陳 斌 楊玥熹,2 李自成 沈聆清 李娟娟 顧振宇,2

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院1，杭州 310018)(國家級食品工程與質(zhì)量安全實驗教學(xué)中心2，杭州 310018)

黃漿水是豆腐、豆干、千張等凝膠類豆制品生產(chǎn)時所產(chǎn)生的副產(chǎn)物，它含有豐富的營養(yǎng)因素，是一種天然的微生物培養(yǎng)基[1]。酸漿是由多種微生物共同發(fā)酵黃漿水得到的一種凝固劑[2]。在我國，酸漿用作豆腐凝固劑已超過40年，它除能沉降蛋白以外，更賦予豆制品獨有的質(zhì)構(gòu)、醇香和生物活性[3]。在我國民間已有通過黃漿水自然發(fā)酵制取酸漿，進而用酸漿制作豆腐的工藝，制成的酸漿豆腐味道濃郁、口感佳，不引入重金屬離子，是一種純綠色食品，而且它還充分利用了黃漿水，保護了環(huán)境又物盡其用，值得深入研究和廣泛推廣[4-6]。有研究表明，利用酸漿點漿制成的豆腐在感官、保健性、出品率等方面都優(yōu)于傳統(tǒng)豆腐，同時提高了豆腐的保健功能[7]。但豆制品黃漿水發(fā)酵研究尚處于起步階段，體系不完善；同時自發(fā)發(fā)酵的酸漿中菌種復(fù)雜，酸漿品質(zhì)得不到保證，導(dǎo)致酸漿豆腐的生產(chǎn)存在問題。

黃漿水中含有多種有機酸，包括檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、醋酸、乳酸、富馬酸、乙酸等[8]。它們不僅具有抑菌、利膽、消炎、降血糖、抗氧化以及調(diào)節(jié)機體免疫等作用[9]，而且能夠增加冠狀動脈血流量、抑制腦組織脂質(zhì)過氧化物生成、軟化血管、促進鈣、鐵元素的吸收，幫助胃液消化脂肪，預(yù)防疾病和促進新陳代謝[10]。經(jīng)微生物發(fā)酵后有機酸含量會發(fā)生變化，影響酸漿豆腐的品質(zhì)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，自然發(fā)酵酸漿中乳酸菌是酸漿中的主要微生物，酸漿中的有機酸多為L-乳酸[12]。但是,目前對于黃漿水發(fā)酵前后有機酸變化研究較少。

本研究選用工業(yè)化菌種植物乳桿菌發(fā)酵黃漿水，通過發(fā)酵工藝優(yōu)化，得到新型酸漿凝固劑，并用其替代傳統(tǒng)豆腐凝固劑，研究適合于酸漿凝固劑發(fā)揮最佳效果的豆腐制備工藝參數(shù)，以提升豆腐品質(zhì)，獲得量產(chǎn)的酸漿豆腐產(chǎn)品，迎合當(dāng)代消費者追求天然與健康飲食的觀念。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆(產(chǎn)地：東北)、黃漿水、植物乳桿菌；富馬酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、檸檬酸、乙酸、草酸均為優(yōu)級純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent-1260-Infinity型高效液相色譜儀，INFINZTE-M-NA型酶標(biāo)儀，SW-CJ-1FD型潔凈工作臺，F(xiàn)ive Easy Plus pH計，Agilent-7890A型氣相質(zhì)譜色譜儀。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌的活化

吸取10 mL滅菌后的MRS液體培養(yǎng)基在無菌試管中，用無菌接種環(huán)蘸取適量的植物乳桿菌菌粉，接種在試管中，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，傳代3次，作為種子菌種備用[13]。

1.3.2 酸度的測定

參照GB 5009.239—2016的方法[14]。采用酚酞指示劑法測定黃漿水的酸度。

1.3.3 菌落總數(shù)的測定

參照GB 4789.2—2016的方法[15]，采用平板計數(shù)法測定黃漿水的菌落總數(shù)。

1.3.4 黃漿水發(fā)酵條件優(yōu)化

以葡萄糖添加量(0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%)、發(fā)酵溫度(30、32、34、36、38 ℃)、初始pH(4.5、5、5.5、6、6.5)、接種量(2%、4%、6%、8%、10%)、發(fā)酵時間(24、36、48、60、72 h)為因素，分別考察上述因素對酸漿中活菌數(shù)和產(chǎn)酸量的影響，以確定最優(yōu)的黃漿水發(fā)酵條件。

1.3.5 有機酸含量的測定

1.3.5.1 色譜條件

色譜柱：ZOPBAX Eclipse XDB-C18 (4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流動相條件：甲醇(A)，0.01 mol/L KH2PO4-HPO4(B)，用85%的磷酸調(diào)節(jié)pH=2.85；洗脫比例：A∶B=5∶95；流速：0.8 mL/min；波長：210 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

1.3.5.2 有機酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取7種有機酸標(biāo)準(zhǔn)品，用流動相B液稀釋成不同的倍數(shù)，放置于4 ℃冰箱中。

1.3.5.3 樣品處理

準(zhǔn)確吸取5 mL黃漿水樣品，12 000 r/min下離心30 min。離心后，吸取1 mL上清液，使用0.45 μm濾膜過濾，置于樣品瓶中，待測[16]。

1.3.6 酸漿豆腐的制備

挑選大豆100 g，豆水比為1∶4，在25 ℃條件下浸泡12 h，洗凈，選擇干豆與水的比為1:7磨漿，過濾后量取400 mL的豆?jié){煮漿，煮漿溫度控制在95～100 ℃。煮漿后待溫度下降到85 ℃，添加豆?jié){總量10%的酸漿凝固劑，緩慢加入，待出現(xiàn)大片豆花時停止攪拌，放入60 ℃恒溫水浴鍋中，保溫30 min，然后放入模具中壓制30 min。

1.3.6.1 凝固劑添加量

分別加入豆?jié){體積9%、10%、11%、12%的酸漿凝固劑，然后按照1.2.6的方法制作酸漿豆腐。

1.3.6.2 點漿溫度

按照1.2.6的方法制作酸漿豆腐，酸漿豆腐凝固劑的添加量為豆?jié){體積的10%，控制點漿溫度為75、80、85、90 ℃。

1.3.6.3 磨漿料液比

按照干豆和水的比例1∶5、1∶6、1∶7、1∶8磨漿，然后按照1.2.6的方法制作酸漿豆腐。

1.3.7 酸漿豆腐品質(zhì)評價

1.3.7.1 豆腐持水率的測定[17]

稱取約2 g新鮮豆腐，記錄質(zhì)量為W1，將其置于底部有脫脂棉的50 mL離心管中，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min后并稱重，記錄質(zhì)量為W2，然后將樣品置于105 ℃烘箱中干燥6 h后稱重，質(zhì)量記為W3，豆腐持水率按公式計算。

持水率=(W2-W3)/(W1-W3)×100%

1.3.7.2 豆腐色澤的測定

豆腐色澤指標(biāo)的測定參考GB/T 12097—1989，使用全自動色差計測定色度(以L*，a*，b*值表示，用白板校準(zhǔn))，平行測定3次[18]。

1.3.7.3 豆腐全質(zhì)構(gòu)(TPA)和凝膠強度的測定

參考李玉娥等[19]的方法并略作修改，將酸漿豆腐切割成2.5 cm×2.5 cm×2.5 cm的立方塊，置于測試平臺上。采用TPA模式進行豆腐的質(zhì)構(gòu)分析，測定參數(shù)是：探頭型號P/0.5，測前速度1 mm/s，測中速度1 mm/s，測后速度1 mm/s，應(yīng)變30%，時間5 s，觸發(fā)類型：auto，觸發(fā)力：5 g。樣品平行測定3次。凝膠強度的測試參數(shù)將TPA模式中應(yīng)變30%改為最大位移15 mm，其他條件不變，凝膠強度定義為凝膠破裂所需應(yīng)力(g)。

1.3.7.4 酸漿豆腐微觀結(jié)構(gòu)的測定

參考Liang等[20]的方法，將豆腐凝膠切成約1.5 mm的厚薄片，置于的2.5%戊二醛溶液(0.1 mol/L pH=7.4的磷酸緩沖液配置)中固定的36 h。然后經(jīng)磷酸緩沖液漂洗3次，每次10 min，再用體積分數(shù)為30%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇對樣品進行梯度脫水，每次20 min，然后用無水乙醇脫水2次，每次30 min。脫水后的樣品經(jīng)叔丁醇置換2次，每次30 min。最后樣品經(jīng)液氮預(yù)冷凍后，進行真空冷凍干燥，然后進行離子濺射噴金處理，最后用SEM對斷面結(jié)構(gòu)進行觀察。

1.3.7.5 酸漿豆腐感官評定

感官評價小組由7名熟悉感官評價的食品專業(yè)學(xué)生組成，分別對豆腐樣品進行打分，各項指標(biāo)滿分為10分，感官得分最終以加權(quán)平均分表示[21]。感官評價評分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 酸漿豆腐感官評定打分表

豆腐加權(quán)得分=風(fēng)味得分×10%+口感×20%+色澤×20%+表觀結(jié)構(gòu)×20%+總體可接受性×30%。

2 結(jié)果和分析

2.1 黃漿水發(fā)酵條件優(yōu)化

由圖1a所示，隨著葡萄糖添加量的增加，體系的酸度顯著升高，當(dāng)葡萄糖添加量為0.6%時，酸度達到最大值60oT。隨著發(fā)酵溫度的升高，酸度的升高也呈現(xiàn)顯著性，在發(fā)酵溫度達到34 ℃時，酸度達到最高值。酸度隨著pH升高呈現(xiàn)出明顯下降的趨勢，在pH為6.5時酸度最小。微生物接種量對酸度無極顯著的影響，在接種量為8%時，該條件下的酸度達到最大值。隨著時間的延長，酸度整體呈現(xiàn)增長的趨勢。

發(fā)酵條件對酸漿中活菌數(shù)的影響如圖1b所示。當(dāng)葡萄糖添加量到達0.6%時，活菌數(shù)達到最大值，有研究表明，碳源增加會促進微生物的生長，但是碳氮比要在一個合適的范圍內(nèi)，之后再繼續(xù)增加碳源會使得微生物細胞的滲透壓發(fā)生改變，降低微生物的出生率[22]。在溫度達到36 ℃時，微生物不再生長且達到最大值。活菌數(shù)隨著pH的升高呈現(xiàn)先增大再減小的趨勢，在pH為4.5時，活菌數(shù)最小，可能因為pH過低，抑制了微生物的生長，繼續(xù)增加pH為5時，活菌數(shù)到達最大值。隨著發(fā)酵時間的增長，活菌數(shù)則表現(xiàn)出逐漸下降的趨勢，時間越長，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)越少，同時，植物乳桿菌的穩(wěn)定期為發(fā)酵12 h左右，之后就會出現(xiàn)衰亡率大于出生率，使得整體微生物呈現(xiàn)衰亡現(xiàn)象。

圖1 發(fā)酵條件對黃漿水酸度和菌落數(shù)的影響

2.2 正交實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，進行正交實驗。其因素水平見表2，參考石道函等[23]的方法，使用綜合評分法來確定最終的實驗結(jié)果，綜合評分結(jié)果見表3。

表2 正交實驗因素水平表

表3 正交實驗綜合評分表

由表4可知，五個因素對黃漿水發(fā)酵后酸度和菌落數(shù)的影響程度依次是葡萄糖添加量>發(fā)酵時間>接種量>初始pH>發(fā)酵溫度。植物乳桿菌發(fā)酵豆干黃漿水的最優(yōu)組合為A3B2C3D3E2,即葡萄糖添加量0.8%，初始pH5.5、接種量8%、發(fā)酵時間48 h，發(fā)酵溫度34 ℃。

表4 綜合結(jié)果極差分析表

2.3 黃漿水發(fā)酵前后有機酸含量的變化

黃漿水經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后，有機酸總量有顯著性升高。這與發(fā)酵過程中黃漿水的pH值逐漸下降是一致的。從表5中可以看出，植物乳桿菌發(fā)酵黃漿水過程中主要產(chǎn)生了乳酸。通過比較發(fā)酵前和發(fā)酵后的有機酸含量，乳酸含量由(16.26±0.09)μg/mL升高到(865.31±0.04)μg/mL。乙酸含量由(190.61±0.02)μg/mL降低為(76.58±0.05)μg/mL，這可能因為乙酸在黃漿水發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)換成了醇類或者醛類等其他物質(zhì)。

表5 黃漿水發(fā)酵前后7種有機酸含量變化

2.4 酸漿豆腐點漿工藝研究

如圖2所示，當(dāng)改變點漿溫度時，豆腐持水性和凝膠強度的變化趨勢呈現(xiàn)一致性。當(dāng)點漿溫度在85 ℃時，豆腐持水性和凝膠強度都達到最大，且與其他溫度條件下有顯著性差異。原因是由于溫度升高過程中，豆?jié){蛋白質(zhì)會暴露出更多的巰基基團，促進二硫鍵的交聯(lián)，使得蛋白質(zhì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更加緊密，增加蛋白質(zhì)的凝膠強度，但是溫度太高會使得巰基氧化現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，對凝膠強度和持水性產(chǎn)生負面影

圖2 不同條件酸漿豆腐持水率和凝膠強度的影響

響[24-26]。隨著凝固劑的添加量的增加，豆腐的凝膠強度出現(xiàn)先增加再減少的趨勢，當(dāng)凝固劑添加量為10%時，豆腐持水性和凝膠強度顯著性升高。主要是因為凝固劑添加量的增加可以增強蛋白質(zhì)間的疏水作用，氫鍵間的相互作用力加強，導(dǎo)致蛋白之間的凝膠強度加大。但是凝固劑的添加量如果過大，會使得蛋白質(zhì)的酸化速率過快，此時的蛋白質(zhì)的凝膠網(wǎng)路結(jié)構(gòu)就會比較差[27]。隨著水豆比的增加，豆腐的凝膠強度和持水性總體呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，當(dāng)水豆比為8時與其他組別有顯著性差異(P< 0.05)。

2.5 酸漿豆腐品質(zhì)評價

2.5.1 質(zhì)構(gòu)特性和色澤

從表6中可以看出，市售酸漿豆腐和試制酸漿豆腐除了彈性指標(biāo)無顯著性差異，其余各項指標(biāo)二者之間都具有顯著性差異，并且市售豆腐的指標(biāo)遠遠大于試制酸漿豆腐。試制酸漿豆腐的白度和市售酸漿豆腐無顯著性差異，市售豆腐的色澤更偏綠偏黃。

表6 酸漿豆腐質(zhì)構(gòu)和色澤

2.5.2 微觀結(jié)構(gòu)

如圖3所示，二者之間的蛋白凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)明顯不同，市售酸漿豆腐的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更為細致緊密，所以蛋白凝膠強度比較大，試制酸漿豆腐的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)比較粗糙，但蛋白間的空洞比較小。

圖3 酸漿豆腐的掃描電鏡圖

2.5.3 感官分析

從圖4可以看出，市售酸漿豆腐的風(fēng)味較好，可能的原因是市售酸漿豆腐由自然發(fā)酵的酸漿制成，風(fēng)味物質(zhì)比較多，但是試制酸漿豆腐的表觀結(jié)構(gòu)以及口感還有總體可接受性分數(shù)明顯高于市售酸漿豆腐，結(jié)合質(zhì)構(gòu)與色差結(jié)果綜合分析可知，豆腐的總體接受度與其凝膠強度不成正相關(guān)。

圖4 酸漿豆腐的感官分析

3 結(jié)論

本研究通過單因素和正交實驗優(yōu)化黃漿水發(fā)酵工藝，最佳條件為：葡萄糖添加量0.8%，初始pH 5.5、接種量8%、發(fā)酵時間48 h，發(fā)酵溫度34 ℃。發(fā)酵后，酸漿中有機酸含量顯著升高，其中乳酸和乙酸變化最為明顯。與市售豆腐相比，試制酸漿豆腐凝膠強度和持水性較大，凝膠微觀結(jié)構(gòu)空隙大，試制酸漿豆腐的感官品質(zhì)穩(wěn)定，表觀結(jié)構(gòu)、口感以及總體可接受性高于市售酸漿豆腐。本研究利用植物乳桿菌發(fā)酵黃漿水作為凝固劑制備酸漿豆腐不僅能夠提升豆腐品質(zhì)，迎合當(dāng)代消費者追求天然與健康飲食的觀念，而且還能減少黃漿水排放，降低生產(chǎn)成本，提高豆制品生產(chǎn)企業(yè)綜合效益和競爭力。