易筑剛 陳春旭 陳華 劉明理

摘要：【目的】鑒定貴州兩種松乳菇近緣乳菇，為貴州省乳菇近源種鑒定提供方法?！痉椒ā恳择R尾松Pinusmassonzana林下生長的兩種與松乳菇近似的乳菇為研究對象，使用形態(tài)學(xué)和rDNA ITS區(qū)段核苷酸序列分析相結(jié)合的方法進(jìn)行分析鑒定。【結(jié)果】兩種乳菇分別屬于鮮艷乳菇Lactarius vividus和紅汁乳菇L hatsudake，兩種乳菇在形態(tài)學(xué)和分子序列上存在一定差異;與松乳菇的同源性分別達(dá)95%和93%，在形態(tài)特征以及生物、生態(tài)學(xué)特性上具有極高相似性?！窘Y(jié)論】從形態(tài)學(xué)和分子水平上對貴州鮮艷乳菇、紅汁乳菇等進(jìn)行鑒定，為外生菌根類珍稀食用菌馴化以及保育促產(chǎn)技術(shù)的研究與推廣應(yīng)用提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鮮艷乳菇;紅汁乳菇;rDNA ITS序列;同源性;保育促產(chǎn)

中圖分類號：Q 93

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1008-0384（ 2021） 07-076605

Identification and Homology of Two Varieties of Lactarius Found in Guizhou

YI ZhugangI， CHEN Chunxu l， CHEN Hua l， LIU Mingli2

（1.Zunyi Academy of Forestry，Zunyi，Guizhou 563000，China;2 Gaotai Town Forestry Station，

Meitan Counly，zunyi，Guizhou

564111，China）

Abstract： 【Objective】 Two varieties closely related to Lactarius delicious found in the wild in Guizhou weremorphologically and molecularly identified and homology analyzed. 【Method】 Two species of Lactarius from a Pinusmassoniana forest in Hejiang Village，Meitan County were examined on their morphological features under a microscope andon their phylogenetic characteristics by ITS rDNA sequence.【Result】The two mushroom varieties were identified to be Lvividus and L.hatsudake.Between them，significant discrepancies in morphology and ITS phylogeny were evident. L vividuswas 95%homologous with L deliciosus，while L hatsudake slightly lower at 93%. 【Conclusion】The information provideda concrete basis for the species identification facilitating the conservation. domestication， research. and utilization of the rareand valuable Lactarius in the wild.

Key words： Lactarius vividus; Lactarius hatsudake; rDNA ITS sequence; phylogeny; conservation and production promotiontechnology

0 引言

【研究意義】乳菇類真菌屬于擔(dān)子菌亞門Basidiomycotina、層菌綱Hymenomycetes、傘菌目Agaricales、紅菇科Russulaceae、乳菇屬Lactarius，是一類很有開發(fā)價值的大型真菌。目前中國有約40種食用乳菇，絕大多數(shù)是外生菌根真菌[1]，尤其是馬尾松林下著生的乳菇類，如松乳菇Lactariusdeliciosus、橙黃乳菇 L.akahatsu、紅汁乳菇 L.hatsudake、鮮艷乳菇 L.vividus、血色乳菇 L.sanguifluus、油味乳菇 L.quietus，橫斷乳菇 L.hengduanensis等[2]，因其味道鮮美，營養(yǎng)豐富，是一種天然、無公害的珍貴野生食用菌，被視為山中珍品，市場需求度高，銷售價格可達(dá)50～60元.kg-l，加之該類真菌對松林生長有重要的促進(jìn)作用，因此除對其分布的立地條件和生態(tài)環(huán)境進(jìn)行研究外，對不同地區(qū)分布的乳菇種類鑒定以及相互間遺傳特性的研究，是認(rèn)識和科學(xué)利用乳菇的前提[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】馬尾松林在我國分布極其廣泛，生態(tài)環(huán)境千差萬別，導(dǎo)致不同地區(qū)甚至同一區(qū)域不同生境同一種乳菇在形態(tài)特征上存在一定差異，從而出現(xiàn)一度將馬尾松林下與松乳菇相似的乳菇類統(tǒng)稱為松乳菇的現(xiàn)象。隨著研究手段和先進(jìn)技術(shù)的應(yīng)用，基于形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)技術(shù)對乳菇種進(jìn)行精確鑒定，并通過系統(tǒng)發(fā)育樹的建立解析遺傳特性的研究方式已實(shí)現(xiàn)。如陳玉華等[4]通過對松乳菇ITS序列比較及其在乳菇屬中的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，松乳菇和紅汁乳菇、橙色乳菇親緣關(guān)系較近。由此為乳菇種類的鑒定、遺傳特性研究提供了科學(xué)方法。ITS（ internal transcribed spacer）是介于18S和26S之間的非編碼內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，包含一個5.8S編碼區(qū)。研究表明，ITS片段的進(jìn)化速率是18S rDNA的10倍，具有進(jìn)化速率快的特點(diǎn)，此外，還具備片段長度?。ㄕ婢鶬TS區(qū)域長度一般在650—750 bp）、易于分析[5]等優(yōu)點(diǎn)。保守性基本上表現(xiàn)為種內(nèi)相對一致，種間差異比較明顯，近年來被廣泛應(yīng)用于解決較低分類單元層次上的真菌系統(tǒng)發(fā)育問題[6-7]，包括近緣屬間關(guān)系、屬下種間或種內(nèi)群體的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】筆者白2017年對貴州省馬尾松林下常見的兩種乳菇的分布、發(fā)生期和生態(tài)環(huán)境進(jìn)行了多次野外調(diào)查，發(fā)現(xiàn)其與松乳菇形態(tài)相近，但在形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)上存在差異?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究從形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對貴州兩種松乳菇近源種進(jìn)行區(qū)分，利用ClustalX、MEGA6.06等生物信息學(xué)軟件對兩種乳菇進(jìn)行ITS序列對比分析，判斷兩者之間以及與松乳菇的親緣關(guān)系，為貴州常見的兩種乳菇分別制定保育促產(chǎn)技術(shù)及人T馴化提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1子實(shí)體來源

子實(shí)體標(biāo)本（子實(shí)體1和子實(shí)體2）采集于湄潭縣高臺鎮(zhèn)合江村試驗基地（采集地地理坐標(biāo)：海拔831.5 m，經(jīng)度107°221'77"E，緯度27°39'30"N）。

1.2子實(shí)體形態(tài)學(xué)觀察和描述

形態(tài)特征依據(jù)新鮮標(biāo)本記錄，子實(shí)體照片使用Iphone 6s Plus手機(jī)拍攝（關(guān)閉閃光燈模式下拍攝），后期照片使用Adobe Illustrator CC 2018裁剪拼圖，顏色描述編碼參照HTML Color Codes（https：//htmlcolorcodes.com），菌蓋、菌柄、菌褶形態(tài)類型名稱參照楊祥開[8]、王向華等[9]的報道。標(biāo)本采集后取黃豆大小新鮮子實(shí)體組織塊，用硅膠干燥，以供分子系統(tǒng)學(xué)研究之用，其余在50℃徹底烘干。

1.3 DNA的提取、序列擴(kuò)增

DNA提取采用改良CTAB法，基因組DNA和PCR產(chǎn)物的檢測均采用1%的瓊脂糖凝膠電泳法[10]。ITS序列擴(kuò)增和測序采用ITS序列的2對通用引物（ ITSIF： 5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'：ITS2：5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）[11]，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)紫外光檢測后，切膠純化回收并送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行雙向測序。

PCR反應(yīng)體系（25 uL）：10×緩沖液2.5 uL，dNTP（ 2.5 mmoL·L-l）1 uL，引物（10 umoL·L-l）各0.5 uL，Taq酶（5U·uL-l） 0.2 uL，模板DNA（ 500ng·uL-l） 0.5 uL， ddH20 19.8 uL。

PCR反應(yīng)條件：94℃變性3 mm;94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 mm，共30個循環(huán);72℃修復(fù)延伸10 min;4℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在含有EB的2%瓊脂糖凝膠中電泳（ 80V，3h），將目的條帶從瓊脂糖凝膠中切下，用Gel Extr action Mini Kit試劑盒回收，具體操作步驟同說明書。將回收純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳（ 80V，3h），分析其濃度。將測得的目的片段序列與在GenB ank中通過blast檢索獲得的參考序列進(jìn)行多重對位排列，手動去除排列結(jié)果中兩端的非對位排列區(qū)，獲得的序列提交GenB ank數(shù)據(jù)庫。

2結(jié)果與分析

2.1形態(tài)特征

子實(shí)體1：子實(shí)體小型至中型，多為散生少簇生。菌蓋直徑3～8 cm.幼時邊沿內(nèi)卷扁半球形，中間略凹，輪紋明顯至無，淺橙黃色，光滑濕黏（圖1-A）。大時邊沿伸展，傘狀至漏斗形，中間凹陷，輪紋明顯，淺橙黃色，光滑濕黏;菌折密延生分叉，從幼到大橙黃色（圖1一B）;菌柄長3～7 cm，粗1～2 cm，圓柱形至棒狀，兩端被覆白色粉狀物，初內(nèi)實(shí)后松軟至中空，近基部略膨大（圖1一C）呈淺橙黃色。菇體汁少，傷后漸變銅綠色。

子實(shí)體2：子實(shí)體小型至中型，多為散生少簇生。菌蓋直徑3～8 cm，幼時邊沿內(nèi)卷扁半球形，中間略凹，輪紋明顯至無，暗灰至淺褐紅色，光滑濕黏（圖2-A）。大時邊沿伸展，傘狀至淺漏斗形，中間凹陷，輪紋明顯，淺褐紅色，光滑濕黏;菌折密延生分叉，從幼到大褐紅色（圖2一B）;菌柄長2～6 cm，粗1～3 cm，圓柱形至棒狀稍彎曲個別基部漸細(xì)，兩端被覆白色粉狀物，初內(nèi)實(shí)后松軟至中空，個別基部漸細(xì)（圖2-C），呈淺褐紅色。菇體汁少，傷后漸變銅綠色。

2.2分子系統(tǒng)學(xué)分析

選取子實(shí)體1和子實(shí)體2兩種乳菇子實(shí)體白測及GenB ank選取并下載的21條乳菇屬及1條外群紅菇屬ITS序列，紅菇屬的正紅菇Russula vinosa作為外類群，采用最大似然法（ Maximum likelihood，MP）重建其系統(tǒng)框架，經(jīng)bootstrap法，1 000次循環(huán)檢驗系統(tǒng)樹的可靠性（圖3）?；贗TS區(qū)段的核苷酸序列分析結(jié)果顯示，兩個樣品位于不同的進(jìn)化枝上，其中子實(shí)體1與鮮艷乳菇三.vividus聚為一支，相似度為98%;子實(shí)體2與紅汁乳菇 L.hatsudake聚為一支，相似度為94%。結(jié)合子實(shí)體形態(tài)特征，可確定樣品子實(shí)體1和子實(shí)體2分別為鮮艷乳菇 L.vividus和紅汁乳菇 L.hatsudake。

以松乳菇 L.deliciosus為參照，比較子實(shí)體1（鮮艷乳菇 L.vividus）和子實(shí)體2（紅汁乳菇 L.hatsudake）相互之間的親緣關(guān)系，選取松乳菇 L.deliciosusDQ116886 ITS序列與鮮艷乳菇和紅汁乳菇構(gòu)建的同源樹（圖4）可看出，紅汁乳菇和鮮艷乳菇與松乳菇的同源性分別達(dá)95%和93%.都表現(xiàn)為較高同源性，反映在形態(tài)特征以及生物、生態(tài)學(xué)特性上的極高相似性。

3討論

兩種乳菇均分布于馬尾松林下，形態(tài)特征、生物生態(tài)學(xué)特性以及食用口感極為相似，因此傳統(tǒng)習(xí)慣都將其統(tǒng)稱為松乳菇[12]。然而筆者在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，松乳菇其實(shí)分布較少，大部分以鮮艷乳菇和紅汁乳菇為主，尤以鮮艷乳菇最多。王云等[13]采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分析方法鑒定將湖南松菌松乳菇 L deliciosus正名為紅汁乳菇 L.hatsudake，隨后，郭亮等[14]基于形態(tài)特征和ITS序列分析對湖南松菌再分類鑒定，結(jié)果表明湖南省松林中分布最多的4種松菌鑒定結(jié)果為乳菇屬未知種 Lactarius sp，松乳菇 L deliciosus、橙紅乳菇 L.akahatsu和紅汁乳菇 L.hatsudake;使用形態(tài)學(xué)和ITS序列分析相結(jié)合的方法不僅在乳菇屬中進(jìn)行分類鑒定研究，且在紅菇屬也有相關(guān)報道。鄧春英等[15]對中國南方變綠紅菇的近似種類“青頭菌”實(shí)則為變綠紅菇Russula virescens復(fù)合群，其余子實(shí)體為綠桂紅菇R.viridicinnamomea、紅邊綠菇R.viridirubrolimbata和新種擬殼狀紅菇R.pseudocrustosa，且我國變綠紅菇近似種R.aff virescens與歐洲的變綠紅菇R.virescens和北美的小變綠紅菇R.parvovirescens均存在一定差異。在課題組調(diào)查觀察中發(fā)現(xiàn)不同的生態(tài)環(huán)境下生長的同種乳菇，其子實(shí)體外部形態(tài)也存在差異。因此推論乳菇屬也存在類似現(xiàn)象，在今后的研究中，將運(yùn)用形態(tài)學(xué)和ITS序列分析相結(jié)合的方法針對這一現(xiàn)象進(jìn)行更深入的研究。

在貴州，鮮艷乳菇和紅汁乳菇在立地分布上存在一定差異，二者除在馬尾松林下外，鮮艷乳菇L.vividus還在馬尾松較少的殼斗科Fagaceae、樟科Lauraceae、桃金娘科Myrtaceae等混交林內(nèi)普遍分布且出菇較多，而紅汁乳菇 L.hatsudake則很少見，說明鮮艷乳菇可能存在宿主轉(zhuǎn)移（ host switch）或者多宿主現(xiàn)象，類似的研究在同屬外生菌根菌的松塔牛肝菌屬也曾報道[16-17]，同時也印證了在相同立地條件下鮮艷乳菇比紅汁乳菇數(shù)量多的原因。不過其轉(zhuǎn)移機(jī)制、宿主種類的確認(rèn)等有待進(jìn)一步研究。根據(jù)鮮艷乳菇可能存在宿主轉(zhuǎn)移或多宿主現(xiàn)象，為下一步通過對鮮艷乳菇宿主轉(zhuǎn)移機(jī)理的研究，培育周期短、更易栽培的宿主植物，從而實(shí)現(xiàn)操作性較強(qiáng)的人工或半人工栽培技術(shù)提供參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[l]陳新，康恒，邊銀丙乳菇類外生菌根食用菌研究進(jìn)展[J]菌物學(xué)報，2018. 37（12）： 1562-1571

CHEN X KANG H.BIAN Y B Advances in studies of edibleLactarius sensu lato[J].Mycosystema，2018，37（ 12）：1562-1571（ in Chinese）

[2] 戴玉成，周麗偉，楊祝良，等中國食用菌名錄[J]菌物學(xué)報，2010，29 （1）：1-21

DAI Y C ZHOU L W YANG Z L et al A revised checklist of ediblefungi in China[J]Mycosystema，2010. 29（1）：1-21. （in Chinese）

[3]馮邦，楊祝良外生菌根共生共生真菌多樣性及菌根形成的分子機(jī)制[J]中國科學(xué)：生命科學(xué)，2019. 49 （4）：436444

FENG B.YANG Z L Ectomvcorrhizal symbioses： Diversitv ofmvcobionts and molecular mechanisms that entail the development ofectomvcorrhizae[J]Scientia Sinica （Virae），2019，49 （4）：436444 （in Chinese）

[4] 陳玉華，劉君昂，周圍英，等松乳菇ITS序列比較及其在乳菇屬中的系統(tǒng)發(fā)育分析[J]食用菌學(xué)報，2013.20 （1）：1824

CHEN Y H，LIU J A，ZHOU G Y，et al Comparison of Lactariusdeiciosus ITS sequences and phylogenetlc analysls of the。genusLactarius [J].Acta Edulis Fungi 2013，20（1）：18 24（1nChlnese）

[5] ELDER J F，TURNER B J concelled evolutlon of repetltive DNAs.quences in eukal'yotes[J].The Quarterly Rgview of Biology，1995，70（3）：297 320

[6] sMIT E， vEENMAN c， BAAR J Molecular analysls ofectonlycolThlzal basidi01uycete conmmnltles ln a Pinus sylvestris Lstand reveals long—term mcreased diverslty after removal of litter andhumus l8yers[J] FEMS Microbiology Ecology.2003，45（1）：49-57

[7] sEIFERT K A Progress towards DNA barcoding of fungi [J]Molecular Ecology Resources，2009，9：83-89

[8] 楊祥開，成春燕，黃雪星，等紅汁乳菇的組織分離及鑒定[J]食用菌，2015，37（6）：l3-15

YANG X K CHENG C Y HUANG X X.et al Tissue lsolatlon andidentmcatlon of Lactarius hatsudake [J] Edible Fungi 2015，37（6）：13 15（in Chlnese）

[9] wANG x H seven new 8pecles of Lactarius subg Lactarius（Russulaceae）flom soutllwestem Chlna[J].Mycosystema，2017，36（11） 1463 1482

[10]xu J P，YoELL H J，ANDERsoN J B An efficient protocol forisolatmg DNA from higher fungi [J].Trends in Genetics，1994，10（7）：226 227

[11]wHITE T J，BRuNs T，LEE s，et al Amplification and dlrectsequenclng of fungal nbosomal RNA genes for pllylogenetics [M]PCRProtocols.Amsterdam：Elsevier.1990：315 322

[12]YAMADAA，oGuRAT，oHMAsAM cultivation of mushrooms ofedlble ectomyconhizal fungi assoclated with Pinus densifiora by inviteo mycorrbizal synthesis [J].Mycorrhiza，2001，ll（2）：59-66

[13]王云，譚著明，何興元湖南的松菌[J]食用菌學(xué)報，2003，10（2）：24-28

WANG Y.TAN Z M.HE X Y Pine musllroom from Hunan ofChlna[J].Acta Edulis Fungi.2003，10（2）：24-28（1nChlnese）

[14]郭亮，劉君昂，周圍英，等中國南方地區(qū)松乳菇遺傳多樣性分析[J]菌物學(xué)報，201l，30（3）：384 391

GUO L，LIU J A，ZHOU G Y，et al GeIletlc dlverslty of Lactariusdeliciosus from South Chma[J].Mycosystema，2011，30（3）：38439l（m Chmese）

[15]鄧春英，史路瑤，王晶，等中國南方變綠紅菇近似種類“青頭菌”的物種多樣性[J]菌物學(xué)報，2020，39（9）：1661-l683

DENG C Y，SHI L Y，WANG J，et al_Specles diversity of Russulavirescens complex“Qingtoulun”in Sounlem China[J].Mycosystema，2020.39（9）：166l l683（in Chinese）

[16]sATo H，TANABE A s，ToJu H Host shifts eIlhance diversificatlonof ectomycorrhiza1 fungi：Diversmcation rate analysls of the。ectonlycorrhlzal fungal genera Strobilomyces and Afroboletus with an80—gen。phylogelly[J].New Phytologist 2017，214（1）：443-454

[17]HAN L H，F(xiàn)ENG B，wu G，et al_Afllcan ongm aIld globa1dlstributlon patterns Evldence inferred from pllylogenetic andblogeographical analyses of ectomycorrhlzal fungal genusStrobilomyces[J].Journal of Biogeography，2018，45（1）：201-212

（責(zé)任編輯：張梅）

收稿日期：2021-0206初稿;2021-0604修改稿

作者簡介：易筑剛（ 1963-），男，高級工程師，研究方向：林下珍稀食藥用菌研究（E-mail： 2914728lO@qq.com）

共同第作者：陳春旭（ 1993-），男，碩士，助理工程師，研究方向：林下珍稀食藥用菌與分子生物學(xué)研究（E-mail： chenchunxul7@163.com）

基金項目：貴州省科技支撐計劃項日（黔科合支撐[2017]2515）