原達(dá) 朱國(guó)斌

(1.山西醫(yī)科大學(xué)研究生院，山西 太原 030001； 2.山西醫(yī)科大學(xué)附屬第二臨床醫(yī)學(xué)院心內(nèi)科，山西 太原 030001)

大量研究證實(shí)，炎癥反應(yīng)與動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的發(fā)生、發(fā)展及其并發(fā)癥密切相關(guān)。血小板具有血栓形成和免疫調(diào)節(jié)的雙重作用，其活化后通過(guò)表面膜受體的表達(dá)及脫顆粒作用，釋放多種活性物質(zhì)，廣泛參與AS的形成和易破裂斑塊的發(fā)展[1-2]。血小板活化后釋放趨化因子CCL5、單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1，又名CCL2)和血小板因子4刺激白細(xì)胞募集，同時(shí)分泌炎癥介質(zhì)如可溶性CD40配體(sCD40L)、5-羥色胺、白介素(IL)-1β激活內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)和白細(xì)胞，另一方面活化后的血小板膜表面表達(dá)P選擇素(P-selectin，P-sel)、糖蛋白(GPⅠbα、GPⅥ和GPⅡb/Ⅲa)、Tool樣受體2/4以及共刺激分子CD40L，介導(dǎo)血小板-白細(xì)胞和血小板-ECs的相互作用，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。血小板膜表面P-sel、CD40L分別與白細(xì)胞上的P選擇素糖蛋白配體1(PSGL-1)、CD40結(jié)合后形成血小板-白細(xì)胞聚集體(platelet-leukocyte aggregates，PLA)，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，活化ECs，促進(jìn)白細(xì)胞招募、活化，加速AS的形成[3-4]?，F(xiàn)對(duì)血小板P-sel和CD40/CD40L在AS中的炎癥作用進(jìn)一步描述與概括。

1 血小板P-sel

P-sel，又稱CD62P，是SELP基因編碼的，表達(dá)于活化血小板及ECs表面的跨膜糖蛋白，屬于黏附分子選擇素超家族成員。靜息情況下，P-sel主要儲(chǔ)存在血小板α顆粒和ECs的Weibel-Palade小體(Weibel-Palade body，WPB)中，細(xì)胞膜表面不表達(dá)或低表達(dá)，炎癥損傷或激動(dòng)劑作用下血小板活化脫顆粒僅數(shù)分鐘便可高表達(dá)于膜表面或以可溶性P選擇素(soluble P-selectin，sP-sel)脫落[4]。

1.1 P-sel與AS

在AS及炎癥中，ECs表面P-sel與白細(xì)胞PSGL-1結(jié)合在白細(xì)胞的初始黏附中發(fā)揮直接作用，而血小板P-sel介導(dǎo)PLA形成，可加速白細(xì)胞在受損或炎癥ECs上血小板沉積部位的初始黏附[4]，另外PLA小體可誘導(dǎo)ECs中WPB的釋放，導(dǎo)致ECs上P-sel增多。研究發(fā)現(xiàn)相比于ECs的P-sel，血小板P-sel在AS的發(fā)展和加速中發(fā)揮更為重要的作用。Burger等[5]對(duì)6周大小的載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)Selp-/-和ApoE-/-Selp+/+小鼠骨髓行致死劑量輻射后移植重組獲得四組基因型動(dòng)物，36周后觀察發(fā)現(xiàn)ECs表達(dá)P-sel的小鼠有較大的病變，ECs及血小板同時(shí)表達(dá)P-sel的小鼠比只有ECs表達(dá)P-sel的小鼠病變大30%，且鈣化率更高。Zhang等[6]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)人SELP基因的ApoE-/-小鼠(ApoE-/-Selp-/-TgSELP-/+)的主動(dòng)脈斑塊病變比基因敲除鼠Selp的ApoE-/-小鼠(ApoE-/-Selp-/-)更大，骨髓重組并在西式飲食15周后發(fā)現(xiàn)，ECs和血小板同時(shí)表達(dá)P-sel小鼠的主動(dòng)脈斑塊明顯大于其他三組，其他三組則表現(xiàn)為斑塊大小相等。此外，相較ECs的P-sel，血小板P-sel在動(dòng)脈損傷后新內(nèi)膜的形成中發(fā)揮主要作用，針對(duì)白細(xì)胞-血小板的治療策略可有效抑制再狹窄。

1.2 血小板P-sel與AS

在AS中，血小板P-sel與白細(xì)胞PSGL-1結(jié)合形成PLA小體，一方面激活白細(xì)胞、ECs，上調(diào)細(xì)胞表面黏附分子表達(dá)，加強(qiáng)白細(xì)胞滾動(dòng)，另一方面釋放趨化因子、細(xì)胞因子等產(chǎn)物，誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化至血管壁炎癥部位，并分化為巨噬細(xì)胞，促進(jìn)AS形成[7]。Huo等[8]的研究首次闡明血小板P-sel在AS形成中的直接作用，向ApoE-/-小鼠多次注射表達(dá)P-sel的血小板，觀察到PLA形成的同時(shí)血小板源性趨化因子CCL5、CXCL4向白細(xì)胞、ECs表面?zhèn)鬟f，同時(shí)有更多的白細(xì)胞與血管細(xì)胞黏附分子-1結(jié)合，這表明活化血小板通過(guò)表達(dá)P-sel介導(dǎo)形成PLA的同時(shí)向單核細(xì)胞/白細(xì)胞和血管壁傳遞血小板源性趨化因子及促炎因子，參與AS的形成。另外，PLA中血小板亦可傳遞血小板源髓樣相關(guān)蛋白-14(MRP-14)至單核細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)外周AS疾病患者血小板MRP-14及其mRNA顯著增多，且與PLA呈正相關(guān)，并于電鏡下觀測(cè)到PLA小體的單核細(xì)胞中有免疫熒光標(biāo)記的血小板源MRP-14，靶向抑制血小板MRP-14可下調(diào)單核細(xì)胞腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、IL-1β和CCL2的表達(dá)；進(jìn)一步用重組MRP-14刺激血小板后發(fā)現(xiàn)MRP-14可劑量依賴性地增加血小板P-sel的表達(dá)[9]?？梢?jiàn)，血小板MRP-14可通過(guò)增加P-sel的表達(dá)導(dǎo)致單核細(xì)胞-血小板聚集物的形成，同時(shí)靶向血小板MRP-14可為AS的抗炎治療提供新思路。

在血栓形成中，血小板P-sel主要介導(dǎo)血小板在ECs表面的初始“滾動(dòng)”，GPⅠb、GPⅡb/Ⅲa主要在血小板的穩(wěn)定黏附中起作用[4]，但P-sel對(duì)GPⅡb/Ⅲa-纖維蛋白原的結(jié)合有穩(wěn)固作用，有利于形成更大的血小板聚集體[10]。使用P-sel單抗可抑制剪切力誘導(dǎo)的血小板聚集，并對(duì)GPⅡb/Ⅲa單抗的抑制有疊加作用。此外，血小板P-sel與白細(xì)胞結(jié)合后亦可發(fā)揮促凝作用，可誘導(dǎo)白細(xì)胞釋放組織因子、白細(xì)胞微粒及炎癥因子激活凝血途徑，促進(jìn)纖維蛋白原沉積和血栓形成[11]。

此外，中性粒細(xì)胞胞外陷阱(neutrophil extracellular trap，NET)在AS和血栓形成中發(fā)揮重要作用，阻斷P-sel與PSGL-1相互作用可抑制由凝血酶激活的血小板與中性粒細(xì)胞結(jié)合引起的NETosis(NET的形成過(guò)程)，這一途徑可能是治療NET相關(guān)AS疾病的潛在治療靶點(diǎn)[12-13]。

2 血小板CD40/CD40L

CD40L及其受體CD40屬于TNF和TNF受體家族的一對(duì)共刺激分子，在免疫調(diào)節(jié)和炎性反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。CD40L是一種Ⅱ型包膜糖蛋白，主要表達(dá)于活化的CD4+T細(xì)胞，在血小板上也有表達(dá)，其在細(xì)胞外區(qū)域包含一個(gè)保守的TNF同源結(jié)構(gòu)域，可實(shí)現(xiàn)三聚化并和受體結(jié)合，CD40主要表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞及血管壁細(xì)胞表面，此外血小板表面亦有CD40表達(dá)。CD40L儲(chǔ)存在α顆粒中，血小板活化后迅速釋放到膜表面，被細(xì)胞外蛋白酶剪切下來(lái)形成sCD40L，循環(huán)中>95%的sCD40L來(lái)自血小板[14-15]。

2.1 CD40/CD40L與AS

在單核細(xì)胞中，CD40-TRAF6通路發(fā)揮促AS作用，而CD40-TRAF2/3/5通路主要維持正常免疫功能。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，基因敲除CD40或抗體抑制CD40L后，可在有AS傾向的低密度脂蛋白受體基因敲除(LDLR-/-)或ApoE-/-小鼠中形成炎癥程度較低的較小AS病變。CD40與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF)1/2/3/5/6結(jié)合后啟動(dòng)不同的調(diào)節(jié)因子和效應(yīng)因子，導(dǎo)致斑塊向有利表型轉(zhuǎn)化主要依賴于阻斷CD40-TRAF6通路，Lutgens等[16]發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞中缺乏CD40-TRAF6通路的ApoE-/-小鼠斑塊僅表現(xiàn)為少量的脂質(zhì)條紋及少量的白細(xì)胞浸潤(rùn)和基質(zhì)金屬蛋白酶2/9，外周白細(xì)胞特別是Ly6C+單核細(xì)胞的數(shù)量及黏附功能均下降，其中Ly6C+單核細(xì)胞屬于促炎效應(yīng)細(xì)胞，較易進(jìn)入動(dòng)脈壁并分化為巨噬細(xì)胞；少數(shù)浸潤(rùn)動(dòng)脈壁的單核細(xì)胞分化為產(chǎn)生IL-10的抗炎M2型巨噬細(xì)胞，且細(xì)胞內(nèi)僅含少量核因子κB抑制蛋白α(IκBα)。這表明阻斷CD40-TRAF6通路的抗AS作用與巨噬細(xì)胞分化為抗炎M2表型及抑制核因子κB(NF-κB)信號(hào)有關(guān)。目前認(rèn)為CD40-TRAF2/3/5通路是維持正常免疫所必需的，在AS中發(fā)揮平衡的作用[16-17]，而單獨(dú)的CD40-TRAF5通路具有抗AS作用(圖1A)[18]。另有學(xué)者認(rèn)為CD40L誘導(dǎo)的AS與CD40無(wú)關(guān)，主要通過(guò)與巨噬細(xì)胞分化抗原-1(Mac-1)作用引起[19]。抑制CD40L-Mac-1相互作用不僅抑制AS的炎癥反應(yīng)，同時(shí)可避免完全抑制CD40L后帶來(lái)的免疫抑制和血栓栓塞效應(yīng)[20]。

2.2 血小板CD40/CD40L與AS

在血小板中，CD40L和CD40均有促AS作用，另外sCD40L可與血小板上CD40、GPⅡb/Ⅲa和α5β1結(jié)合促血栓形成。給ApoE-/-小鼠注射缺乏CD40L或CD40的血小板，不僅斑塊明顯減小且斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、凋亡及斑塊內(nèi)出血顯著減少[21-22]。血小板CD40L通過(guò)誘導(dǎo)ECs分泌趨化因子IL-8、CCL2，并使其表達(dá)黏附分子E選擇素、血管細(xì)胞黏附分子-1和細(xì)胞間黏附分子1，增強(qiáng)白細(xì)胞、血小板對(duì)ECs的黏附力；另一方面，CD40L介導(dǎo)PLA的形成，加速白細(xì)胞活化并通過(guò)CCL2募集至血管壁，加速AS[21]。同樣，血小板CD40通過(guò)激活ECs表達(dá)血管細(xì)胞黏附分子-1、血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1、血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白及P-sel，促進(jìn)白細(xì)胞的黏附、活化及分泌IL-1β，加強(qiáng)血管壁炎癥反應(yīng)[22]。血小板CD40L及CD40在PLA的形成中均發(fā)揮重要作用。Lievens等[21]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)血小板缺乏CD40L或白細(xì)胞缺乏CD40時(shí)，PLA形成顯著減少，同時(shí)在膠原上血小板CD40L缺陷的血栓上P-sel暴露減少，并推測(cè)CD40/CD40L相互作用形成PLA可能是血小板P-sel依賴的。Gerdes等[22]的研究則證明血小板CD40也是通過(guò)間接影響血小板P-sel的表達(dá)介導(dǎo)PLA的形成，這與Jin等[23]的研究一致。此外血小板CD40L通過(guò)影響T細(xì)胞亞群分布干擾效應(yīng)T細(xì)胞/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞平衡來(lái)加速AS病變，用CD25耗盡注射缺乏CD40L血小板的ApoE-/-小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞后，則其抗AS作用消失[21]。

在AS中血小板CD40L依賴的血栓形成主要在膠原暴露的晚期發(fā)揮作用，缺乏CD40L的ApoE-/-小鼠血小板在膠原上的聚集明顯受損，而在血管性血友病因子的黏附與CD40L+/+ApoE-/-小鼠表現(xiàn)相似[21]。CD40L通過(guò)血小板CD40可引起α顆粒和致密顆粒釋放，導(dǎo)致P-sel、GPⅡb/Ⅲa表達(dá)增加以及典型的形態(tài)學(xué)改變。CD40L可通過(guò)CD40依賴的不同途徑激活血小板，一方面通過(guò)CD40/TRAF2/Rac1/p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路加劇血小板活化和聚集，突變形式的sCD40L和CD40-/-小鼠血小板無(wú)法引起這種反應(yīng)，另一方面sCD40L亦可觸發(fā)血小板中NF-κB的強(qiáng)烈激活，抑制IκBα可逆轉(zhuǎn)CD40L誘導(dǎo)的IκBα磷酸化，但不影響p38 MAPK磷酸化，同樣抑制p38 MAPK對(duì)IκBa磷酸化也無(wú)影響[24-25]。Kojok等[26]的研究結(jié)果則證明CD40L激活血小板NF-κB是CD40依賴性的，通過(guò)CD40L/CD40/TAK1/NF-κB信號(hào)啟動(dòng)血小板并增強(qiáng)血小板的聚集，阻斷血小板膜上的另外兩種可與CD40L結(jié)合的受體α5β1或GPⅡb/Ⅲa后，對(duì)IκBα的磷酸化并無(wú)影響。此外，在高剪切應(yīng)力下，CD40L可通過(guò)KGD整合素序列直接與血小板GPⅡb/Ⅲa結(jié)合，增強(qiáng)血小板的聚集和血栓的穩(wěn)定性[27]。Kuijpers等[28]通過(guò)體外刺激ApoE-/-小鼠血小板膠原受體GPⅥ后發(fā)現(xiàn)，與缺乏CD40的血小板相比，缺乏CD40L會(huì)引起GPⅡb/Ⅲa的激活和P-sel表達(dá)減少，進(jìn)一步用CD40L刺激血小板，在缺乏CD40L和CD40血小板中，均可引起PI3K-Akt信號(hào)通路中膠原誘導(dǎo)的Akt磷酸化增強(qiáng)以及更大的血小板聚集體形成，基因缺失或抑制PI3K-β可抑制這一增強(qiáng)現(xiàn)象，而靶向NF-κB酶抑制劑α(IKKα)阻斷非經(jīng)典NF-κB通路并未減弱CD40L增強(qiáng)血小板聚集的作用；盡管靶向IKKβ和IκBα阻斷經(jīng)典NF-κB通路表現(xiàn)出對(duì)血小板聚集的抑制作用，但該學(xué)者認(rèn)為添加抑制劑會(huì)影響血小板的Ca2+信號(hào)從而減弱血小板聚集。這表明CD40L在AS穩(wěn)定血栓的形成作用中，至少部分是依賴于GPⅡb/Ⅲa的激活而與CD40無(wú)關(guān)(圖1B)。此外CD40L可與血小板表面整合素α5β1結(jié)合導(dǎo)致血小板活化，促進(jìn)血栓形成[29]。CD40L可同時(shí)與CD40和α5β1結(jié)合形成CD40L-CD40-整合素復(fù)合物，在CD40/CD40L信號(hào)通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用，缺乏整合素結(jié)合位點(diǎn)的CD40L突變體可拮抗CD40/CD40L相互作用[30]。

圖1 A：CD40L在單核細(xì)胞中的促AS通路；

3 診斷與治療

3.1 sP-sel

sP-sel不僅是血小板活化及血栓的標(biāo)志物，也是炎癥的標(biāo)志物，大量的臨床研究表明sP-sel在AS及炎癥性疾病中處于高表達(dá)狀態(tài)。近期的一項(xiàng)單中心前瞻性隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)前sP-sel濃度是術(shù)后雙聯(lián)抗血小板治療(阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷)期間高殘余血小板反應(yīng)性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而PCI后血小板高反應(yīng)性患者有更高的心血管不良事件及支架內(nèi)血栓發(fā)生[31-32]。

3.2 sCD40L

sCD40L水平在冠心病危險(xiǎn)因素吸煙、高血壓、糖尿病、高膽固醇血癥、高同型半胱氨酸血癥、不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死的患者中均升高，同時(shí)也可用來(lái)預(yù)測(cè)急性冠狀動(dòng)脈綜合征的未來(lái)不良事件。此外，他汀類藥物、抗高血壓藥和抗血小板藥，已被認(rèn)為是sCD40L水平的潛在調(diào)節(jié)劑，對(duì)急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者的預(yù)后有積極影響[33]。早期的體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)sCD40L可降低ECs一氧化氮水平，導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性血管舒張功能障礙，近期Aslan等[34]在一項(xiàng)152例冠狀動(dòng)脈微血管疾病患者的研究中，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，患者血清sCD40L水平與超敏C反應(yīng)蛋白呈正相關(guān)，推測(cè)冠狀動(dòng)脈微血管疾病患者血清中較高的sCD40L濃度可能與炎癥激活有關(guān)。目前認(rèn)為冠狀動(dòng)脈微血管疾病是心肌缺血的三種經(jīng)典機(jī)制之一，也有學(xué)者認(rèn)為是AS累及冠狀小、微動(dòng)脈的一種早期病變。Gergei等[35]研究了sCD40L作為心血管全因死亡率標(biāo)志物的潛在作用，發(fā)現(xiàn)只在冠狀動(dòng)脈疾病患者和射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭的亞組分析中，才能顯示sCD40L水平與心血管短期死亡率之間的顯著相關(guān)性。

3.3 治療

最近的一項(xiàng)臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用P-sle單抗inclacumab可顯著降低非ST段抬高型心肌梗死患者PCI后的肌鈣蛋白I和肌酸激酶水平，且在PCI前3 h給藥可獲得最佳效果[36]，這為通過(guò)靶向P-sel來(lái)減少心肌損傷提供了強(qiáng)有力證據(jù)，但仍需大量臨床數(shù)據(jù)支持。CD40/CD40L相互作用在免疫調(diào)節(jié)和血栓穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用，單純地阻斷CD40L或CD40會(huì)導(dǎo)致血栓栓塞和免疫抑制事件發(fā)生，有學(xué)者將TRAF6抑制劑合并到重組高密度脂蛋白納米顆粒中靶向于單核/巨噬細(xì)胞可降低AS的發(fā)生，在ApoE-/-小鼠和靈長(zhǎng)類動(dòng)物中均未觀察到活性納米顆粒的毒性作用[17]。此外，血小板CD40在動(dòng)脈損傷后新生內(nèi)膜形成中起關(guān)鍵作用，可作為預(yù)防PCI后再狹窄的治療靶點(diǎn)[23]。

4 展望及總結(jié)

AS是一種炎性疾病，TNF-α驅(qū)動(dòng)的炎癥過(guò)程在其中發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)，在衰老相關(guān)炎癥中，TNF-α通過(guò)對(duì)巨核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄重編輯的調(diào)控和血小板線粒體功能的影響，促進(jìn)血小板反應(yīng)性增高和血栓形成，可見(jiàn)血小板在AS炎癥中的重要角色[37]。血小板是聯(lián)系炎癥、免疫和血栓三者間的橋梁，血小板P-sel和CD40/CD40L在AS形成及血栓形成中發(fā)揮重要作用，同時(shí)循環(huán)中sP-sel、sCD40L可作為AS的生物標(biāo)志物。目前的研究主要集中在ECs的P-sel和白細(xì)胞CD40/CD40L以及相關(guān)信號(hào)通路，且靶向治療也僅在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和小規(guī)模臨床試驗(yàn)中得到驗(yàn)證。對(duì)于血小板P-sel和CD40/CD40L及它們與白細(xì)胞、ECs之間的關(guān)系在AS疾病中的充分研究，不僅有益于降低炎癥和血栓殘余風(fēng)險(xiǎn)，同樣也可為預(yù)防抗炎治療所帶來(lái)的免疫抑制和血栓栓塞等并發(fā)癥提供幫助。