王琨，汪金姣，王皞鵬

（上?？萍即髮W(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海201210）

過繼性細(xì)胞療法（adoptive cell therapy，ACT）在癌癥治療方面具有巨大的應(yīng)用價值，它通過基因修飾技術(shù)對天然T細(xì)胞進(jìn)行改造，使它們能夠特異性識別腫瘤以獲得腫瘤殺傷能力[1]。ACT主要包括腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocytes，TILs）療法、自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）療法、T細(xì)胞受體工程化T細(xì)胞（T cell receptor-engineered T cells，TCR-T）療法和嵌合抗原 受 體T細(xì) 胞（chimeric antigen receptor T cells，CAR-T）療法等。目前，CAR-T和TCR-T療法應(yīng)用最廣。

CAR-T療法已被證實(shí)可用于復(fù)發(fā)或難治性B細(xì)胞淋巴瘤如急性淋巴細(xì)胞白血病、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤的治療[2-4]。目前，美國FDA總共批準(zhǔn)了5款CAR-T治療產(chǎn)品，為腫瘤患者帶來了新的希望。盡管CAR-T療法在血液瘤的治療中顯示出卓越的療效，但對于實(shí)體瘤的治療效果卻不盡如人意。CAR-T療法通過識別膜表面抗原而發(fā)揮作用，而近90%的惡性實(shí)體腫瘤缺乏膜表面特異性抗原，TCR-T療法則能夠識別細(xì)胞內(nèi)來源的腫瘤特異性抗原。這也意味著，TCR-T療法擁有更多的腫瘤潛在靶點(diǎn)選擇，能更好地減少免疫逃逸，最終更有效地實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答，達(dá)到精準(zhǔn)治療的目的。因此，目前TCR-T療法是最有可能在實(shí)體瘤治療中取得突破的T細(xì)胞免疫療法。本文將聚焦于現(xiàn)有TCR-T療法相關(guān)的非臨床研究動物模型以及TCR-T療法臨床發(fā)展現(xiàn)狀，并進(jìn)一步探討了動物模型在克服TCR-T療法當(dāng)前限制性因素中的相關(guān)應(yīng)用，為提高其臨床治療效果提供高效且廣譜的解決方案。

1 T細(xì)胞受體工程化T細(xì)胞療法簡述

TCR-T療法是一種通過工程化改造T細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)對腫瘤患者進(jìn)行治療的過繼性免疫療法。TCR-T療法通過直接賦予T細(xì)胞特異性識別結(jié)合腫瘤抗原的TCR，使得原本無腫瘤識別能力的T細(xì)胞能夠有效地識別并殺傷腫瘤細(xì)胞，治療的基本步驟為：首先，從患者的外周血中分離純化出T細(xì)胞；繼而利用基因工程技術(shù)，將識別腫瘤特異抗原的TCR基因序列導(dǎo)入患者自身T細(xì)胞中，獲得特異識別腫瘤抗原的TCR-T；之后，將TCR-T通過體外培養(yǎng)進(jìn)行大量擴(kuò)增；最后，擴(kuò)增得到的TCR-T被回輸?shù)交颊唧w內(nèi)對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。細(xì)胞內(nèi)在的抗原遞呈機(jī)制使TCR-T可針對細(xì)胞胞內(nèi)抗原（占全部抗原的90%）而不局限在細(xì)胞表面抗原（僅占10%）。因此，TCR-T可以靶向大部分的腫瘤特異性或相關(guān)性抗原，這使其對腫瘤的識別范圍比抗體類藥物以及依靠抗體識別腫瘤的CAR-T的應(yīng)用范圍更廣。TCR-T依賴天然的TCR發(fā)揮作用，意味著其抗原親和力以及信號強(qiáng)度都要弱于CAR-T，這使得TCR-T的持久性和浸潤性要優(yōu)于CAR-T，從而在實(shí)體瘤的治療中優(yōu)于CAR-T療法。

TCR-T療法的出現(xiàn)要早于CAR-T療法。20世紀(jì)90年代，來自美國國家癌癥研究所（NCI）和華盛頓大學(xué)的研究人員最早提出了T細(xì)胞的治療用途，首次從人外周血中分離出抗原特異性T細(xì)胞，并過繼性回輸給腫瘤或病毒感染的患者體內(nèi)，取得了一定的臨床治療效果[5]。多項(xiàng)臨床試驗(yàn)表明，體外擴(kuò)增的TILs可用于治療人類癌癥，如惡性黑色素瘤[6-7]或卵巢癌[8]。NCI研究人員對TILs靶向腫瘤的治療潛力進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示該方法在72%的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者中產(chǎn)生了客觀反應(yīng)[9]。然而，TILs對其他惡性腫瘤的治療成功率非常有限，主要原因是大多數(shù)癌癥患者體內(nèi)很難被分離出腫瘤特異性T細(xì)胞，另外獲得足夠數(shù)量T細(xì)胞需要相當(dāng)長的時間。正是這些原因推動了TCR-T技術(shù)的發(fā)展，使得產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞成為可能。此后，TCR-T療法在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、結(jié)直腸癌、滑膜肉瘤和多發(fā)性骨髓瘤患者中均顯示出良好的臨床效果，表明TCR-T療法在實(shí)體瘤的治療中具有很好的應(yīng)用前景[10-14]。

2 T細(xì)胞受體工程化T細(xì)胞療法非臨床研究 動物模型

為了驗(yàn)證和優(yōu)化TCR-T療法在臨床應(yīng)用中的安全性和有效性，研究人員需要建立非臨床研究的動物模型，并對治療效果進(jìn)行驗(yàn)證和評估。在利用TCR-T療法進(jìn)行治療的過程中，存在的安全性問題或不良反應(yīng)主要包括：靶標(biāo)毒性（on-target toxicity），指TCR-T攻擊腫瘤細(xì)胞的同時也攻擊表達(dá)TCR-T靶向抗原的正常細(xì)胞，使得健康組織受損；脫靶毒性（off-target toxicity），指TCR-T無法區(qū)分腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原和正常細(xì)胞抗原，損傷了表達(dá)與靶點(diǎn)相似抗原表位的健康組織；細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS），指工程化的T細(xì)胞完成輸注后，使得T細(xì)胞被激活并快速增殖，引起細(xì)胞因子的過度級聯(lián)釋放，是一種嚴(yán)重的過度免疫應(yīng)答。建立合適的臨床前治療模型，可以加快TCR-T療法的開發(fā)和應(yīng)用，最大程度避免臨床試驗(yàn)中可能出現(xiàn)的安全問題。目前，在TCR-T療法的研究中主要使用2種嚙齒類動物模型：一是同基因型小鼠模型，使用小鼠T細(xì)胞和小鼠抗原，具有保留著完整免疫系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)；二是異種移植瘤小鼠模型，使用免疫缺陷型小鼠和人源T細(xì)胞及人源腫瘤細(xì)胞，具有能夠研究人源細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)[15-16]。此外，在CAR-T療法的研究中，靈長類動物模型也被用于評估該療法的有效性和安全性。例如，在分別以ROR1，L1CAM以及CD20等腫瘤抗原為靶點(diǎn)的CAR-T臨床前研究中，均使用了靈長類動物作為模型，它們?yōu)檫@些CAR-T產(chǎn)品的安全性提供了有價值的信息[17-19]。相比小鼠模型，靈長類動物的免疫系統(tǒng)與人類更相似，其模型更接近患者體內(nèi)的情況。靈長類動物模型在CAR-T療法中的應(yīng)用對于TCR-T臨床前治療模型的構(gòu)建具有很大的參考價值，相信未來會有更多種類的動物模型在TCR-T療法臨床前研究中得到應(yīng)用。

隨著TCR-T療法的不斷發(fā)展，已有多種用于研究的小鼠腫瘤模型被成功構(gòu)建，包括表達(dá)T細(xì)胞識別的黑色素瘤抗原1（melanoma-associated antigen recognized by T cells 1，MART-1）的 黑 色素瘤模型[20-21]、表達(dá)紐約食管鱗狀細(xì)胞癌1（New York esophageal squamous cell carcinoma 1，NYESO-1）抗原的小鼠腫瘤模型[22]、表達(dá)糖蛋白100（glycoprotein 100，gp100）抗原的小鼠腫瘤模型[23]、表達(dá)癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）的結(jié)腸癌小鼠模型[24]、表達(dá)p53抗原的骨肉瘤小鼠模型[25]、愛潑斯坦-巴爾二氏病毒（Epstein-Barr virus，EBV）相關(guān)的小鼠腫瘤模型[26]、人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）相關(guān)的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌小鼠模型[27]、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）相關(guān)的肝癌小鼠模型[28]等。研究人員在構(gòu)建MART-1，NY-ESO-1，p53等腫瘤模型時，一般先將3×106～ 5×106個腫瘤細(xì)胞通過皮下注射的方式種植在免疫缺陷型小鼠皮下，而gp100，CEA，EBV，HPV，HBV等模型的腫瘤細(xì)胞種植數(shù)目相對較少，一般在5×105～ 10×105個細(xì)胞左右。模型構(gòu)建的下一步需要根據(jù)腫瘤生長狀況選擇合適的時間點(diǎn)，將工程化改造后的腫瘤特異性TCR-T通過尾靜脈注射的方式轉(zhuǎn)移至小鼠模型體內(nèi)。MART-1，NY-ESO-1，EBV等模型一般會在移植腫瘤細(xì)胞3 ～ 5周后輸入TCR-T，而gp100，CEA，p53，HPV，HBV等模型會在移植腫瘤細(xì)胞1 ～ 2周后靜脈注入TCR-T。此外，不同的腫瘤模型需要輸入的TCR-T數(shù)目也會存在差異。MART-1，NY-ESO-1，gp100，HBV等腫瘤模型一般在輸入1×106～ 3×106個TCR-T后，便會達(dá)到良好的腫瘤殺傷效果，而CEA，p53，EBV，HPV等模型一般需要靜脈注入5×106～ 10×106個TCR-T才能達(dá)到理想的體內(nèi)抗腫瘤功效。在構(gòu)建腫瘤模型以及體內(nèi)試驗(yàn)的整個過程中，需要對腫瘤的生長狀況進(jìn)行定期監(jiān)測，最常用的2種監(jiān)測方式是活體成像和游標(biāo)卡尺測量腫瘤。目前，業(yè)內(nèi)尚未建立起動物模型和臨床治療之間的TCR-T回輸劑量關(guān)系。臨床上在對患者進(jìn)行TCR-T治療時，回輸細(xì)胞數(shù)目主要依據(jù)患者的體質(zhì)量來確定，相較于CAR-T，TCR-T回輸?shù)臄?shù)量要高100 ～ 1 000倍，大多集中在109～ 1010個細(xì)胞之間。此外，TCR-T療法的回輸劑量標(biāo)準(zhǔn)尚未建立，并且因細(xì)胞回輸劑量過大而引起細(xì)胞毒性現(xiàn)象的研究少見。與CAR-T療法相比，TCR-T療法引起CRS的程度更低，但若是過量的T細(xì)胞回輸后導(dǎo)致T細(xì)胞激活并快速增殖必然會引起細(xì)胞因子過度級聯(lián)釋放。因此，未來可以參考CAR-T療法的劑量爬坡試驗(yàn)評估TCR-T療法的臨床安全性和有效性。

構(gòu)建小鼠模型開展臨床前相關(guān)研究是實(shí)現(xiàn)基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)化至臨床應(yīng)用的重要橋梁。臨床數(shù)據(jù)顯示，在接受CEA特異性TCR-T治療的患者中觀察到的細(xì)胞毒性與在CEA小鼠模型中觀察到的毒性高度相似，TCR-T除了發(fā)揮抗腫瘤功能外，還破壞了正常的結(jié)腸組織，類似于自身免疫性結(jié)腸炎[29]。在Pmel-1TCR轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，使用gp100特異性TCR-T治療后，引起了小鼠的眼部損傷，這與接受gp100特異性TCR-T治療的黑色素瘤患者中出現(xiàn)的狀況基本相似[30]。以上結(jié)果表明，在進(jìn)行TCR-T療法臨床試驗(yàn)前，小鼠腫瘤模型構(gòu)建的必要性。動物模型的構(gòu)建能夠評估TCR-T療法的治療潛力，預(yù)測TCR-T療法的細(xì)胞毒性，為臨床試驗(yàn)的安全有效進(jìn)行提供保障。

3 T細(xì)胞受體工程化T細(xì)胞療法臨床研究現(xiàn)狀

2006年，Morgan等[10]首次報(bào)道了針對黑色素瘤患者的TCR-T療法。研究人員使用RNA電穿孔的方法給患者的外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）轉(zhuǎn) 導(dǎo) 了4種編 碼TCR的RNA，它們分別能夠識別MART-1:27-35，gp100:209-217，NY-ESO-1:157-165和p53:264-272肽/人類白細(xì)胞抗原A2（human leukocyte antigen A2，HLA-A2）復(fù)合物；依據(jù)實(shí)體瘤反應(yīng)評估標(biāo)準(zhǔn)（RECIST）評估后，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過治療的17例黑色素瘤患者對TCR-T療法產(chǎn)生了不同程度響應(yīng)，其中2例表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的持續(xù)客觀消退，1例在接受治療后出現(xiàn)了腋下腫塊的完全消退，肝臟腫塊也減少了89%，治療后第21個月，該患者仍未表現(xiàn)出疾病進(jìn)展；另1例患者的肺門腫塊出現(xiàn)消退，治療后第20個月仍無疾病進(jìn)展。Johnson等[11]使用高親和力的MART-1（AAGIGILTV）特異性TCR治療20例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者，其中6例（30%）出現(xiàn)了客觀的癌癥消退，肺部、腦部、肝部和皮膚的腫瘤明顯縮小。

Robbins等[13]報(bào)道的靶向滑膜細(xì)胞肉瘤和黑色素瘤抗原NY-ESO-1的TCR-T療法的臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，4例（67%）滑膜細(xì)胞肉瘤患者和11例（45%）黑色素瘤患者均出現(xiàn)了客觀臨床反應(yīng)，其中有2例黑色素瘤患者表現(xiàn)出完全消退，1例滑膜細(xì)胞肉瘤患者表現(xiàn)出持續(xù)18個月的部分反應(yīng)。2015年，Robbins等[14]報(bào)道了一項(xiàng)使用親和力增強(qiáng)的TCR識別NY-ESO-1（SLLMWITQC）的臨床試驗(yàn)結(jié)果：將TCR通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)入了18例滑膜細(xì)胞肉瘤患者和20例黑色素瘤患者的PBMC中，18例NY-ESO-1陽性滑膜細(xì)胞肉瘤患者中的11例（61%）和20例NY-ESO-1陽性黑色素瘤的患者中的11例（55%）表現(xiàn)出了客觀的臨床反應(yīng)。

Parkhurst等[31]報(bào)道了針對結(jié)腸癌患者的TCR-T療法臨床試驗(yàn)結(jié)果，該項(xiàng)試驗(yàn)使用了靶向結(jié)腸癌高表達(dá)抗原CEA（一種糖基化蛋白，在多種胃腸道癌細(xì)胞中高表達(dá)）的TCR（IMIGVLVGV），臨床結(jié)果顯示，對其他療法無效的3例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者接受了TCR-T療法后，均檢測到CEA水平的顯著降低，且1例患者肺和肝轉(zhuǎn)移性腫瘤客觀消退。Kageyama等[32]報(bào)道了靶向黑色素瘤抗原家族A4（melanoma antigen family A4，MAGE-A4）（NYKRCFPVI）的TCR-T療法在10例對于常規(guī)治療手段如放療和化療等響應(yīng)較差或不響應(yīng)的食管癌復(fù)發(fā)患者中的臨床試驗(yàn)結(jié)果，這些患者在接受治療后短期內(nèi)腫瘤縮小，3例病情最輕微的患者在未接受其他治療的情況下，1年后疾病不再進(jìn)展。Nagarsheth等[33]報(bào)道了靶向HPV的TCR-T療法臨床試驗(yàn)結(jié)果：與HPV相關(guān)的惡性腫瘤是典型的上皮癌，包括宮頸癌、口咽癌、肛門癌、外陰癌、陰道癌和陰莖癌均表達(dá)HPV E7抗原，有助于惡性轉(zhuǎn)化和癌細(xì)胞存活，HPV E7抗原可作為工程T細(xì)胞的治療靶點(diǎn)；12例轉(zhuǎn)移性HPV-16陽性癌癥患者中8例曾接受程序化細(xì)胞死亡蛋白1（PD-1）免疫治療、1例曾接受LN-145細(xì)胞治療，效果均不理想，接受靶向TCR的HPV-16 E7工程改造的T細(xì)胞（E7 TCR-T）治療后，6例出現(xiàn)了明顯的腫瘤消退。

綜上所述，在這些TCR-T療法的臨床試驗(yàn)中，針對同種腫瘤的不同試驗(yàn)的臨床客觀性也會出現(xiàn)差異，這與針對同一抗原的不同TCR的選擇和TCR-T制備工藝之間的差異有關(guān)。表1顯示了目前已完成的關(guān)于TCR-T療法的臨床試驗(yàn)結(jié)果。

表1 已完成的T細(xì)胞受體工程化T細(xì)胞療法臨床試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of conducted clinical trials of T cell receptor-engineered T cells therapy

4 動物模型在克服T細(xì)胞受體工程化T細(xì)胞 療法挑戰(zhàn)中的應(yīng)用

盡管已有部分腫瘤患者從TCR-T療法中獲益[34]，但作為一種新的腫瘤治療方式，TCR-T療法仍然具有一定的局限性。其限制性因素主要包括：靶向抗原的選擇、腫瘤特異性TCR的開發(fā)、T細(xì)胞的體內(nèi)持久性和TCR-T療法的臨床安全性等。為了更加安全有效地對腫瘤患者進(jìn)行治療，可以通過以下策略在非臨床研究的動物模型中預(yù)測改善后的TCR-T療法的抗腫瘤功效和臨床安全性。

4.1 選擇T細(xì)胞受體工程化T細(xì)胞靶向抗原

在TCR-T治療過程中，第一步是選擇最合適的腫瘤抗原作為TCR靶標(biāo)。目前，主要存在3種類型的腫瘤抗原：存在于健康組織但在癌細(xì)胞中高表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigens，TAAs）；在癌細(xì)胞、睪丸、胎兒卵巢和滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)的癌睪丸抗原[35]（cancer testis antigens，CTAs）；僅在癌細(xì)胞中表達(dá)的腫瘤特異性抗原（tumor-specific antigens，TSAs）如新抗原（neoantigen）和致癌病毒產(chǎn)生的抗原，但在健康組織中不表達(dá)。

目前，已有部分理想的腫瘤抗原短肽被發(fā)現(xiàn)，以用于TCR-T技術(shù)的開發(fā)。在這些抗原肽中，NYESO-1多次被證實(shí)是安全有效的腫瘤抗原之一，靶向該種抗原的TCR-T臨床試驗(yàn)占30%以上。人乳頭瘤病毒HPV-16中的E6和E7蛋白是腫瘤特異性抗原，與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，針對這2種抗原的TCR-T臨床試驗(yàn)在這幾年也迅速增加。此外，許多TAAs，CTAs或TSAs可用于TCR-T治療，例如MART-1，威爾姆斯瘤基因1（Wilms' tumor gene 1，WT-1），乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg），甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP），MAGE（A3，A4，A6，A10），黑色素瘤優(yōu)先表達(dá)抗原（preferentially expressed antigen in melanoma，PRAME），巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV），EBV，糖胺聚糖（glycosaminoglycan，gag），gp100，紅血球凝聚素1（hemagglutinin-1，HA1），人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒E（human endogenous retroviruses-E，HERV-E），大型多功能肽酶2（large multifunctional peptidase 2，LMP2），CEA，p53等[1]，靶向這些抗原的臨床試驗(yàn)也正在進(jìn)行（見圖1）。腫瘤新抗原由點(diǎn)突變、染色體易位和其他類型的致癌基因改變產(chǎn)生，這些抗原在除了腫瘤細(xì)胞外任何其他健康組織中均不存在，可作為TCR-T的靶點(diǎn)，而無脫靶毒性[36]?；蚪M測序、質(zhì)譜分析技術(shù)和數(shù)據(jù)分析技術(shù)的進(jìn)步促進(jìn)了個體癌癥特有的特異性新抗原的鑒定，使得自體TCR-T能夠?qū)哂信R床活性的新抗原產(chǎn)生反應(yīng)[37-39]。盡管有許多新抗原是通過經(jīng)典突變產(chǎn)生的，但其他一些由翻譯后修飾（例如磷酸化或甲基化）產(chǎn)生的新抗原也可以被TCR-T靶向[40-41]。

圖1 T細(xì)胞受體工程化T細(xì)胞療法的臨床試驗(yàn)靶向抗原分布Figure 1 Distribution of targeted antigens of TCR-T clinical therapy

為了確保TCR-T療法的安全性和有效性，原則上應(yīng)該選擇僅在癌細(xì)胞中表達(dá)的腫瘤特異性抗原作為理想靶標(biāo)。篩選出的腫瘤抗原短肽在進(jìn)入臨床應(yīng)用前需要在動物模型中驗(yàn)證其腫瘤特異性，證實(shí)這些抗原短肽是否僅在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，最大程度地減小TCR-T療法在臨床治療中潛在的脫靶毒性。

4.2 腫瘤特異性T細(xì)胞受體的開發(fā)與優(yōu)化

找到合適的腫瘤特異性抗原只解決了問題的一半，因?yàn)橐Y選出靶向抗原的最適TCR也存在一定的挑戰(zhàn)性。分離出腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞需要選擇合適的細(xì)胞來源，并且理想的T細(xì)胞要具有合適親和力的TCR和顯著的TCR表達(dá)頻率與純度，這些先決條件是成功開發(fā)出腫瘤特異性TCR的基礎(chǔ)。獲得腫瘤特異性T細(xì)胞后，在TCR測序中面臨的最大挑戰(zhàn)是每個T細(xì)胞腫瘤特異性TCR的α和β鏈的正確配對。高通量測序技術(shù)的引入可以使研究人員分析樣品中數(shù)百萬個TCR分子的多樣性，通過這種方法可以獲得所有TCR序列以構(gòu)成樣本庫[42-44]。目前，獲得特異性TCR最快的方法是將單細(xì)胞TCR測序與帶有特定人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）分子和選定腫瘤表位的條形碼樣多聚體結(jié)合起來，從而顯著加快從人類樣品中分離TCR的速度，避免任何富集步驟，并直接能夠進(jìn)行TCR序列的功能驗(yàn)證[45]。

TCR的親和力被證實(shí)與TCR-T功能直接相關(guān)[46-48]。高親和力的TCR已被用于大多數(shù)臨床試驗(yàn)，因?yàn)樗鼈兡軌蛞暂^低的表達(dá)水平識別腫瘤細(xì)胞，但是高親和力的TCR可能會導(dǎo)致自身免疫性疾病。一些研究表明，TCR的親和力處于低水平或中等水平也可以介導(dǎo)T細(xì)胞對腫瘤的殺傷，并且不會誘發(fā)自身免疫性疾病[49-53]。Miller等[49]研究發(fā)現(xiàn)，分別將高親和力或低親和力卵清蛋白（ovalbumin，OVA）特異性TCR-T轉(zhuǎn)移至卵巢癌小鼠模型后，高親和力的TCR-T在快速殺傷表達(dá)OVA的卵巢癌細(xì)胞的同時，也造成了小鼠的自身免疫性糖尿?。蝗欢?，低親和力的TCR-T同樣能介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的清除，而沒有產(chǎn)生自身免疫性疾病。目前，關(guān)于中低親和力TCR-T的良好抗腫瘤功效，只在部分腫瘤中得以體現(xiàn)，比如卵巢癌[49]、黑色素瘤[50-51]等，仍需更多的證據(jù)來證明中低親和力TCR應(yīng)用的普遍性。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，某些化學(xué)藥品、細(xì)胞因子和放射療法可以激活HLA信號通路并上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面抗原肽和HLA復(fù)合物的表達(dá)[54-55]。因此，使用具有最佳親和力的TCR可以特異性地消滅腫瘤細(xì)胞，而不會誘發(fā)自身免疫性疾病，并且TCR-T療法與其他療法聯(lián)合使用的組合治療方案有望實(shí)現(xiàn)治療效果最大化。

4.3 改善T細(xì)胞體內(nèi)持久性

目前，工程化改造后的T細(xì)胞存在著體內(nèi)持久性受限的問題。無論是傳統(tǒng)的免疫細(xì)胞療法，還是TCR-T療法及CAR-T療法，T細(xì)胞都需要在體外經(jīng)刺激活化，大量增殖分化成為終末分化效應(yīng)T細(xì)胞（effector T cell）后輸回體內(nèi)。回輸?shù)腡細(xì)胞無增殖分化能力，且長期的體外刺激活化，使T細(xì)胞逐漸進(jìn)入耗竭狀態(tài)（T cell exhaustion），回輸體內(nèi)后容易走向死亡，而難以在體內(nèi)發(fā)揮持久的抗腫瘤效應(yīng)[56]。研究顯示，記憶T細(xì)胞是一群低分化狀態(tài)的異質(zhì)性T細(xì)胞亞群，在持續(xù)對抗腫瘤或遇到復(fù)發(fā)腫瘤時能快速增殖分化產(chǎn)生效應(yīng)T細(xì)胞而有效清除腫瘤細(xì)胞，在腫瘤免疫應(yīng)答和免疫記憶維持中發(fā)揮重要作用[57]。

記憶T細(xì)胞在不同強(qiáng)度的信號刺激下，可根據(jù)表型、功能和轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)歸為干細(xì)胞記憶T細(xì)胞（stem cell memory T cell，TSCM）、中樞記憶T細(xì)胞（central memory T cell，TCM）、效應(yīng)記憶T細(xì)胞（effector memory T cell，TEM）及組織駐留記憶T細(xì)胞（tissue resident memory T cell，TRM）亞群[58]。Gattinoni等[59]發(fā)現(xiàn)，na?ve T細(xì)胞激活分化后產(chǎn)生的TSCM仍具有na?ve T細(xì)胞的表型，如CD45RA，CD62L及CCR7，又有激活后T細(xì)胞的表型，如CD95，IL2Rβ和IL15Rβ。作為記憶細(xì)胞，TSCM能快速地分泌細(xì)胞因子，響應(yīng)IL-15快速地增殖，是一群自我更新能力最強(qiáng)的記憶T細(xì)胞亞群。Xu等[60]研究表明，在有IL-15和IL-7條件下體外培養(yǎng)T細(xì)胞時，能獲得更高比例TSCM亞群，在小鼠腫瘤模型中的存活持續(xù)時間和抗腫瘤效果更好。TCM表達(dá)CD62L和CCR7，具有快速增殖和分化的特征，能夠歸巢至次級淋巴器官。TEM表型為CD62L-CCR7-，更傾向于分泌細(xì)胞毒因子，具有較強(qiáng)的溶瘤功能，可遷移至炎癥組織中迅速發(fā)揮效應(yīng)功能。TRM為組織駐留性記憶T細(xì)胞，不參與循環(huán)，由于其浸潤能力以及直接的殺傷效應(yīng)，能快速響應(yīng)局部組織抗感染和抗腫瘤，在抗實(shí)體瘤中有應(yīng)用前景[61]。

除了在臨床前小鼠模型中，低分化水平的記憶T細(xì)胞在臨床上也展現(xiàn)出更好的治療效果。2019年，Chapuis等[62]報(bào)道了靶向抗原WT-1的TCR-T療法的臨床試驗(yàn)結(jié)果，對于TCR-T療法響應(yīng)較好的患者體內(nèi)，低分化水平的中樞記憶T細(xì)胞所占的比例更高。因此，可以通過改善細(xì)胞培養(yǎng)條件或工程化改造T細(xì)胞等手段，使回輸?shù)腡CR-T中具有更高比例的記憶性T細(xì)胞，從而提高T細(xì)胞回輸后在體內(nèi)的持久性，進(jìn)而增強(qiáng)TCR-T療法的抗腫瘤功效。

4.4 提高T細(xì)胞受體工程化T細(xì)胞療法臨床安全性

動物模型在提高TCR-T療法的臨床安全性方面起著關(guān)鍵作用。然而，在TCR-T療法開發(fā)的過程中，這些動物模型也會出現(xiàn)無法準(zhǔn)確預(yù)測細(xì)胞治療毒性和移植物抗宿主反應(yīng)等問題。Rapoport等[63]在以癌睪丸抗原NY-ESO-1為靶標(biāo)對多發(fā)性骨髓瘤患者進(jìn)行治療的臨床結(jié)果顯示，雖然70%的患者病情接近完全緩解，但有5例患者出現(xiàn)了自體移植物抗宿主反應(yīng)。Morgan等[64]在以黑色素瘤相關(guān)抗原MAGE-A3作為靶標(biāo)的TCR-T臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，雖然部分患者出現(xiàn)緩解，但有3例患者出現(xiàn)了由腦部損害引起的精神障礙，其中2例受試者甚至面臨死亡的危險(xiǎn)，這是由于MAGE-A3 TCR交叉識別結(jié)合腦部正常組織中MAGE-A12抗原肽而導(dǎo)致的神經(jīng)毒性。因此，不同腫瘤類型在選擇特異性TCR時就意味著可能存在特定器官的毒性，如MAGE3 TCR在大腦和心臟中具有毒性。相較于CAR-T，小鼠模型在預(yù)測TCR的脫靶或靶標(biāo)毒性方面有所欠缺。因此，用于TCR-T療法研究的臨床前小鼠模型還需進(jìn)一步的改進(jìn)與優(yōu)化。在構(gòu)建腫瘤模型時，選擇表達(dá)了人細(xì)胞因子的人源化小鼠品系MITRG和MISTRG，為移植的人源細(xì)胞提供物種特異性細(xì)胞因子支持，可以更好地驗(yàn)證TCR-T療法的治療效果和臨床安全性[65]。在TCR-T療法的臨床前研究中，選擇構(gòu)建人源腫瘤異種移植（patient-derived tumor xenograft，PDX）小鼠模型，將腫瘤患者的腫瘤組織移植至重癥免疫缺陷型小鼠體內(nèi)，使小鼠模型能更真實(shí)地模擬患者的體內(nèi)環(huán)境，可為TCR-T治療提供更精準(zhǔn)的研究與評價工具[66]。此外，為了真實(shí)反映與評價人源免疫細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境在抗腫瘤免疫治療中發(fā)揮的作用，需要建立更加有效的人免疫反應(yīng)體系小鼠模型。由于TCR-T發(fā)揮抗腫瘤作用離不開相關(guān)免疫細(xì)胞的參與，因此，構(gòu)建含人源免疫細(xì)胞系統(tǒng)的人源化小鼠模型，在有效驗(yàn)證與評估抗腫瘤免疫治療效果中可發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

除了在非臨床研究的動物模型中驗(yàn)證TCR-T療法的臨床安全性之外，還可以通過對TCR-T進(jìn)行改造來增強(qiáng)TCR-T治療的安全性。TCR-T療法在臨床治療中往往展現(xiàn)出較CAR-T療法更低的副作用，但脫靶效應(yīng)造成的副作用仍阻礙著TCR-T療法的發(fā)展。TCR-T療法對腫瘤患者進(jìn)行治療的過程中，患者可能會出現(xiàn)CRS等嚴(yán)重的副作用，并可能進(jìn)一步引起致命的并發(fā)癥。若腫瘤抗原在健康組織細(xì)胞中低表達(dá)，則可能會引起TCR-T的靶點(diǎn)毒性，導(dǎo)致健康細(xì)胞被T細(xì)胞殺傷[67]。此外，外源TCR和T細(xì)胞內(nèi)源TCR的錯配也可能會導(dǎo)致TCR-T的非特異性脫靶毒性，而對正常組織造成嚴(yán)重?fù)p害[68]。此時，自殺基因的引入可作為調(diào)節(jié)和優(yōu)化TCR-T療法的備選策略。單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）是在臨床上經(jīng)過反復(fù)驗(yàn)證的一種自殺基因，并被證明安全有效，可以賦予TCR-T對更昔洛韋（ganciclovir）的致死敏感性[69-70]。其他自殺基因，比如截短的人類表皮生長因子受體（tEGFR）和誘導(dǎo)型Caspase 9安全開關(guān)（iCasp9）也經(jīng)常被用于提高臨床安全性的設(shè)計(jì)[71-72]。另外，臨床前需要嚴(yán)格評估腫瘤靶向抗原是否會在正常組織或器官中表達(dá)。比如，在AFP特異性TCR-T療法開展前，可利用丙氨酸掃描評估TCR-T的特異性和安全性[73]。由于外源TCR在T細(xì)胞中表達(dá)時，可能存在與內(nèi)源TCR表達(dá)競爭和錯配等問題，可以利用基因編輯和RNA干擾等技術(shù)，敲除或敲低內(nèi)源性TCR，來避免這些問題[74-75]。

5 總結(jié)與展望

TCR-T免疫療法正在逐漸發(fā)展成為一種廣泛適用，且功能強(qiáng)大的癌癥治療手段。到目前為止，TCR-T療法已在部分實(shí)體瘤的治療中取得了較好的臨床效果，特別是針對黑色素瘤和滑膜細(xì)胞肉瘤等的治療。盡管TCR-T療法為腫瘤患者帶來了新的治療選擇和希望，但是該療法對于實(shí)體瘤的治療還存在一些挑戰(zhàn)，包括靶向抗原的選擇、腫瘤特異性TCR的開發(fā)、T細(xì)胞的體內(nèi)持久性和TCR-T療法的臨床安全性等。相信隨著工程化改造T細(xì)胞研究的不斷發(fā)展，在不久的將來會有更多的腫瘤患者在TCR-T療法中受益。