王建超 何銀鶯 黃旭萍 沈朝貴 陳發(fā)興 郭林榕

摘要：【目的】優(yōu)化余甘子種質(zhì)資源ISSR-PCR反應(yīng)體系，為余甘子種質(zhì)資源遺傳多樣性及親緣關(guān)系研究提供基礎(chǔ)?！痉椒ā恳跃挼?、印度、廣東、云南、福建等5份來源小同的余甘子種質(zhì)資源的基因組DNA組成混合的DNA模板，綜合單因素試驗和響應(yīng)面分析法，分析引物濃度、2×Taq Master Mix添加量、DNA模板量、退火溫度等反應(yīng)條件對IS SR-PCR反應(yīng)體系的影響，優(yōu)化建立余甘子IS SR-PCR反應(yīng)體系?！窘Y(jié)果】引物濃度和2×Taq MasterMix添加量對擴增效果有較大影響，DNA模板量影響較小;引物濃度和DNA模板量交互作用明顯;余甘子ISSR反應(yīng)體系為引物濃度0.4 umol L-l，2×Taq Master Mix添加量l3 uL， DNA模板量30 ng，擴增結(jié)果與響應(yīng)面分析模型理論值相對誤差儀為9.39%;退火溫度為50.5- 52.7℃時，隨著溫度的升高，條帶質(zhì)量變好，數(shù)量變多，退火溫度為52.7℃時可獲得多樣性好的清晰條帶。【結(jié)論】獲得ISSR-PCR反應(yīng)體系為引物濃度0.4 umoI·L-1，2×Taq MasterMix添加量13 UL， DNA模板量30 ng，退火溫度52.7℃，擴增循環(huán)數(shù)35循環(huán)，擴增獲得的條帶清晰、穩(wěn)定，多樣性好，該體系適于余甘子種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系等分析研究

關(guān)鍵詞：余甘子;ISSR-PCR;響應(yīng)面;體系優(yōu)化

中圖分類號：S 682.310.36

文獻標志碼：A

文章編號：1008-0384（ 2021） 07-075907

Response Surface Optimization of ISSR-PCR Reaction for Genetic Study on

Phyllanthus Emblica

WANG Jianchao1.2. HE Yinying2. HUANG Xuping2， SHEN Chaoguj1， CHEN Faxing2. Guo Linrong1*

（l.Fruit Research Institute， Fujian Academy ofAgricultural Sciences. Fuzhou， Fujian 350013，China：

2.College ofHorticulture， Fujian Agriculture and Forestrv University. Fuzhou， Fujian 350002. China）

Abstract： 【Objective】 ISSR-PCR reaction system for genetic study on Phyllanthus emblica germplasms was optimized【Methods】 A mixed DNA template composed of genomic DNA ofP emblica germplasms came from Myanmar. India.Guangdong， Yunnan， and Fujian was obtained. The single factor test and response surface analysis were used to optimize theISSR-PCR reaction conditions including primer concentration. amount of 2×Taq Master Mix. DNA template amount， andannealing temperature.【Result】 The primer concentration and addition amount of 2×Taq Master Mix had a greater impacton the amplification than did the DNA template amount. A significant interaction between the primer concentration and DNAtemplate amount was found. The optimized system with a primer concentration of 0.4 ymoI·L-1.a 2×Taq Master Mix of13 UL， and a DNA template concentration of 30 ng was established that achieved a low relative error of 9.39% in predicting thetheoretical response. Within the annealing temperature between 50.5 ℃ and 52.7 ℃. increasing temperature improved thenumber and quality of bands. When the annealing temperature is 50.5-52.7.C，the number of strips increases. and the quality ofthe strips becomes better with the increase of temperature. The annealing temperature is 52.7℃to obtain good diversity andclear bands. 【Conclusion】 The optimized ISSR-PCR reaction system was established applying a primer concentration of0.4 umoI-L-1，a 2×Taq Master Mix ofl3L，aDNA template concentration of 30 ng at the annealing temperature of 52.7℃for35 amplification cycles. The methodology could be used to study the genetic diversity and relationship of P. emblicagermplasms .

1.3統(tǒng)計分析

采用Excel 2016、Design Expert 8.0.6等軟件進行統(tǒng)計分析，其中Design Expert 8.0.6進行響應(yīng)面試驗設(shè)計、數(shù)據(jù)分析和模型的建立。

2結(jié)果與分析

2.1單因素對ISSR反應(yīng)體系的影響

單因素試驗的擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2，可見，引物濃度與2×Taq Master Mix添加量對反應(yīng)體系的影響較大。引物濃度偏高或偏低都會影響擴增結(jié)果，引物濃度過高會引起引物與DNA模板錯配和非特異性產(chǎn)物擴增，增加產(chǎn)生二聚體的概率，引物濃度偏低則不易測出擴增位點，本研究引物濃度為0.30～0.40 umol.L-l時電泳效果較好。2×Taq Master Mix含有Taq DNA聚合酶、dNTP混合物和Mg2+等反應(yīng)原料，Taq DNA聚合酶直接影響擴增反應(yīng)的成功與否，濃度過高容易產(chǎn)生非特異的PCR產(chǎn)物，dNTP是ISSR分子標記擴增的重要原料，濃度過高易錯配，過低影響合成效率，2×Taq MasterMix添加量為12～14 uL為最佳。DNA模板量范圍取決于物種基因組大小和DNA純度，研究表明，DNA模板量對余甘子ISSR-PCR的影響較小，考慮電泳條帶質(zhì)量和數(shù)量，選擇DNA模板量最佳為30 ng。

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化ISSR反應(yīng)體系

以電泳圖譜（圖3）中電泳條帶數(shù)量、清晰度、重復(fù)性、亮度和背景干凈程度的評分（5名科研T作者主觀評分）為響應(yīng)值（表4），采用多元回歸擬合，獲得引物濃度（X1），2×Taq Master Mix添加量（X2），DNA模板量（X3）的二次多項回歸模型為F=11.92-0.437 5X1-O.5 5X2 -1.737 5X2-0.75XIX21.575XIX3-0.55X2X3-4.2975Xl2-3.5225X2--2.1975X32。檢驗方程的有效性，對數(shù)學(xué)模型進行方差分析電泳圖評分為響應(yīng)值時，該二次方程模型有統(tǒng)計學(xué)意義（p-0.012 6<0.05），說明該模型對本試驗有較好擬合;回歸方程失擬性檢驗無統(tǒng)計學(xué)意義（p-0.7571），表明未知因素對試驗結(jié)果干擾很小，模型能較好地反應(yīng)真實的試驗值，可用于響應(yīng)值的分析和預(yù)測，所得的回歸方程模型能較好地預(yù)測電泳圖譜得分隨各參數(shù)的變化規(guī)律。試驗所選三因子X1、X2和X3中X3達到顯著影響（p<0.05），Xl、X2因子二次項均達到極顯著影響（p<0.001）表明單因素X2對響應(yīng)結(jié)果影響較大，且X1與X2因子有極顯著的交互影響。

根據(jù)回歸擬合方程得出各試驗因子引物濃度（X）、2×Taq Master Mix添加量（X2）、DNA模板量（X3）兩兩因素交互作用的等高線圖（圖4），等高線圖可直觀反映出2個變量間交互作用的顯著程度，其中圓形表示兩兩因素交互作用不顯著，而橢圓形表示兩兩因素交互作用顯著[16];等高線圖由藍到紅的變化越快，沿白變量方向高度差越大[17]，引物濃度（Xl）和DNA模板量（X3）之間交互作用顯著。

根據(jù)Design Expert 8.0.6軟件分析出的若干解決方案與其相應(yīng)預(yù)測得分值，考慮到保證高響應(yīng)值的同時節(jié)約成本，對響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果進行最優(yōu)分析驗證，得到ISSR反應(yīng)體系的實際值（圖5），該值與理論預(yù)測值進行比較計算相對誤差，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，最優(yōu)實際解決方案引物濃度為0.40 umol·L-1，2×Taq Master Mix添加量為13.0 uL，DNA模板量30 ng，該條件與理論預(yù)測響應(yīng)值13.130 4的相對誤差僅為9.39%，說明該模型具有好的分析能力，可為實際操作提供良好的指導(dǎo)。

2.3退火溫度對ISSR反應(yīng)體系的影響

退火溫度影響ISSR圖譜的穩(wěn)定性，較低的退火溫度可保證引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定性，但較易產(chǎn)生錯誤的擴增。由電泳圖譜（圖6）可知，35循環(huán)數(shù)下，50.5～54.0℃隨著退火溫度的升高譜帶質(zhì)量與條帶數(shù)有較明顯的變化，退火溫度為50.5—52.7℃時，隨著溫度的升高條帶數(shù)呈增加趨勢，條帶質(zhì)量變好，52.7～54.0℃時，部分條帶模糊，缺失。選擇較高的退火溫度可減少引物和模板間非特異性的結(jié)合，提高擴增產(chǎn)物的特異性，綜合譜帶質(zhì)量和條帶數(shù)，退火溫度為52.7℃時最佳，可獲得較好的擴增效果。

通過優(yōu)化得到ISSR-PCR反應(yīng)的體系為引物濃度為0.4 umol·1-1，2×Taq Master Mix添加量為13 uL，DNA模板量30 ng，退火溫度為52.7 0C，循環(huán)次數(shù)35次;將該體系應(yīng)用于不同余甘子種質(zhì)資源效果見圖7，引物UBC841在該體系下可擴增出條帶清晰和多態(tài)性良好的電泳圖譜，表明該體系適宜應(yīng)用于余甘子種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究。

3討論與結(jié)論

ISSR是在SSR的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的分子標記，目前，ISSR已廣泛用于植物品種鑒定、遺傳圖譜、遺傳多樣性及分子生態(tài)學(xué)研究[18.19]。ISSR分子標記技術(shù)基于PCR反應(yīng)，其擴增譜帶受反應(yīng)條件和擴增程序變化以及物種不同的影響，采用不同的反應(yīng)體系組合和擴增程序電泳結(jié)果差異較大，因此，開發(fā)ISSR分子標記對其反應(yīng)體系和擴增程序優(yōu)化顯得必不可少。

本研究綜合運用單因素試驗與響應(yīng)面分析法，首先確定了各因素的有效范圍，再對各因素組合優(yōu)化，從而確立普遍適用于余甘子種質(zhì)資源的ISSR-PCR反應(yīng)體系。本研究PCR擴增采用2×Taq MasterMix試劑，該試劑將多種擴增原料混合，研究結(jié)果雖未能直觀體現(xiàn)Taq DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+等原料對余甘子ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響[20]，但可大大提高T作效率，達到了節(jié)省物料、簡便、快速的目的，可在ISSR分子標記研究中加以推廣應(yīng)用。本研究結(jié)果表明引物濃度對余甘子ISSR反應(yīng)體系影響較大，DNA模板量與引物濃度有顯著的交互作用，與前人研究較一致[21.22]。應(yīng)用響應(yīng)面法對影響ISSR反應(yīng)體系的主要因素進行篩選，建立余甘子ISSR反應(yīng)體系模型F=11.92-0.437 5X1-0.55X2 1.737 5X30.75XIX2 1.575X1X3 0.55X2X3 4.297 5Xl2 3.522 5X222.197 5X22，可較快地得到最優(yōu)組合，避免了單因素試驗結(jié)果的不足。

本研究確立余甘子ISSR-PCR反應(yīng)體系：引物濃度為0.4 UMol·1，2×Taq Master Mix添加量為13 UL，DNA模板濃度30 ng，擴增循環(huán)數(shù)為35循環(huán)，退火溫度52.7℃;擴增獲得的條帶清晰、穩(wěn)定，多樣性好，可應(yīng)用于余甘子種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系研究。

參考文獻：

[1]潘慧清，朱平，魏學(xué)明，等藏藥余甘子研究概[J]。甘肅中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2019，36 （2）：8488

PAN H Q，ZHU P， WEI X M，et al On Tibetan medicine Yuganzi（Phylianthi fructus） [Jl Journal of Gansu University of ChineseMedicine. 2019. 36（2）：8488.（ in Chinese）

[2] 國家藥典委員會中華人民共和國典一部[M]北京：中國醫(yī)藥利技出版社、2020 186-187

[3] 趙謀明，劉曉麗，崔春，等余甘子多酚響應(yīng)面法優(yōu)化提取及其抗氧化活性研究[J]食品工業(yè)科技，2007. 28 （6）：117-120

ZHAO M M. LIU X L，CUI C，et al.Studv on the optimizingextraction processing of polyphenol from Phyllanthus emblicaL fruitby method of response surface analvsis and its antioxidant activity [J]Science and Technology of Food Industry， 2007. 28（6）：117-120（ in Chinese）

[4] GANTAIT s，MAHANTA M. BERA s，et al Advances iiibiotechnology of Emblica officinalis Gaertn. syn. Phyllanthus emblicaL：A nutraceuticals-rich fruit tree with multifaceted ethnomedicinaluses [J]3 Biotech. 2021. 11 （2）;1-25

[5] ZIETKIEWICZ E，RAFALSKI A. LABUDA D Genomefmgerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerasechain reaction amplification [J] Genomics. 1994. 20（2）：176-183

[6] SARWAT M. DAS s，SRIVASTAVA P s Analysis of geneticdiversity through AFLP. SAMPL. ISSR and RAPD markers iiiTribulus terrestris.a medicinal herb [J]. Plant Cell Reports， 2008.27 （3） 519528

[7] 楊培奎，鄭道序，馬瑞君，等潮汕橄欖地方品種（系）遺傳多樣性的ISSR分析[J]廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013. 40 （23）：129-132

YANG P K. ZHENG D X. MA R J，et al_ Genetic diversity analvsis ofCanarium olbumL landrances in Chaoshan area by ISSR[J]Guangdong .Agricultural Sciences. 2013. 40 （23）：129-132 （inChinese）

[8] 張安世，韓臣鵬，齊秀娟，等基于ISSR標記的獼猴桃品種遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建[J]植物資源與環(huán)境學(xué)報，2017. 26 （3）：19-26

ZHANG A S，HAN C P，QI X J，et al Genetic diversity analvsis andfingerprinting construction of cultivars of Actinidio spp. based onISSR marker [J] Journal of Plant Resources and Environment. 2017，26 （3）：19-26 （in Chinese）

[9] 李國田，張美勇，相昆，等基于ISSR標記的16個核桃品種遺傳多樣性分析及分子身份構(gòu)建[J].核農(nóng)學(xué)報、2015. 29 （10）：1884-1892

LI G T，ZHANG M Y. XIANG K，et al Analysis of genetic diversityand establislunent of molecular ID for 16 walnut varieties based onISSR markers [Jl Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 2015.29（ 10）： 1884-1892. （in Chinese）

[IO]劉曉生，鄭道序，周春娟，等潮汕余甘子種質(zhì)資源遺傳多樣性與親緣關(guān)系的ISSR分析[J]中國南方果樹，2014.43 （1）：1822

LIU X S，ZHENG D X，ZHOU C J，et al Analysis of genetic diversityand genetic relationship of Phyllonthus emblicaL Gerniplasin inChaoshan area with ISSR [J] South China Fruits. 2014. 43（1）：1822 （in Chinese）

[11]周春娟，詹潮安，劉曉生，等粵東余甘子種質(zhì)資源遺傳多樣性與親緣關(guān)系的ISSR分析[C]//廣東省植物學(xué)會年會2012年年會論文集2012：16-16

ZHOU C J，ZHAN C A. LIU X S，et al ISSR Analysis of geneticdiversity and genetic relationship of Phyllanthus emblica germplasmresources in eastem Guangdong[C] //Annual meeting of GuangdongBotany Society. 2012： 16-16 （in Chinese）

[12]邵雪花，劉牛，賴多，等28份余甘子品種遺傳多樣性的ISSR分析及指紋圖譜構(gòu)建[J]西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2020.48 （8）：129-136

SHAO X H，LIU N. LAI D， et al Genetic diversity analysis and DNAfingerprint inapping of 28 varieties of Pbyllanthus emblicaL based onISSR molecular marker [J] Journol of Northivest A&f University（Natural Science Edition）， 2020. 48（8）：129-136（ln Chinese）

[13]李巧明，趙建立云南干熱河谷地區(qū)余甘子居群的遺傳多樣性研究[J]生物多樣性，2007. 15 （1）：8491

LI Q M. ZHAO J L Genetic diversity of Phyllanthus emblicopopulations in dry-hot valleys in Yunnan [J] Biodiversity Science.2007. 15（1）：8491. （in Chinese）

[14]李金璐，王碩，于婧，等 ‘種改良的植物DNA提取方法[J].植物學(xué)報.2013. 48 （1）：7278

LI J L，WANG S， YU J， et al A modified CTAB protocol for plantDNA extraction [J] Chinese Bulletin of Botany. 2013. 48（1）：7278. （in Chinese）

[15]尚小紅，嚴華兵，曹升，等葛根SCoT-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選[J]南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2018. 49 （1）：1-7

SHANG X H. YAN H B，CAO S，et al Optimization of SCoT-PCRreaction svstein and primer selection for Pueraria DC[J] Journal ofSoutbern Agriculture. 2018. 49（1）：1-7.（ in Chinese）

[16]闞琦繽，劉瑞雪，王曉婭，等響應(yīng)面優(yōu)化刺五加總黃酮提取工藝及

體外抗氧化研究[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2021. 36 （3）：358368

KAN Q B，LIU R X. WANG X Y. et al_ Process optimization and invitro antioxidant activity of flavonoids extracted from Acantbopanaxsenticosus [J] Fujian Journol ofAgricultural Sciences. 2021， 36 t3）I358368 （in Chinese）

[17]鄭良，李越凡，趙強，等基于響應(yīng)面分析的聚甲基丙烯酸甲酯表面微觀生物污損超聲防除研究[J]表面技術(shù)，2021. 50 （4）：319327

ZHENG L，LI Y F，ZHAO Q，et al_Research on removal ofmicrofouling on polymethyl methacrylate surface by ultrasonicantifouling technology based on response surface analysis [Jl SurfaceTechnology. 2021. 50 （4）： 319327（in Chinese）

[18] YEH F c Population genetic analysis of codominant and doininantmarkers and quantitative traits [J] Belgion Journal of Botany. 1997：129

[19]王建波ISSR分子標記及其在植物遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用[J]遺傳，2002. 24 （5）：613616

WANG J B ISSR markers and their applications in plant genetics [JlHereditas（Beijing）. 2002， 24（5）：613616.（ in Chinese）

[20]黃曉慧，巫偉峰，陳春，等中國蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選[J]南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2018. 49 （7）：1282-1288

HUANG X H. WU W F，CHEN C， et al Optimization and primerscreening of ISSR-PCR reaction system for Chinese Orchids [JlJournol of Southern .4griculture. 2018. 49（7） 1282-1288.（ inChinese）

[21]劉鳳書，侯開衛(wèi)，李紹家，等余甘子的保健價值及開發(fā)利用前景[J]自然資源學(xué)報，1993.8 （4）：299306

LIU F S，HOU K W. LI S J，et al The health-protecting value ofPhvllantbus emblicaL and its prospects for exploitation andutilization [J] Journal of Naturol Resources. 1993.8 （4）：299306. （in Chinese）

[22]鐘風(fēng)林，王江波，潘東明，等余甘子ISSR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J]生物技術(shù)通報，2008 （3）：166-169

ZHONG F L WANG J B，PAN D M. et al_Optimization of ISSRreaction system in Pbyllanthus emblica L[J] Biotechnology Bulletin.2008 （3）： 166-169 （in Chinese）

（責(zé)任編輯：黃愛萍）

收稿日期：2021-03-16初稿：2021-05-12修改稿

作者簡介：王建超（1988-），男，研究實習(xí)員，研究方向：熱帶與業(yè)熱帶果樹種質(zhì)資源保護與生理生化研究（Email： 447327289@qq.com）

通信作者：郭林榕（ 1963-），女，副研究員，研究方向：熱帶與業(yè)熱帶果樹種質(zhì)資源保存、選育種及栽培研究（Email： linrong-g@163com）

基金項目：福建省科技計劃公益類專項（ 2019Rl028—ll）：國家熱帶植物種質(zhì)資源庫（余甘子種質(zhì)資源分庫）（NTPGRC2021-011）：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部物種品種（熱帶作物）資源保護項日（ 151821301354052701）