蛋白脫色效果的影響，其結(jié)果如圖1所示。酶解時(shí)間對(duì)葵花籽蛋白的L*值的影響顯著，酶解時(shí)間從0～10 min過程中，隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)葵花籽蛋白的L*值由72.2提高至80.9，提高幅度較大，10 min之后，葵花籽蛋白的L*值隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，分析原因認(rèn)為，利用限制性酶解葵花籽蛋白打斷部分肽鍵，暴露出適量的疏水性氨基酸殘基，從而提供大孔樹脂更深層次的吸附，但若水解過度則會(huì)將蛋白質(zhì)降解為短肽，不利于大孔樹脂的吸附作用，故選擇酶解時(shí)間為10 min。

2.2.4 加酶量對(duì)葵花籽蛋白脫色效果的影響

在酶解溫度為50 ℃、酶解時(shí)間為10 min和pH為7.0的固定條件下，改變加酶量分別為0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%，探討加酶量對(duì)葵花籽蛋白脫色效果的影響，其結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，在加酶量0.6%～0.8%之間，葵花籽蛋白的L*值不斷提高，加酶量為0.8%的時(shí)候葵花籽蛋白的L*值達(dá)到最高，因此一定的酶添加量有利于脫除綠原酸從而改善葵花籽蛋白質(zhì)的顏色，在其他條件保持不變的情況下，隨著酶添加量的增加，葵花蛋白L*值呈急速下降趨勢(shì)，脫色效果降低，故選擇加酶量為0.8%。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

在單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析基礎(chǔ)上，選擇酶解溫度、pH、酶解時(shí)間、加酶量為考察因素，以白度值(L*)為考察指標(biāo)，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果分析表見表3。從表3中比較極差R值大小可知，影響葵花籽蛋白脫色效果的各因素主次順序分別為B(酶解時(shí)間)>A(pH值)>C(酶解溫度)>D(加酶量)。通過正交實(shí)驗(yàn)得到最佳脫色工藝條件為：酶解時(shí)間10 min、酶解pH 6.0、酶解溫度55 ℃、酶添加量0.8%，在此條件下葵花籽蛋白的L*值為84.5、a*值2.7、b*值12.6。

表3 正交試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果分析表

2.4 限制性酶解結(jié)合大孔樹脂吸附脫色對(duì)葵花籽蛋白得率及含量的影響

葵花籽蛋白和限制性酶解結(jié)合大孔樹脂吸附脫色葵花籽蛋白的得率及蛋白質(zhì)含量見表4，由表4可知，與葵花籽蛋白相比，限制性酶解結(jié)合大孔樹脂吸附脫色的葵花籽蛋白的得率和蛋白質(zhì)含量都明顯提高，這可能是由于一方面限制性酶解之后導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，結(jié)構(gòu)伸展，疏水基團(tuán)暴露，加快了溶劑的滲透效率，從而提高了蛋白質(zhì)得率。另一方面，適宜的pH和NaCl濃度會(huì)降低蛋白和多酚類物質(zhì)的氧化作用，從而提高蛋白產(chǎn)量。Pickardt等[14]在pH 6和1.3 mol/L NaCl條件下采用XAD-16大孔樹脂進(jìn)行吸附條件下提取低酚葵花籽蛋白，發(fā)現(xiàn)不僅可以改善葵花籽蛋白顏色，還能有效提高蛋白得率。

表4 限制性酶解結(jié)合大孔樹脂吸附脫色對(duì)葵花籽蛋白得率及含量的影響

2.5 限制性酶解結(jié)合大孔樹脂吸附脫色對(duì)葵花籽蛋白功能特性的影響

溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性、起泡性及泡沫穩(wěn)定性和持油性及持水性都是蛋白質(zhì)重要的功能特性，在焙烤食品、飲料及肉制品等食品工業(yè)中具有重要作用，葵花籽蛋白和限制性酶解結(jié)合大孔樹脂吸附脫色葵花籽蛋白的功能特性見表5。

由表5可知，與未脫色葵花籽蛋白相比，限制性酶解結(jié)合大孔樹脂吸附脫色對(duì)葵花籽蛋白的溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性、起泡性和持水性都顯著提高(P<0.05)，這可能是由于限制性酶解后蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生伸展，分子量降低，蛋白質(zhì)更容易在界面擴(kuò)散，界面的吸附能力加強(qiáng)，使得疏水性基團(tuán)具有親水親油性，所以蛋白的溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性、起泡性和持水性都增強(qiáng)了，限制性酶解結(jié)合大孔樹脂吸附脫色葵花籽蛋白的持油性及泡沫穩(wěn)定性略低于未脫色葵花籽蛋白，這可能是由于限制性酶解產(chǎn)生的小肽不足以維持泡沫的穩(wěn)定，導(dǎo)致酶解產(chǎn)物的泡沫穩(wěn)定性降低了，另一方面由于限制性酶解破壞了蛋白原有的結(jié)構(gòu)，減弱了其物理包覆能力，蛋白的吸附能力降低，最終導(dǎo)致持油性降低。Jin等[20]使用胰蛋白酶對(duì)核桃蛋白進(jìn)行限制性酶解后發(fā)現(xiàn)其溶解性、乳化性、起泡性均顯著提高。限制性酶解結(jié)合大孔樹脂吸附脫色處理可以提高葵花籽蛋白的功能特性。

表5 限制性酶解結(jié)合大孔樹脂吸附脫色對(duì)葵花籽蛋白功能特性的影響

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)分析，優(yōu)化葵花籽分離蛋白的脫色工藝條件，正交試驗(yàn)分析得出：限制性酶解結(jié)合大孔樹脂吸附脫色的最佳工藝參數(shù)為酶解時(shí)間10 min、酶解pH 6.0、酶解溫度55 ℃、酶添加量0.8%。在此條件下葵花籽蛋白的白度值(L*)為84.5、a*值2.7、b*值12.6，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和得率分別為(97.65±0.23)%和(7.22±0.02)%，葵花籽蛋白顏色由深灰色變?yōu)闇\白色，脫色效果顯著。限制性酶解結(jié)合大孔樹脂吸附脫色葵花籽蛋白的溶解度、起泡性及起泡穩(wěn)定性和乳化性及乳化穩(wěn)定性均得到顯著提高(P<0.05)，持油性和泡沫穩(wěn)定性降低，限制性酶解結(jié)合大孔樹脂吸附不僅對(duì)葵花籽蛋白脫色具有顯著效果，還對(duì)葵花籽蛋白的功能特性的提升有顯著的影響。該工藝可以促進(jìn)葵花籽粕加工的開發(fā)，滿足食品工業(yè)在尋找大豆蛋白以外的優(yōu)質(zhì)植物蛋白方面的要求。