黃倩茹，朱一成，李揚(yáng)揚(yáng)，李斌

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 上海市免疫學(xué)研究所，上海 200025）

惡性腫瘤已成為許多國家70歲以下人群的第一大死亡原因。由于人口老齡化的加劇，全球癌癥負(fù)擔(dān)在20年后將增加近50%[1]。同時(shí)，由于中國巨大的人口基數(shù)，2020年全國新發(fā)癌癥人數(shù)和癌癥死亡人數(shù)均居全球第一。近數(shù)十年來，雖然早期檢測的落實(shí)和免疫治療的突破在一定程度上延長了癌癥患者的生存期，但免疫治療領(lǐng)域仍然存在著許多有待攻克的難題，如靶向藥物難以避免的耐藥性，免疫檢查點(diǎn)抑制劑有限的反應(yīng)率和嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T cells，CAR-T）療法對(duì)實(shí)體瘤效果較差等。T細(xì)胞受體工程化T細(xì)胞（T cell receptor-engineered T cells，TCR-T）利用基因工程技術(shù)在T細(xì)胞上表達(dá)特異性識(shí)別腫瘤抗原的T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR），使之能特異性地靶向腫瘤細(xì)胞，清除腫瘤，被認(rèn)為有機(jī)會(huì)突破實(shí)體瘤的細(xì)胞治療困境，并通過個(gè)性化設(shè)計(jì)避免耐藥、提高反應(yīng)率。

腫瘤抗原，包括腫瘤中過表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原（tumor associated antigen，TAA）和腫瘤特異性抗原（tumor specific antigen，TSA），被主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC）遞呈后可選擇性地增強(qiáng)T細(xì)胞反應(yīng)從而控制腫瘤生長。目前，TCR-T的臨床應(yīng)用常基于高通量測序獲得腫瘤細(xì)胞非同義突變的信息，結(jié)合預(yù)測算法識(shí)別潛在的腫瘤抗原，并對(duì)腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞進(jìn)行篩選，獲得反應(yīng)性TCR序列，之后利用慢病毒載體在患者自體T細(xì)胞中過表達(dá)反應(yīng)性TCR序列，再將能靶向腫瘤抗原的工程化T細(xì)胞回輸?shù)讲∪梭w中啟動(dòng)抗腫瘤免疫（見圖1）。近期的臨床研究展示了TCR-T富有希望的治療效果，但由于腫瘤抗原的個(gè)體特異性及TCR庫的豐富性，識(shí)別新的腫瘤抗原和與之配對(duì)的抗原特異性TCR極具挑戰(zhàn)性，而這將十分有助于拓展TCR-T的臨床應(yīng)用范圍。本文將綜述近年來開展臨床應(yīng)用的TCR-T類型，總結(jié)當(dāng)前的一些富有新意的篩選策略，并對(duì)TCR-T的未來發(fā)展進(jìn)行展望。

圖1 腫瘤特異性抗原反應(yīng)性T細(xì)胞免疫治療的基本步驟Figure 1 The basic steps of tumor-specific antigen-reactive T cell immunotherapy

1 T細(xì)胞受體工程化T細(xì)胞的臨床應(yīng)用

早在2002年，Dudley等[2]報(bào)道在體外多輪篩選腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs），得到攜帶特異性TCR的T細(xì)胞進(jìn)行回輸治療；其進(jìn)一步的臨床研究篩選了靶向人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-A*02限制性的MART-126-35（MART-1: melanoma antigen recognized by T cells 1，T細(xì)胞識(shí)別黑色素瘤抗原1）和gp100209-217（gp100: glycoprotein 100，糖蛋白100）的細(xì)胞回輸治療后，35名轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者中18人（51%）出現(xiàn)客觀臨床治療反應(yīng)[3]。然而這種多輪富集篩選得到的腫瘤特異性淋巴細(xì)胞通常數(shù)量較少且屬于雞尾酒療法，所含細(xì)胞的背景信息了解不透徹。2006年，該研究團(tuán)隊(duì)利用基因工程改造T細(xì)胞使之具有專一靶向HLA-A*02:01限制性MART-1抗原的TCR，對(duì)17名黑色素瘤患者的回輸治療中有2人出現(xiàn)了完全的疾病消退[4]。

TCR-T作為當(dāng)前免疫治療的研究熱點(diǎn)，臨床研究的試驗(yàn)數(shù)量逐年增加。根據(jù)美國 ClinicalTrials.gov 網(wǎng)站的數(shù)據(jù)（截至2021年3月31日），筆者總結(jié)了臨床研究中登記收錄的靶向腫瘤抗原類型（見圖2A），可主要分為三大類：腫瘤相關(guān)抗原（tumor associated antigen，TAA），TSA和 病 毒編碼的抗原（oncoviral antigen）。其中，紐約食管鱗狀細(xì)胞癌-1（New York esophageal squamous cell carcinoma-1，NY-ESO-1）、黑色素瘤抗原基因（the melanoma antigen gene，MAGE）家 族 和EB病 毒（Epstein Barr virus，EBV）是這三大類抗原中的熱點(diǎn)靶標(biāo)。從圖2B中可以看出，TCR-T在實(shí)體瘤領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景，黑色素瘤、頭頸部腫瘤、非小細(xì)胞肺癌和肝癌等實(shí)體瘤中已有多項(xiàng)臨床研究開展。由于TCR識(shí)別抗原受MHC限制性的影響，HLA-A*02:01，HLA-A*02:06，HLA-A*02:05和HLA-A*11:01是目前開展研究最多的前4種HLA類型。雖然目前的研究集中在HLA-I類分子，但針對(duì)HLA-DP*04:01這一HLA-II類分子也有3項(xiàng)研究在開展，表明CD4+T細(xì)胞在該領(lǐng)域也極富潛力（見圖2C）。以下將按照腫瘤抗原類型詳述近年部分具有代表意義的TCR-T臨床研究，了解改造TCR-T以增強(qiáng)其抗腫瘤效果的新策略。

圖2 近年開展的T細(xì)胞受體工程化T細(xì)胞治療臨床試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)Figure 2 Recent clinical trials of T cell receptor-engineered T cells therapy

1.1 靶向腫瘤相關(guān)抗原

TAA是一類在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，但在正常組織（如生殖細(xì)胞）中受限表達(dá)的抗原，其最具代表性的一類抗原家族是癌睪抗原（cancer-testis antigen，CTA），CTA在缺乏MHC-I的睪丸等生殖系統(tǒng)組織中表達(dá)，并在多種上皮來源的腫瘤中高表達(dá)，如黑色素瘤、肺癌、膀胱癌等，目前已被認(rèn)為可誘發(fā)自發(fā)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)[5]。NYESO-1是該家族中最具免疫原性的成員，目前開展的臨床研究也最為豐富。由于NY-ESO-1與L抗原1（L-antigen 1，LAGE-1）有高達(dá)94%的同源性，2015年的一項(xiàng)Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)通過慢病毒介導(dǎo)靶向NY-ESO-1/LAGE-1來源的SLLMWITQC 抗原肽（HLA-A*02:01限制性）的NY-ESOc259TCR 在CD3+T 細(xì)胞表達(dá)，回輸治療多發(fā)性骨髓瘤，結(jié)果顯示80%的病人出現(xiàn)了令人鼓舞的疾病緩解（16/20）[6]。近期，有研究在對(duì)2例晚期難治性骨髓瘤和1例轉(zhuǎn)移性肉瘤的治療中，結(jié)合成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白9（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR associated protein 9，CRISPR-Cas9）敲除內(nèi)源性TCR和程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PD-1），可避免TCR錯(cuò)配產(chǎn)生靶向分子不確定的TCR，使回輸?shù)襟w內(nèi)靶向NY-ESO-1的工程化T細(xì)胞存在時(shí)間延長到9個(gè)月以上，并在病人體內(nèi)觀察到腫瘤部位靶抗原的減少[7]。有研究利用HLA-A*02轉(zhuǎn)基因小鼠識(shí)別出靶向肝癌生物標(biāo)志物甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）的TCR序列，并在小鼠模型中顯示出強(qiáng)大的腫瘤清除效果，之后進(jìn)行的一系列體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步篩選出親和力更強(qiáng)且不存在交叉反應(yīng)的TCR序列，目前基于以上研究的臨床試驗(yàn)（NCT03971747）正在上海中山醫(yī)院開展[8-9]（見表1）。

1.2 靶向腫瘤特異性抗原

腫瘤細(xì)胞基因編碼區(qū)通常存在許多突變會(huì)產(chǎn)生變異蛋白，若變異的蛋白可被MHC遞呈激活免疫細(xì)胞殺傷功能，這一被遞呈的肽段便是富有治療潛能的TSA。由于這類抗原在正常組織中不表達(dá)，其特異性T細(xì)胞可以逃避胸腺中的陰性選擇因而儲(chǔ)備豐富，但此類抗原常存在極高的個(gè)體特異性。目前的研究主要集中在靶向致癌基因和腫瘤抑制基因突變，即所謂的“熱點(diǎn)”突變。如靶向KRASG12D和KRASG12V突變抗原的TCR逐漸被挖掘并改造以提升親和力[10-11]，在對(duì)6例轉(zhuǎn)移性癌癥患者的外周記憶T細(xì)胞進(jìn)行高度敏感的體外刺激和細(xì)胞富集后，科研人員在3例患者中鑒定出靶向突變KRASG12D和KRASG12V變異的CD4+和CD8+記憶T細(xì)胞；在另外2例轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者中，則檢測到針對(duì)突變SMAD5和MUC4蛋白的CD8+腫瘤抗原特異性細(xì)胞[12]。在針對(duì)1例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的治療中，回輸4種不同的靶向HLA-C*08:02限制性KRASG12D抗原的T細(xì)胞觀察到了肺轉(zhuǎn)移病灶的腫瘤消退，然而在9個(gè)月后1個(gè)轉(zhuǎn)移病灶中的HLA-C*08:02分子表達(dá)缺失促使了腫瘤免疫逃逸[13]。據(jù)美國ClinicalTrials.gov網(wǎng)站登記顯示，上海長海醫(yī)院自2019年開啟了一項(xiàng)針對(duì)攜帶KRASG12V晚期胰腺癌患者的HLA-A*11:01限制性的TCR-T回輸治療臨床試驗(yàn)（NCT04146298，見表1）。

除了單核苷酸變異外，近年發(fā)現(xiàn)移碼突變、剪接變異、基因融合和內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄基因也會(huì)產(chǎn)生值得靶向的腫瘤特異性抗原[14]。一些個(gè)性化的多靶點(diǎn)治療也在開展，在一項(xiàng)關(guān)于化療難治性轉(zhuǎn)移性乳腺癌的研究中，利用測序確定腫瘤中的突變蛋白，聯(lián)合使用針對(duì)由SLC3A2，KIAA0368，CADPS2和CTSB這4種蛋白的非同義突變形成的新表位的TILs和白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）治療，并進(jìn)行短暫的免疫檢查點(diǎn)治療，實(shí)現(xiàn)了超過22個(gè)月的腫瘤完全消退。由于不是每個(gè)突變表位都能被MCH遞呈并激活T細(xì)胞反應(yīng)，所以如何確定腫瘤抗原和配對(duì)的TCR是一大難點(diǎn)，后文將對(duì)目前已有的策略展開探討。

1.3 靶向病毒編碼的抗原

據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)約13%的癌癥發(fā)生與感染相關(guān)，其中中國占發(fā)生數(shù)的1/3[15]。一些病毒可長期潛伏在細(xì)胞中，甚至將自身遺傳物質(zhì)整合到宿主細(xì)胞的基因中從而誘發(fā)細(xì)胞癌變，同時(shí)也會(huì)使病毒特異性的蛋白在腫瘤細(xì)胞中組成性表達(dá)。這類蛋白表達(dá)特異，通常免疫原性強(qiáng)，可作為理想的TCR-T靶向抗原，科研人員正在開展相關(guān)臨床研究。例如，人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）相關(guān)惡性腫瘤，包括子宮頸、口咽、肛門、外陰、陰道和陰莖部位的腫瘤，發(fā)生轉(zhuǎn)移后通常對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療耐藥，難以治愈。HPV陽性的腫瘤細(xì)胞組成性表達(dá)促癌的HPV E7抗原，該抗原在胞內(nèi)表達(dá)從而難以使用抗體或CAR-T進(jìn)行靶向，實(shí)驗(yàn)人員通過HLA-A*02:01-E711-19四聚體篩選出1個(gè)能限制小鼠HPV-16相關(guān)腫瘤生長的高親和力TCR[16]。近期開展的一項(xiàng)臨床研究，使用靶向HPV-16 E7的TCR-T治療轉(zhuǎn)移性HPV相關(guān)的上皮癌，結(jié)果12例患者中有6例出現(xiàn)了腫瘤消退[17]。同時(shí)，使用靶向HPV-16 E6的TCR的自體基因工程T細(xì)胞的Ⅰ/Ⅱ期單中心臨床試驗(yàn)也已開展，結(jié)果顯示12例接受治療的患者大部分都出現(xiàn)了不同程度的腫瘤消退[18]。EBV則與多種淋巴瘤、鼻咽癌和胃癌的發(fā)展有關(guān)，靶向EBV編碼蛋白LMP2和BMLF1等的研究也在開展中，研究人員使用肽段-MHC四聚體篩選出首個(gè)功能性的HLA-A*01:01限制性的EBV-LMP2特異性的TCR，拓展了這一領(lǐng)域的應(yīng)用范圍[19]，而一類針對(duì)HLA-A*11:01限制性的EBV-LMP2特異性的TCR已被證明可在小鼠中抑制人鼻咽癌腫瘤細(xì)胞的生長[20]。據(jù)美國ClinicalTrials.gov網(wǎng)站登記顯示，目前國內(nèi)有3家醫(yī)院正在開展針對(duì)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性鼻咽癌患者或頭頸部腫瘤患者的靶向EBV編碼抗原的TCR-T治療的臨床試驗(yàn)（見表1）。

表1 國內(nèi)正在開展的T細(xì)胞受體工程化T細(xì)胞治療臨床試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)△Table 1 Ongoing clinical trials of T cell receptor-engineered T cells therapy in China

2 腫瘤抗原和腫瘤抗原特異性T細(xì)胞受體的 篩選策略

雖然目前開展了一系列的TCR-T臨床治療研究，但其靶向的抗原類型和針對(duì)的癌癥類型仍有很大局限性，所以篩選富有治療潛力的腫瘤抗原是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。隨著癌癥突變、HLA基因型和免疫治療反應(yīng)相關(guān)臨床數(shù)據(jù)集的擴(kuò)增，以及生物信息算法提升和合成生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的努力付諸于識(shí)別腫瘤特異性抗原及其配對(duì)的TCR（見圖3）。

圖3 針對(duì)腫瘤抗原和腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞受體的篩選策略Figure 3 Screening strategies for tumor antigens and tumor-reactive T cell receptors

2.1 針對(duì)潛在腫瘤抗原的機(jī)器學(xué)習(xí)算法預(yù)測

識(shí)別和選擇病人特異的潛在腫瘤抗原是開展治療的關(guān)鍵。目前的流程大致是：比較腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的測序數(shù)據(jù)（DNA或RNA序列）鑒定出非同義變異；之后使用機(jī)器學(xué)習(xí)模型預(yù)測非同義突變中潛在的腫瘤抗原，這樣有助于降低篩選成本并提高篩選效率。預(yù)測模型的搭建依賴于對(duì)肽-MHC結(jié)構(gòu)建模進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬或利用已知的MHC結(jié)合序列分析氨基酸偏好序列[21]。當(dāng)前使用的大部分模型聚焦于預(yù)測肽-MHC（特別是MHC-I）的結(jié)合親和力，如NetMHCpan 4.0利用質(zhì)譜洗脫數(shù)據(jù)和親和力數(shù)據(jù)訓(xùn)練出神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，可預(yù)測親和力和MHC特異性肽長度的結(jié)合偏好[22]。由于腫瘤抗原預(yù)測的重要性，也存在專門運(yùn)用腫瘤病人數(shù)據(jù)聚焦于腫瘤抗原預(yù)測的算法，如EDGE是利用涉及8種腫瘤類型的74名患者的質(zhì)譜和測序數(shù)據(jù)深度學(xué)習(xí)后構(gòu)建的，在抗PD-1治療后轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌患者的樣本中均能使用EDGE預(yù)測到至少1個(gè)T細(xì)胞反應(yīng)性肽段[23]。雖然與MHC的高親和力是肽呈現(xiàn)的最重要的選擇要求，但抗原遞呈的過程還包括蛋白質(zhì)合成、蛋白酶體降解、HLA結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)等，其中許多細(xì)節(jié)的研究尚不清楚。MHCflurry 2.0利用目前積累的質(zhì)譜識(shí)別的MHC-I配體數(shù)據(jù)，綜合MHC等位基因依賴效應(yīng)和非等位基因依賴效應(yīng)，訓(xùn)練了2個(gè)模型并通過邏輯回歸將二者整合得到遞呈分?jǐn)?shù)，雖然與先前的模型相比，MHCflurry2.0的陽性預(yù)測值（positive predictive value）增加40%以上[24]；但難以模擬抗原遞呈的全過程，常會(huì)輸出相對(duì)較高的假陽性結(jié)果，且預(yù)測得分與真實(shí)的抗原遞呈間會(huì)存在顯著偏差。此外，與CD4+T細(xì)胞相關(guān)的MHC-II結(jié)合表位也逐漸受到關(guān)注，專門用于預(yù)測MHC-II抗原表位的MARIA[25]和NetMHCIIpan4.0[22]陸續(xù)被開發(fā)。但由于MHC-II的肽結(jié)合溝相對(duì)較淺且兩側(cè)是開放的，所以其結(jié)合肽的長度變化較大（9 ～ 22殘基），因而針對(duì)MHC-II的肽結(jié)合預(yù)測更為困難。盡管如此，相信隨著MHC-抗原肽數(shù)據(jù)的積累、抗原遞呈復(fù)合物結(jié)構(gòu)的識(shí)別和算法的優(yōu)化，HLA結(jié)合抗原預(yù)測的準(zhǔn)確性有望得到提升。

TCR識(shí)別抗原的預(yù)測主要基于保守基序進(jìn)行判斷，逐漸出現(xiàn)一些基于深度學(xué)習(xí)的模型如ERGO[26]。同一TCR可以識(shí)別不同肽段，而不同的TCR也可以識(shí)別相同肽段，基于后者利用聚類來尋找識(shí)別共享抗原的TCR也取得了一些進(jìn)展，如基于深度學(xué)習(xí)構(gòu)建的DeepTCR可以分析單細(xì)胞數(shù)據(jù)，揭示TCR抗原性的決定序列[27]。近期，GLIPH2幫助在178例非小細(xì)胞肺癌患者中實(shí)現(xiàn)了對(duì)435個(gè)腫瘤富集的抗原表位特異的TCR分組，并結(jié)合酵母展示系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)了“S%DGMNTE CDR3β”基序，該基序可識(shí)別上皮蛋白TMEM161A產(chǎn)生的病毒和非突變抗原交叉表位[28]。研究表明TCR庫中可能存在1011～ 1012個(gè)獨(dú)特的TCR，這是強(qiáng)大的腫瘤殺傷武器庫，但這也增大了篩選腫瘤抗原反應(yīng)的TCR的挑戰(zhàn)性[29]。在未來，TCR特異性的表位預(yù)測將是腫瘤抗原表位預(yù)測的主要方向。

2.2 針對(duì)腫瘤抗原的篩選策略

將TILs與抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）共培養(yǎng)是檢測抗原反應(yīng)原性最直接的手段。在早期，抗原遞呈是通過將潛在抗原的完整蛋白質(zhì)編碼基因?qū)氡磉_(dá)特定HLA亞型的APC來完成的[30]，該方法可模擬天然的抗原遞呈過程，但對(duì)于大規(guī)模篩選則顯得笨拙且耗時(shí)。之后，潛在抗原肽以串聯(lián)迷你基因（tandem minigene，TMG）或長肽的方式被導(dǎo)入細(xì)胞，可讓1個(gè)細(xì)胞同時(shí)遞呈多種候選抗原分子從而極大提升了篩選效率[31]。TMG攜帶多個(gè)迷你基因，每個(gè)迷你基因存在1個(gè)突變核苷酸，可編碼1個(gè)新的抗原表位；長肽則是多個(gè)潛在抗原肽的串聯(lián)，每個(gè)抗原肽中存在1個(gè)突變氨基酸。這2種方式目前已成功應(yīng)用于胃腸道癌癥、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和上皮性癌癥的臨床試驗(yàn)[32-33]。

然而，上述2種方式還存在許多不足之處，首先是跳過了抗原肽的天然加工過程，其次TMG中迷你基因可能受限于翻譯后的三維結(jié)構(gòu)，難以實(shí)現(xiàn)均等的蛋白表達(dá)水平，而長肽引發(fā)的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)較弱，需經(jīng)過多輪篩選才能確定反應(yīng)性腫瘤抗原。2019年報(bào)道的T-scan系統(tǒng)將一個(gè)被顆粒酶B（granzyme B，GzB）酶切位點(diǎn)影響完整性的紅外熒光蛋白轉(zhuǎn)到APC中作為報(bào)告分子，共培養(yǎng)時(shí)，反應(yīng)性T細(xì)胞會(huì)分泌GzB到APC中釋放熒光信號(hào)，可通過流式細(xì)胞術(shù)分選出被識(shí)別的APC并測序確定抗原序列[34]。另一團(tuán)隊(duì)則利用被稱為胞啃的膜轉(zhuǎn)移現(xiàn)象作為信號(hào)，T細(xì)胞會(huì)將被N-氨基喹啉-生物素標(biāo)記的膜蛋白轉(zhuǎn)移到遞呈配對(duì)抗原的APC上，之后可以通過流式細(xì)胞術(shù)分選出被識(shí)別的APC并測序確定抗原序列[35]。此外，還有系統(tǒng)在APC中構(gòu)建信號(hào)和抗原遞呈雙功能受體（signaling and antigen-presenting bifunctional receptors，SABRs），該受體胞外段為MHC-抗原肽可遞呈抗原，在與反應(yīng)性TCR作用后，其胞內(nèi)段可產(chǎn)生1個(gè)TCR樣信號(hào)誘導(dǎo)NFAT啟動(dòng)子調(diào)控的熒光蛋白表達(dá)用于篩選[36]。類似的方法也在MHC-II的篩選中得以實(shí)現(xiàn)，研究人員將小鼠MHCII與TCRαβ的胞內(nèi)段相融合得到pMHC(peptide and major histocompatibility complex)-TCR(MCR)，并用此篩選出gp61的潛在抗原和反應(yīng)性TCR序列[37]。

2.3 針對(duì)腫瘤抗原反應(yīng)性T細(xì)胞受體的篩選策略

針對(duì)新抗原特異性TCR的篩選中，peptide-MHC四聚體（pMHC tetramers）最為廣泛應(yīng)用，四聚體上偶聯(lián)的熒光素使得與之結(jié)合的T細(xì)胞可以通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行篩選，目前這項(xiàng)技術(shù)已在多發(fā)性骨髓瘤和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中得以應(yīng)用[38-39]。研究人員進(jìn)一步開發(fā)同位素標(biāo)記四聚體，使用質(zhì)譜流式實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)人類樣本中多達(dá)109種pMHC特異性和20 ～ 30種額外的表面和胞內(nèi)標(biāo)記物的同時(shí)鑒定[40]。四聚體能同時(shí)識(shí)別多種抗原特異性T細(xì)胞，但其合成較復(fù)雜且MHC的型別有限，一些研究團(tuán)隊(duì)嘗試?yán)米贤廨椪帐顾木垠w中HLA上的配體斷裂以轉(zhuǎn)載新的配體，以期實(shí)現(xiàn)四聚體的重復(fù)利用[41]；同時(shí)，DNA條形碼、多分子熒光被用來標(biāo)記四聚體以增加一次篩選的抗原種類[42-43]。納米磁性顆粒也被用于標(biāo)記四聚體，以期能更敏感地從病人腫瘤或血液中分離罕見的腫瘤抗原反應(yīng)性T細(xì)胞[42]。此外，基于MHC的酵母展示系統(tǒng)也已被開發(fā)用來擴(kuò)展抗原表位的識(shí)別數(shù)目[44]；類似地，有研究將pMHC復(fù)合物融合到桿狀病毒蛋白gp64的跨膜和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，從而錨定在昆蟲細(xì)胞Sf9細(xì)胞膜上進(jìn)行展示[45]，但這2個(gè)展示系統(tǒng)只能用于篩選可溶性的TCR。以上篩選策略的主要缺陷是不能確定T細(xì)胞是被抗原激活還是僅僅與抗原結(jié)合。

基于群體水平上檢測細(xì)胞因子（如γ-干擾素）分泌和細(xì)胞毒性活性被廣泛用于分析T細(xì)胞是否被激活，但它們更適合檢測T細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的群體反應(yīng)程度，缺乏單細(xì)胞維度的敏感性。細(xì)胞表面標(biāo)記物能幫助識(shí)別激活的T細(xì)胞，目前4-1BB被認(rèn)為是極具潛力的標(biāo)記物，但結(jié)合使用2或3種表面標(biāo)記物可能更能可靠地識(shí)別T細(xì)胞的激活[46]。一些專門設(shè)計(jì)的感受器也被用于檢測TCR激活后下游信號(hào)通路的改變，如使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針檢測蛋白質(zhì)酪氨酸激酶ZAP-70活性的變化、鈣離子探針檢測胞內(nèi)鈣離子的改變和將NFAT-啟動(dòng)子調(diào)控的熒光信號(hào)與組蛋白H2B結(jié)合檢測T細(xì)胞活化[47-49]。但這些篩選信號(hào)不僅僅受TCR信號(hào)的調(diào)控，篩選特異性值得商榷。近期，F(xiàn)ucoID利用化學(xué)酶法使APC表面錨定上巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，當(dāng)APC與配對(duì)的TCR相互作用時(shí)可以將底物GDP-Fuc-Biotin上的生物素轉(zhuǎn)移到T細(xì)胞上，實(shí)現(xiàn)對(duì)配對(duì)T細(xì)胞的標(biāo)記[50]。此外，基于微流控的篩選系統(tǒng)也被建立，科研人員在攜帶NFAT/AP-1調(diào)控的eGFP的Jurkat 細(xì)胞中表達(dá)候選TCR，利用微流控系統(tǒng)將單個(gè)TCR-T與靶細(xì)胞包裹起來形成小區(qū)室，當(dāng)TCR-T與表達(dá)配對(duì)抗原的靶細(xì)胞相互作用時(shí)可以通過顯微鏡觀察熒光變化[51]。這些基于不同原理的策略為篩選腫瘤抗原反應(yīng)性T細(xì)胞提供了富有創(chuàng)造性的新思路。

3 總結(jié)與展望

TCR-T治療因其具有良好的特異性、顯著的抗腫瘤活性和相對(duì)較輕的副作用而受到越來越多的關(guān)注，在早期的多項(xiàng)臨床試驗(yàn)中已證明了回輸抗原特異性TCR-T能帶來顯著的臨床療效，但其發(fā)展還處于起始階段，仍有許多問題亟待解決。本文對(duì)近年TCR-T治療的臨床試驗(yàn)進(jìn)行了綜述，并對(duì)當(dāng)前蓬勃發(fā)展的腫瘤抗原和配對(duì)TCR的篩選策略進(jìn)行總結(jié)，但文中只初步觸及TCR-T治療的臨床準(zhǔn)備工作。目前的臨床應(yīng)用也反映出對(duì)于TCR-T毒性的臨床前評(píng)估還缺乏有力的工具和策略，如MAGE家族是目前研究熱點(diǎn)的靶向抗原，但在一項(xiàng)針對(duì)MAGE-A3的TCR-T臨床試驗(yàn)中，9例患者中有2例在輸注后因出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)副作用而死亡，深入分析揭示該TCR同時(shí)靶向MAGE-A12，而后者在腦中存在表達(dá)，這是在之前未被認(rèn)知的[52]。同時(shí)TCR-T在體內(nèi)治療的過程中如何克服腫瘤免疫抑制微環(huán)境及脫靶毒性的影響也是未來發(fā)展的難點(diǎn)。

T細(xì)胞抗原的識(shí)別與B細(xì)胞相比更為困難，發(fā)展較為緩慢，主要面臨以下幾個(gè)難點(diǎn)：1）抗原以短肽的形式與MHC非共價(jià)連接；2）TCR與抗原的親和力相對(duì)較低；3）難以判斷抗原結(jié)合是否激活T細(xì)胞信號(hào)[34]。早先識(shí)別腫瘤特異性抗原的方法依賴于珍稀的臨床標(biāo)本，直接對(duì)龐大的多肽庫進(jìn)行篩選，限制了腫瘤特異性抗原的發(fā)現(xiàn)。但令人欣喜的是，許多跨學(xué)科的篩選策略逐漸得到發(fā)展，涉及計(jì)算機(jī)算法設(shè)計(jì)、合成生物學(xué)及工程系統(tǒng)也被成功搭建，雖然目前還缺乏在臨床水平的試驗(yàn)驗(yàn)證，但相信在未來這些篩選策略將有助于拓展TCR-T的應(yīng)用范圍。當(dāng)前，腫瘤抗原的鑒定主要依靠基因組規(guī)模的方法，如全外顯子組測序。而多元組學(xué)和深度學(xué)習(xí)的發(fā)展將助力更多潛在的腫瘤抗原的發(fā)掘，目前也看到了更多關(guān)于全球合作的倡議，如腫瘤新抗原選擇聯(lián)盟（Tumor Neoantigen Selection Alliance，TESLA）比較不同團(tuán)隊(duì)對(duì)新抗原的預(yù)測方法，發(fā)現(xiàn)單個(gè)預(yù)測管道的預(yù)測性能普遍欠佳，總結(jié)提出強(qiáng)結(jié)合親和力、高腫瘤豐度、高結(jié)合穩(wěn)定性和肽識(shí)別是與肽免疫原性相關(guān)的關(guān)鍵遞呈相關(guān)參數(shù)，這些關(guān)鍵參數(shù)將有助于改善腫瘤抗原的預(yù)測準(zhǔn)確性[53]。同時(shí)，還需要考慮下游臨床應(yīng)用對(duì)預(yù)測腫瘤抗原的假陰性和假陽性的耐受性，及無關(guān)的新抗原表位是否會(huì)干擾真正的腫瘤抗原靶點(diǎn)從而對(duì)臨床療效產(chǎn)生負(fù)面影響[54]。

在未來，腫瘤抗原反應(yīng)性TCR的發(fā)展有著廣闊的空間以待挖掘。腫瘤抗原的概念可以擴(kuò)展到錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)、核酸、外泌體等形式，這為篩選提供了豐富的靶標(biāo)。同時(shí)，近年來也有研究將TCR與CAR-T療法相結(jié)合，將識(shí)別pMHC的TCR可變域（TCRv）與嵌合抗原受體（chimeric antigen receptors，CARs）的胞內(nèi)域相連，使CAR-T的靶向抗原不僅局限于細(xì)胞表面蛋白，也使得TCR的靶向功能可以被用于其他免疫細(xì)胞[55]。因此，盡管TCR-T治療的發(fā)展道路上還存在著許多障礙，但TCR-T療法有望在未來成為治療癌癥的有力武器。