張靖鵬 江錦秀 林裕勝 游偉 劉道泉 毛坤明 江斌 胡奇林

摘要：【目的】建立一種快速、敏感的ENTV-2檢測方法，用于ENT的早期診斷與流行病學(xué)調(diào)查。【方法】通過生物信息學(xué)的方法將ENTV-2與ENTV-I. ERVs. JSRV進(jìn)行比對，尋找ENTV-2的保守序列并設(shè)計1對特異性引物，建立SYBR-Green I實時熒光定量PCR檢測方法，對所建立的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，將PCR擴增產(chǎn)物連接T載體構(gòu)建的陽性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，對SYBR-Green I實時熒光定量PCR檢測方法的特異性、敏感性和重復(fù)性進(jìn)行驗證?！窘Y(jié)果】建立的檢測ENTV-2 qPCR方法標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2=0.992）;該方法的特異性良好，對ENTV-2可以產(chǎn)生特異性擴增曲線，與 ENTV-2高度同源的ERVs沒有交叉反應(yīng)，也無法擴增羊口瘡病毒（ ORFV）、綿羊肺炎支原體（ Mo）、絲狀支原體山羊業(yè)種（Mmc）等常見病原;敏感性良好，最低檢測限度為7.5×102 copies uL-1，敏感性可達(dá)常規(guī)PCR檢測方法的100倍;批內(nèi)、批問的變異系數(shù)CV

關(guān)鍵詞：山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒;SYBR-Green I;熒光定量PCR

中圖分類號：S 852.62

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1008-0384（ 2021） 07-077906

A SYBR-Green I RT-qPCR Assay for Detecting Enzootic

Nasal Tumor Virus in Goats

ZHANG Jingpeng 1， JIANG Jinxiu 1. LIN YuSheng 1， YOU Wei 1， LIUDaoquan 2，

MAO Kunming 3， JIANG Bin 1. Hu Qilin 1*

（1.Institute ofAnimal Husbandry and Veterinary Medicine. Fuzhou， Fujian 350013，China;2 Fuzhou Animal Disease

Prevention and Control Center. Fuzhou， Fujian

350002. China; 3.Fuqing Technical Service Center of

Animal Husbandry and Veterinary Medicine. Fuzhou， Fujian

350300. China）

Abstract： 【Objective】 A rapid， sensitive detection method for early diagnosis and epidemiological survey on enzootic nasaltumor （ENT） in goats was established.【Method】 Bioinformatics methods were employed for sequence alignment of ENTV-2with ENTV-1. ERVs. and JSRV in search for the conserved sequence of the virus. Primers for qPCR were designed to establisha SYBR-Green I RT-qPCR methodology for its detection. Reaction conditions were optimized， and a standard positive plasmidused to determine the specificity， sensitivity， and reproducibility of the newly developed assay. 【Result】A linear standardcurve was found for the detection with a R2=0.992. The method specifically detected only ENTV-2. not the highly homologousERVs， nor amplified ORFV， MO， or Mmc. It showed a detection sensitivity of up t0 7.51×102 copies·UL-1， which was 100times greater than the conventional PCR can deliver，a repeatability with a coefficient variations （CV） of less than l% on intra-and inter-batch tests. and a positive detection rate of 17.3% on 81 clinical samples. 【Conclusion】 The newly establishedSYBR-Green I RT-qPCR was specific， sensitive， repeatable. and considered adequate for early and rapid detection of ENTV-2in goats.

Key words： Enzootic nasal tumor virus of goats（ENTV-2）; SYBR-Green I ; RT-qPCR

0 引言

【研究意義】山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤（ Enzootic nasaltumor，ENT）是由山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒（Enzooticnasal tumor virus of goats，ENTV-2）導(dǎo)致的鼻甲骨篩骨上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化而發(fā)生的慢性、進(jìn)行性、接觸性傳染病，該病的臨床特征主要表現(xiàn)為病羊食欲減退，呼吸困難，鼻漏，鼻腔內(nèi)出現(xiàn)單側(cè)或兩側(cè)性增生物[1-2];后期可導(dǎo)致鼻甲骨變形，眼部突出，病程3個月到1年，通常以死亡為轉(zhuǎn)歸;該病的發(fā)病率為0.5%～15%，致死率可高達(dá)100%，白1939首次于德國報道以來，陸續(xù)在歐洲，亞洲，美洲，非洲等地被報道[3-4];國內(nèi)于1995年首次報道，目前在湖南、四川、重慶、福建等地也有發(fā)生[5-7]。該病無特效藥物，也沒有疫苗用于預(yù)防，一旦出現(xiàn)臨床癥狀就只能淘汰，給羊的養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失和潛在威脅。由于ENT的臨床癥狀與細(xì)菌、支原體、過敏等癥狀相似，僅通過臨床癥狀難以對病原進(jìn)行鑒別診斷，因此急需一種敏感、特異的方法對發(fā)病羊和羊群進(jìn)行早期診斷，以便對感染羊進(jìn)行淘汰，保護健康羊群。【前人研究進(jìn)展】傳統(tǒng)的鑒定方法是通過臨床初步判斷結(jié)合剖檢發(fā)現(xiàn)鼻腔內(nèi)贅生物而確診，但此方法不適用于該病的早期診斷，ENTV-2尚未建立體外培養(yǎng)體系[8]，導(dǎo)致血清學(xué)檢測方法的研究進(jìn)展緩慢，因此分子生物學(xué)檢測方法就成為ENT早期診斷的主要研究方向。Cousens C.[9]結(jié)合RT-PCR與限制性內(nèi)切酶分析建立了鑒定ENTV的方法;郝中香等[10]建立了一種快速檢測ENTV的RT-PCR方法，該方法最低可檢測出6 pg的ENTV; Apostolidi等[11]建立了Taqman實時熒光定量PCR以檢測ENTV，該方法可檢出到102 RNA轉(zhuǎn)錄本;Huang等[12]建立了基于EvaGreen的實時熒光定量PCR檢測方法并報道該方法的靈敏度可以達(dá)到3.0×10i copies·uL-l?！颈狙芯壳腥朦c】ENTV-2與綿羊肺腺瘤病毒（JSRV）及普遍分布于山羊和綿羊細(xì)胞基因組中的內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒（ ERVs）高度同源[13]。本研究通過基因信息學(xué)方法尋找與上述病毒有較大差異的ENTV-2保守基因?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過基因信息學(xué)的方法分析17株ENTV-2，并與ENTV-1（ Enzootic nasaltumor

vlrus

of

sheep）、

ERVs（ Endogenousretroviruses）、 JSRV（ Jaagsiekte sheep Retrovirus）進(jìn)行比對，尋找其相對保守片段設(shè)計引物，建立檢測ENTV-2的SYBR-Green I實時熒光定量PCR檢測方法，以期對ENTV-2進(jìn)行早期診斷并應(yīng)用于該病的流行病學(xué)調(diào)查。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌（毒）株及臨床樣品 山羊鼻內(nèi)腫瘤病毒（ENTV-2）、羊腎細(xì)胞、山羊皮膚細(xì)胞、綿羊肺細(xì)胞、羊口瘡病毒（ ORFV）、牛冠狀病毒（BCV）、綿羊肺炎支原體（ Mo）、絲狀支原體山羊亞種（Mmc）由本實驗室分離鑒定保存，山羊支原體山羊肺炎亞種（ Mccp）由蘭州獸醫(yī)研究所儲岳峰博士惠贈，81份羊鼻拭子樣品，為2017 2019年采集白福建省各地山羊養(yǎng)殖場。

1.1.2主要試劑和儀器 病毒RNA/DNA提取試劑盒、脫氧核糖核酸酶I（ DNasel）及反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript?Reverse Transcriptase購白北京全式金生物技術(shù)有限公司，Hieff UNICON? Power qPCR SYBRGreen Master Mix購白Yeasen Biotech公司，pMD18-T、Nase-Free Water、DNA Marker，均購白寶生物工程（大連）有限公司，膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒為天根生化科技有限公司產(chǎn)品;熒光定量PCR儀為Eppendorf公司生產(chǎn)。

1.2試驗方法

1.2.1引物設(shè)計合成 根據(jù)Genbank上已公布的17株ENTV的LTR區(qū)保守的基因片段，應(yīng)用引物設(shè)計軟件DNAStar和Primer Premier 5.0，經(jīng)NCBIBLAST對比驗證，設(shè)計1對引物，上游引物S1-140E：GAGATTTCTTACACATGAGAGC下游弓『物R2-140E： TCCCAGGACTTAACCATTC，引物的特異性目的片段，長度為143 bp。

1.2.2 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 依照EasyPure ViralDNA/RNA Kit的說明書提取ENTV的RNA， 70℃保存， 參照TransScript One-STEP gDNA Removal andcDNA synthesis SuperMix的說明書去除基因組DNA并將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA， 20℃保存。

1.2.3常規(guī)PCR 以1.2.2中獲得的cDNA為模板，按郝中香等[10]設(shè)計的引物和PCR方法進(jìn)行。

1.2.4標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建 利用方法1.2.2中獲得的cDNA為模板，以方法1.2.1設(shè)計的引物對ENTV-2進(jìn)行PCR擴增。以20 uL PCR擴增體系：模板1 ul、上、下游引物各1 ul（終濃度0.5 umol·L-l）、Premix Taq 10 uL、加ddH20 7 uL。反應(yīng)條件：94℃2 min;94℃30s、55℃15 s、72℃15 s，循環(huán)數(shù)為35;最后72℃延伸10 min。通過凝膠電泳實驗將PCR產(chǎn)物回收純化后克隆至pMD18-T載體上，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中，擴大培養(yǎng)、提取重組質(zhì)粒，送生工生物有限公司進(jìn)行測序。將序列正確的重組質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，并用NanoDrop2000測定標(biāo)準(zhǔn)品的核酸含量。

1.2.5 qPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 20 uL反應(yīng)體系，上下游引物S1-140E與R2-140E（ 10 umol·L-l）各1 uL，模板1 uL，SYBR Green Master Mix 10 uL，補水至20uL。擴增反應(yīng)條件初步設(shè)定為：94℃預(yù)變性2min;94℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸15 s，40個循環(huán);最后72℃延伸5 min。分別用55～65℃作為PCR反應(yīng)的退火溫度，引物濃度（0.2、0.4、0.8、1.0、1.5、1.75、2.0 pmol·L-l）對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，溶解曲線參數(shù)按儀器默認(rèn)參數(shù)設(shè)置。

1.2.6 qPCR的特異性試驗 分別從山羊皮膚細(xì)胞、綿羊肺細(xì)胞與羊腎細(xì)胞中提取DNA作為內(nèi)源性羊鼻內(nèi)腫瘤病毒（ ERVs）的陽性樣本，羊口瘡病毒（ ORFV）、牛冠狀病毒（BCV）、綿羊肺炎支原體（ Mo）、絲狀支原體山羊亞種（Mmc）、山羊支原體山羊肺炎亞種（ Mccp）以及1.2.2中得到的羊鼻內(nèi)腫瘤病毒（ENTV-2）cDNA為模板，按1.2.5反應(yīng)體系和優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行qPCR。

1.2.7敏感性試驗 以方法1.2.4中構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒為模板，用1.2.5的方法對其進(jìn)行擴增，其擴增片段長度為146 bp，初始質(zhì)量濃度23 ng·uL-l，換算成拷貝數(shù)約7.51×109.將其10倍倍比稀釋（109～100copies·uL-1）后，從中各取其1uL為模板，按最佳條件進(jìn)行qPCR反應(yīng)，以確定建立的qPCR的敏感性。同時，用1.2.3中的常規(guī)PCR方法與本實驗建立的qPCR方法進(jìn)行比較。

1.2.8重復(fù)性試驗 對10 7、105、103 copies·uL-l的標(biāo)準(zhǔn)品DNA進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗。其中批內(nèi)重復(fù)性試驗每個梯度設(shè)計3個平行重復(fù)，分析批內(nèi)樣品的重復(fù)性;同時，對每個梯度再重復(fù)3次試驗，對比這3次試驗結(jié)果，分析批間樣品的重復(fù)性。

1.2.9臨床檢測 采用上述qPCR方法，設(shè)立陰性、陽性對照，對臨床上隨機采集的81份山羊鼻子進(jìn)行檢測，并和常規(guī)PCR方法進(jìn)行比較。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

平均數(shù)、變異系數(shù)通過Excel對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析;質(zhì)粒的分子量換算為拷貝數(shù)濃度通過公式：拷貝·uL-l=（ ng·uL-l×109）×（ 6.02×1023）/（ DNA

length×660）進(jìn)行換算;其余數(shù)據(jù)由Eppendorf熒光定量PCR儀白帶軟件進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1 qPCR條件優(yōu)化

優(yōu)化后的反應(yīng)體系為：SYBR Green I Master Mix10 uL，上下游引物各0.8 uL，模板1 uL，加去離子水至20 uL。最佳反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min，94℃15 s，60℃15 s，72℃15 s，40個循環(huán)，熔解曲線按儀器默認(rèn)參數(shù)設(shè)置，熔解曲線參數(shù)：95℃5s，60℃30 s，95℃15 s，1個循環(huán)，退火延伸時檢測熒光信號。

2.2標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

將1.2.4中構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒用EASY Dilution按10倍稀釋作為模板，進(jìn)行SYBRGreen I PCR擴增，以模板濃度為X軸，Ct值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1所示，模板濃度與Ct值的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R--0.992，直線方程：y=3.221×lgx+37.77，溶解曲線由圖2可見，熔解曲線TM值1.3±0.2℃，無引物二聚體及非特異峰現(xiàn)。

2.3特異性

運用建立的ENTV-2 SYBR-Green I qPCR方法檢測ENTV-2、山羊皮細(xì)胞、山羊腎細(xì)胞、綿羊肺細(xì)胞、ORFV、BCV、Mo、Mmc、Mccp等病原的基因組DNA，結(jié)果僅ENTV-2呈陽性，其他均為陰性，說明用本方法檢測ENTV-2與羊內(nèi)源性鼻內(nèi)腫瘤病毒及羊常見病毒均無交叉反應(yīng)，特異性較好（圖3）。

2.4敏感性

將拷貝數(shù)為7 51×109 copies·uL-l的陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒從7.51×10 7 copies·uL-l稀釋至7.51×10 0 copies·uL-l，進(jìn)行qPCR試驗，結(jié)果顯示敏感性為7.51×102copies·uL-l，同時以常規(guī)PCR方法進(jìn)行檢測，常規(guī)PCR的靈敏度為7.51×10 4 copies·uL-I。

2.5重復(fù)性

對7.51×10 3、7.51×10 5和7.51×10 7 copies·uL-l的陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行檢測，每個濃度設(shè)3個重復(fù)，進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗;進(jìn)行批間試驗時對同一次試驗的每個濃度設(shè)3個重復(fù)，共檢測3次。結(jié)果如表1：批內(nèi)、批間重復(fù)試驗的變異系數(shù)均小于l%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6臨床樣品的檢測

熒光定量PCR的部分結(jié)果見圖4，對81份臨床樣品以qPCR方法和常規(guī)PCR方法進(jìn)行平行檢測，結(jié)果如表2顯示，二者同為陽性的數(shù)量為10份，二者同為陰性數(shù)量為67份，常規(guī)PCR檢測出10份陽性，71份為陰性，檢出率為12.3%，而qPCR方法檢出14份陽性，陰性67份，檢出率17.3%，說明本研究建立的qPCR方法敏感性高于常規(guī)PCR。二者的符合率為95.1%（ 77/81）。

3討論與結(jié)論

羊地方性鼻內(nèi)腫瘤（ ENT）是一種在國內(nèi)外較廣泛傳播的疾病，除了新西蘭和澳大利亞外，大部分國家均有報道。隨著國內(nèi)山羊飼養(yǎng)規(guī)模的擴大和活畜貿(mào)易的頻繁，該病在一些地區(qū)頻繁發(fā)生，其高致死率給羊產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展帶來了嚴(yán)重挑戰(zhàn)，尤其影響了羊種質(zhì)資源。該病毒有較長的潛伏期，在病羊和帶毒羊中可長期存在[14]，由于缺乏免疫應(yīng)答，尚無疫苗可用于該病的防治[14]，因此，早期的診斷可以及時淘汰病羊，對該病的防控有重要意義。然而，該病的血清學(xué)檢測方法尚未實現(xiàn)，早期建立的傳統(tǒng)PCR方法敏感性不夠。本試驗通過對ENTV-2已發(fā)表的序列與ENTV-I、JSRV、ERVs等進(jìn)行比對分析，找到了ENTV-2的保守特異性位點，建立了ENTV-2 SYBR-Green I熒光定量PCR檢測方法。

實時熒光定量PCR具有敏感性高、特異性強等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)相關(guān)試驗，較傳統(tǒng)PCR而言，其檢測過程只需在熒光定量PCR儀上進(jìn)行，擴增情況可以實時顯示于儀器自帶的軟件，檢測結(jié)果可通過Cf值和陽性標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中的DNA進(jìn)行定性和定量，無需進(jìn)行凝膠電泳分析，縮短了試驗的時間，提高檢測的效率，近年來在動物疫病檢測中也得到廣泛應(yīng)用，Ortin等[15]、林裕勝等[16-17]對絲狀支原體山羊亞種和綿羊肺炎支原體分別建立了SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測方法，汪偉等[18]建立了SYBR Green I熒光定量PCR的方法用于檢測山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒，Wang Y[19]應(yīng)用SYBR Green I實時熒光定量PCR對ORFV進(jìn)行了檢測，付明哲等[20]建立了基于Eva Green染料的實時熒光定量PCR方法檢測小反芻獸疫病毒，這些方法的建立不斷地完善了羊病的檢測體系。由于ENT沒有有效的疫苗和治療藥物，一旦在羊場中出現(xiàn)，需要可靠的檢測方法和流行病學(xué)調(diào)查及時清除患病羊，而該病早期的臨床癥狀不明顯，易與其他上呼吸道疾病混淆，而且鼻拭子中的病毒含量較低，對敏感性的要求比較高，因此，熒光定量PCR非常適用于該病的檢測。本試驗建立了ENTV-2的SYBR GreenI實時熒光定量PCR檢測方法，該方法在7.51×10---7.51×10 7 copies·uL-l有良好的線性關(guān)系（ R2=0.992），最低檢測限度為7.51×10 2 copies·uL-l，比傳統(tǒng)PCR敏感性高100倍，該方法有較強的特異性，與內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（ ERVs）、羊口瘡病毒（ORFV）等病原均無交叉反應(yīng)，應(yīng)用本研究建立的qPCR方法和傳統(tǒng)PCR方法對81份臨床樣品進(jìn)行檢測，檢出率分別為17.3%和12.3%，敏感性高于傳統(tǒng)PCR方法，而相較于Apostolidi等[11]建立的Taqman實時熒光定量PCR的方法，SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測方法不需要合成昂貴的探針，只需要合成常規(guī)引物，昂貴的探針，相比之下更為經(jīng)濟實用。

目前國內(nèi)外關(guān)于ENTV-2檢測方法的報道較少，主要原因在于ENTV-2與ERVs、ENTV-I和JSRV均有較高的同源性，因此本研究通過設(shè)計針對ENTV-2特異性的引物，理論上排除了與ERVs、ENTV-l和JSRV交叉的可能性;并且應(yīng)用山羊皮膚細(xì)胞、羊腎細(xì)胞、綿羊肺細(xì)胞作為對照，結(jié)果證明內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒無法通過該方法擴增出來。ENTV-I和JSRV2種病毒只感染綿羊，目前尚無報道自然感染山羊的病例，所以試驗中沒有進(jìn)行驗證，后續(xù)研究中應(yīng)進(jìn)行驗證。ERVs對檢測有一定的干擾，可以通過DNase I的酶切反應(yīng)對宿主基因組DNA進(jìn)行降解，以排除ERVs的干擾，但是增加該反應(yīng)有可能帶人少量RNase導(dǎo)致病毒RNA部分降解，因此，利用傳統(tǒng)PCR進(jìn)行檢測將漏檢相當(dāng)一部分病例，而本研究基于SYBR Green I的實時熒光定量PCR檢測方法不僅特異性和重復(fù)性好，敏感性也達(dá)到7.51×102 copies·uL-l，為ENTV-2感染的早期檢測和流行病學(xué)調(diào)查提供了可靠的方法。

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（責(zé)任編輯：黃愛萍）

收稿日期：2020-1204初稿;2021-0325修改稿

作者簡介：張靖鵬（ 1988-），男，碩士，研究實習(xí)員，主要從事動物傳染病研究（E-mail： 870063543@qqcom）

通信作者：胡奇林（ 1963-）.男，研究員，主要從事動物傳染病學(xué)利免疫學(xué)研究（E-mail： hq1562713@163.com）

基金項目：福建省科技重大專項（2019N209007）：福建省科技計劃公益類專項（2018Rl023—1）