向家志, 蘇冒亮, 張俊彬, 2, *

皮質(zhì)醇及其衍生物(倍他米松)對青鳉性腺分化影響的探究

向家志1, 蘇冒亮2, 3, 張俊彬1, 2, *

1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心, 上海 201306 2. 深圳大學(xué)生命科學(xué)與海洋學(xué)院海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境科學(xué)深圳重點實驗室, 深圳 518060 3. 深圳大學(xué)光電工程學(xué)院光電子器件與系統(tǒng)教育部和廣東省重點實驗室, 深圳 518060

皮質(zhì)醇(Cortisol)是魚類主要的糖皮質(zhì)激素, 其含量的高低變化會對魚類性別分化與性激素合成產(chǎn)生關(guān)鍵影響。倍他米松(Betamethasone)是由人工合成的皮質(zhì)醇衍生物, 在多個國家和地區(qū)的自然水域中被頻繁檢測到, 對魚類的生殖造成了很大的危害。本研究以日本青鳉()為實驗對象, 將獲得的青鳉胚胎分別暴露于含20、200和2000 ng·L-1倍他米松或皮質(zhì)醇的孵化液中, 研究皮質(zhì)醇及其衍生物－倍他米松對青鳉仔魚階段性激素合成酶與性腺分化的關(guān)鍵節(jié)點基因表達的影響, 評估其對性腺分化與生殖內(nèi)分泌的影響。結(jié)果表明, 2000 ng·L-1皮質(zhì)醇暴露加速青鳉胚胎孵化, 孵化時間提前1天, 200與2000 ng·L-1暴露組倍他米松胚胎孵化時長延緩2天。在仔魚性腺分化階段, 皮質(zhì)醇與倍他米松處理都引起類固醇激素合成酶與性腺分化的關(guān)鍵節(jié)點基因表達的顯著變化。皮質(zhì)醇處理下仔魚的基因表達水平均出現(xiàn)顯著下降(<0.05), 對雌雄激素合成具有抑制效果, 且抑制效果與暴露濃度呈正相關(guān)。倍他米松處理下,基因表達水平顯著下降, 且基因表達水平顯著上升(<0.05), 該結(jié)果提示倍他米松處理對青鳉仔魚有潛在的雄性化。倍他米松與皮質(zhì)醇暴露下,基因表達水平均下降, 該結(jié)果表明兩種糖皮質(zhì)激素暴露會延緩仔魚性腺的分化過程。綜上所述, 皮質(zhì)醇與倍他米松的暴露均會干擾生殖內(nèi)分泌系統(tǒng), 并延緩仔魚的性腺分化, 其中倍他米松暴露可能會誘導(dǎo)仔魚的雄性化。

倍他米松; 皮質(zhì)醇; 青鳉; 性腺分化; 基因表達

0 前言

皮質(zhì)醇(Cortisol)是硬骨魚類主要的糖皮質(zhì)激素, 由腎間組織分泌合成，參與多種應(yīng)激反應(yīng), 調(diào)節(jié)體內(nèi)血糖、滲透壓平衡與免疫功能[1]。大量研究表明，硬骨魚體內(nèi)皮質(zhì)醇水平的高低對魚類性腺分化有著關(guān)鍵影響。高溫誘導(dǎo)下日本比目魚()體內(nèi)皮質(zhì)醇含量升高，抑制芳香化酶(Aromatase)基因表達，同時出現(xiàn)雌至雄性逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象[2]。暴露皮質(zhì)醇下的日本雌性青鳉()出現(xiàn)雄性表型[3]。暴露皮質(zhì)醇抑制日本比目魚卵巢發(fā)育, 導(dǎo)致魚群雄性比例上升[4]。體內(nèi)皮質(zhì)醇含量升高會導(dǎo)致魚體內(nèi)雄激素分泌增加，從而誘導(dǎo)雌魚雄性化[5]。

倍他米松(Betamethasone)是人工合成糖皮質(zhì)激素類(Synthetic glucocorticoids)藥物，被用于治療炎癥與過敏等癥狀[6]。人類活動導(dǎo)致倍他米松隨醫(yī)療、畜牧、生活廢水進入自然水環(huán)境中[7-9]。醫(yī)院排放的醫(yī)療廢水中倍他米松含量可高至1720 ng·L-1[7]。與皮質(zhì)醇相比，倍他米松在環(huán)境中更難降解[10]。工業(yè)化污水處理無法完全降解和消除水體中的倍他米松，其清除率只有68—85.5%[7-8]。因未經(jīng)處理的廢水排放導(dǎo)致在巴西Doce河流某段流域中倍他米松平均濃度高達246 ng·L-1[8-9]。在瑞士、捷克、英國等多個國家的自然水環(huán)境測出倍他米松平均濃度范圍在1—15 ng·L-1[7]。倍他米松會通過與魚體內(nèi)的糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合，行使糖皮質(zhì)激素功能, 對于性腺分化有著關(guān)鍵影響。目前研究表明倍他米松暴露會影響斑馬魚()胚胎性激素合成途徑酶、性激素受體的基因表達[11]，長期處理則會導(dǎo)致雄性青鳉出現(xiàn)雌性第二性征[12]。故魚類暴露于倍他米松會通過干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)，擾亂魚類性腺分化與發(fā)育過程，進一步導(dǎo)致魚類生殖能力受損, 對生態(tài)穩(wěn)定帶來一定風(fēng)險。因此，倍他米松對于魚類生殖的影響值得深入探究。

日本青鳉因具有胚胎透明、第二性征明顯、性成熟時間短、性別可塑性強及對環(huán)境污染物敏感等特點, 已被廣泛應(yīng)用于毒理學(xué)等領(lǐng)域研究中，是研究污染物毒性效應(yīng)的良好模型生物。本研究選用日本青鳉魚為實驗魚, 基于環(huán)境中倍他米松濃度對其胚胎進行暴露，觀察胚胎孵化情況, 測定倍他米松與皮質(zhì)醇處理后仔魚階段性激素合成途徑相關(guān)基因 aromatase ()hydroxysteroid 17-beta dehy-drogenase 3()、hydroxysteroid 11-beta dehy-drogenase 2()與性腺分化相關(guān)基因gonadal soma derived factor()、doublesex and mab-3 related transcription factor 1()、forkhead box L2()的相對表達變化，評估倍他米松與皮質(zhì)醇暴露處理對性腺分化與生殖內(nèi)分泌的潛在影響，為探究糖皮質(zhì)激素類污染物對魚類胚胎與生殖毒理機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要儀器與試劑

倍他米松(CAS號：378-44-9，純度≥98.5%)購于薩恩華公司(中國)；皮質(zhì)醇(CAS號：50-23-7，純度≥99%)購于Med Chem Express公司；總RNA提取試劑(TRIzol)購于Thermo Fisher公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR037A)與熒光定量試劑盒(DRR820A)購于Takara公司；無水乙醇, 氯化鈉(NaCl)，氯化鉀(KCl)等其余試劑購為分析純, 購于生工生物工程公司。體視顯微鏡型號為DM500，購于Leica公司。實時熒光定量儀型號為Applied Biosystems 7300 Real- Time PCR System，購于Thermo Fisher公司。

1.2 實驗動物

青鳉親魚購自Shanghai FishBio公司, 平均體質(zhì)量0.35±0.5 g，養(yǎng)殖于20 L透明水箱, 水溫維持25 ± 1 ℃，早晚各投喂鮮活鹵蟲餌料一次，保持每日光暗比為14 h:10 h。每日收集青鳉胚胎, 放入清水用鑷子將其逐個分開，通過體式顯微鏡觀察剔除未受精胚胎。

1.3 暴露實驗

青鳉魚胚胎孵化液為5 g NaCl, 3 g KCl, 0.4 g CaCl2·2H2O, 1.6 g MgSO4·7H2O溶于1 L無菌水中。本實驗設(shè)置空白組、對照組(等量無水乙醇處理)、倍他米松處理組(倍他米松質(zhì)量濃度為20、200、2000 ng·L-1)及皮質(zhì)醇處理組(皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度為20、200、2000 ng·L-1)，所有藥物均用無水乙醇溶解。青鳉胚胎(n=200)養(yǎng)殖在各實驗組培養(yǎng)皿中，每隔12 h更換孵化液并剔除死亡胚胎。在仔魚出膜后3 d，投喂少量鮮活鹵蟲餌料，養(yǎng)至孵化后14 d，收集各實驗組仔魚，經(jīng)液氮處理后存入-80℃冰箱。

1.4 引物合成

根據(jù)NCBI上已公布的青鳉性腺分化相關(guān)基因(NM_001278879)、(NM _001104888)、(AF319994)、(NM_001177742), 類固醇合成酶相關(guān)基因(XM_011478970)、(NM_001104791)以及內(nèi)參基因-(XM_ 023958833) mRNA序列，利用Primer 5.0設(shè)計基因特異性引物，并由生工生物工程(上海)合成。引物序列見表1。利用PCR技術(shù)擴增目的片段，并利用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，后續(xù)通過膠回收回收目的片段，連接至pGEM-T Easy載體，并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中，挑選單克隆菌落送測(上海生工)，利用NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST)對測序結(jié)果進行比對分析。

表1 引物序列

1.5 cDNA合成

樣品經(jīng)低溫研磨后, 采用TRIzol法提取總RNA，后用DEPC水溶解RNA。所有RNA樣品通過凝膠電泳檢測完整性，并用Nanodrop 2000(Thermo Scientific)測定RNA濃度、純度。取500 ng RNA, 使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)合成cDNA, 后保存入-20 ℃。

1.6 基因表達變化的檢測

用反轉(zhuǎn)的cDNA樣品為模板，采用SYBR?Premix Ex Taq試劑盒進行定量。實時熒光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction, RT- qPCR)體系(20 μL)：10 μL SYBR，0.4 μL ROX Reference Dye，2 μL cDNA模板，6μL無菌水，上下游引物(10pmol)各0.8μL。RT-qPCR 程序為 : 95 ℃預(yù)變性 30 s，40個循環(huán)(95 ℃下 5 s, 60 ℃下 30s)，10 ℃下 20 min。得到數(shù)據(jù)后采用 2-△△CT法分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

定量實驗數(shù)據(jù)均以Mean士S.E.M.表示，使用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，進行用單因素方差分析(one-way ANOVA)，*<0.05為顯著差異。用Origin 8.0軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 青鳉胚胎孵化數(shù)據(jù)統(tǒng)計

在胚胎孵化至仔魚養(yǎng)殖期間, 空白組與對照組的胚胎與仔魚死亡率分別達到2.1%、3.2%。在2000 ng·L-1倍他米松暴露組死亡率最高達到5.2% (表2)，該結(jié)果與對照組死亡率無明顯差異。空白組與對照組在13 d時孵化率均達到90%以上。2000 ng·L-1皮質(zhì)醇暴露組在12 d時孵化率達到90%，相比對照組青鳉胚胎孵化時長縮短1 d。200與2000 ng·L-1倍他米松暴露組分別在15 d與16 d時孵化率達到90%，相較對照組青鳉胚胎孵化時長增加2 d。(圖1)。

2.2 青鳉仔魚基因相對表達結(jié)果

RT-qPCR結(jié)果分析后顯示，對照組與空白組中青鳉仔魚性別決定基因與類固醇合成酶、與基因相對表達無顯著差異，證明本實驗以無水乙醇為處理組溶劑對基因表達并無顯著影響。皮質(zhì)醇暴露組所測各個基因相對表達量與濃度呈明顯負相關(guān)性。相較對照組, 20 ng·L-1皮質(zhì)醇暴露組,基因相對表達顯著下降約2倍(<0.05)。200 ng·L-1和2000 ng·L-1皮質(zhì)醇暴露組、、與基因相對表達均出現(xiàn)顯著下降(<0.05)，在2000 ng·L-1暴露組所測各個基因相對表達皆下降10倍以上。倍他米松暴露組青鳉仔魚基因表達較與對照組，基因相對表達顯著下降至約6倍(<0.05)；基因表達在20與200 ng·L-1基因表達均顯著升高(<0.05)；基因表達在顯著下降(<0.05)， 20， 200， 200 ng·L-1倍他米松暴露組分別降低2.2、13.6、17.6倍。基因相對表達在各濃度均有顯著升高(<0.05), 但表達升高趨勢與暴露濃度呈負相關(guān)性, 其余所測基因表達均無顯著變化(圖2, 圖3, 圖4)。

3 討論與結(jié)論

水體環(huán)境中類糖皮質(zhì)激素污染物干擾水生生物性腺分化與發(fā)育過程，造成水生生物生殖能力損傷，對生態(tài)健康造成巨大威脅。本研究通過青鳉胚胎暴露環(huán)境相關(guān)濃度的倍他米松與皮質(zhì)醇下，發(fā)現(xiàn)胚胎在倍他米松與皮質(zhì)醇處理下孵化速率有著不同趨勢，死亡率均小于5.2%。在對仔魚階段性別決定與類固醇合成酶基因相對表達進行測定，發(fā)現(xiàn)暴露倍他米松與皮質(zhì)醇均顯著改變基因相對表達量，且兩者影響基因相對表達的趨勢存在巨大差異，但都表明對魚類性激素合成與性腺分化均存在潛在的不利影響。

本研究發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)醇與倍他米松處理對青鳉胚胎孵化時長有著不同影響。皮質(zhì)醇暴露后縮短青鳉胚胎孵化時間, 有報道表明其他合成糖皮質(zhì)激素類如強的松龍[13]、醋酸氟氯可的松[14]、丙酸氯倍他索[15]等均有加速胚胎孵化情況。該現(xiàn)象可能是由于暴露糖皮質(zhì)激素可能導(dǎo)致孵化酶提前釋放, 從而加速胚胎孵化[16]。外源性糖皮質(zhì)激素倍他米松處理有延緩青鳉胚胎孵化現(xiàn)象, 但具體原因有待進一步探究。

表2 青鳉存活率

圖1 青鳉胚胎孵化時間

Figure 1 Hatching time of medaka embryos

圖2 皮質(zhì)醇或倍他米松暴露下青鳉仔魚cyp19a1a、foxl2基因相對表達量

Figure 2 Relative expression levels of,mRNA in medaka larvae by cortisol or betamethasone exposure

圖3 皮質(zhì)醇或倍他米松暴露下青鳉仔魚dmrt1、gsdf基因相對表達量

Figure 3 Relative expression levels of,mRNA in medaka larvae by cortisol or betamethasone exposure

圖4 皮質(zhì)醇或倍他米松暴露下青鳉仔魚hsd17b3、hsd11b2基因相對表達量

Figure 4 Relative expression levels of,mRNA in medaka larvae by cortisol or betamethasone exposure

未分化性腺是經(jīng)一系列復(fù)雜的調(diào)控過程下分化發(fā)育成精巢與卵巢。本研究中測定四類性腺分化關(guān)鍵調(diào)控基因，對兩類糖皮質(zhì)激素對仔魚階段性腺分化的分子層面影響進行初步探究。是脊椎動物卵巢決定與分化的標志性啟動基因，它表達水平調(diào)控著基因表達[17]?；虮磉_的產(chǎn)物為P450芳香化酶，是負責(zé)將睪酮轉(zhuǎn)化為雌激素的限速催化酶，因此基因表達水平對雌激素合成與卵巢分化起著重要的作用[18]。高溫誘導(dǎo)體內(nèi)高水平皮質(zhì)醇抑制了日本牙鲆性腺基因表達[2]。暴露倍他米松斑馬魚胚胎導(dǎo)致基因表達水平顯著下降[11]。與前兩則研究結(jié)果相似，本研究中暴露皮質(zhì)醇與倍他米松下均抑制青鳉仔魚基因的表達?；騼H在皮質(zhì)醇誘導(dǎo)下表達顯著降低(<0.05)，且與皮質(zhì)醇處理組濃度呈負相關(guān)性，倍他米松處理組基因表達并無顯著變化。綜上表明皮質(zhì)醇可能通過降低基因表達的途徑，進而抑制基因表達，而倍他米松處理組則通過其他通路途徑抑制基因的表達。

硬骨魚類性腺分化期間基因會在雄性生殖細胞與體細胞中特異高水平表達，在日本青鳉中缺失基因，會導(dǎo)致精巢里生殖細胞退化，使雄性青鳉發(fā)生性逆轉(zhuǎn)[19]。同時基因的過表達會引起雌魚雄性化[20]。在本研究中，基因表達水平僅在20與200 ng·L-1倍他米松暴露組仔魚中出現(xiàn)顯著升高(<0.05)，該結(jié)果表明倍他米松可能誘導(dǎo)仔魚雄性化趨勢?；?qū)儆谏L轉(zhuǎn)化因子TGF-β家族。在青鳉魚中敲除基因, 出現(xiàn)100%雌性青鳉現(xiàn)象[21]，表明在青鳉魚基因表達是維持未分化性腺向精巢分化所不可或缺。本研究中，兩種糖皮質(zhì)激素暴露皆引起青鳉仔魚的基因表達的顯著下降(<0.05)，這與一些研究中發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)醇增加能引起基因表達上升結(jié)果并不一致[3]。本研究推測可能是由于實驗魚生命階段不同，處理方式不同和誘導(dǎo)方式等多個實驗條件差異導(dǎo)致結(jié)果差異。在性腺分化過程中, 原生殖細胞會分化為精原細胞與卵母細胞，后經(jīng)分化與發(fā)育后形成相應(yīng)的成熟配子?；蛑饕诰仓兄С旨毎c卵巢中顆粒細胞中表達，對性腺中原生殖細胞與精原細胞的增殖起著重要作用[22]。因此基因在皮質(zhì)醇與倍他米松暴露下表達水平顯著下降(<0.05), 可能延緩仔魚的性腺分化過程。

基因定量結(jié)果表明在皮質(zhì)醇暴露組會引起它們表達水平顯著降低(<0.05)，倍他米松組中基因無顯著變化，但與暴露濃度呈負相關(guān)性，該結(jié)果指出皮質(zhì)醇與倍他米松暴露處理后可能誘導(dǎo)基因表達的下降，對仔魚時期雌雄激素的“原料”睪酮的合成具有潛在不利影響[23]。暴露皮質(zhì)醇誘導(dǎo)魚體內(nèi)11-酮基睪酮(11-ketotesto-sterone,11-KT)分泌增加，進而引起雌魚的雄性化，在此過程中同時參與雄激素11-KT和皮質(zhì)醇的合成的11β-羥基類固醇脫氫酶2可能起到關(guān)鍵作用[5]。基因表達在皮質(zhì)醇暴露組與倍他米松暴露組中出現(xiàn)顯著差異性表達，在皮質(zhì)醇暴露組顯著下降，倍他米松處理組顯著上升趨勢(<0.05)。皮質(zhì)醇暴露組中基因表達顯著下降可能是高水平的皮質(zhì)醇引起的下丘腦-垂體-間腎軸的負反饋調(diào)節(jié)[24]。

性激素由膽固醇在各類性激素途徑合成酶催化下合成，主要有維持性腺正常分化與發(fā)育，生殖細胞增殖分化，促進配子成熟的功能。在兩種糖皮質(zhì)激素暴露下性激素合成途徑酶的基因相對表達都出現(xiàn)顯著的變化(<0.05)，該結(jié)果表明倍他米松與皮質(zhì)醇暴露會擾亂生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)，進而影響仔魚的性腺分化過程[23]。皮質(zhì)醇與倍他米松暴露下基因表達均顯著下降(<0.05), 抑制雌激素的合成，并抑制仔魚未性腺向卵巢分化。同時，皮質(zhì)醇暴露下青鳉仔魚與基因表達顯著下降(<0.05)，對雄激素的合成具有抑制效果。因此, 皮質(zhì)醇的暴露可能會抑制性激素的合成，抑制效果與暴露濃度呈正相關(guān)。

綜上所述, 青鳉胚胎暴露皮質(zhì)醇與倍他米松至仔魚階段，基因相對定量結(jié)果表明皮質(zhì)醇與倍他米松暴露均會擾亂生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)，并可能延緩仔魚性腺分化過程，其中倍他米松的暴露可能會誘導(dǎo)仔魚的雄性化。

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Effects of betamethasone and cortisol on gonad differentiation of Japanese medaka

XIANG Jiazhi1, SU Maoliang2, 3, ZHANG Junbin1, 2, *

1. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China 2. Shenzhen Key Laboratory of Marine Bioresource & Eco-Environmental Science, College of Life Sciences and Oceanography, Shenzhen University, Shenzhen 518060, China 3. Key Laboratory of Optoelectronic Devices and Systems of Ministry of Education and Guangdong Province, College of Optoelectronic Engineering, Shenzhen University, Shenzhen518060, China

Cortisol, the main glucocorticoid in fish, plays a key role in gonad differentiation and sex hormone synthesis of fish. Betamethasone, as a cortisol derivative, is widely detected in aquatic environment and can cause the harm to reproduction capacity of fish. In order to study the effect of cortisol and its derivative-betamethasone on the expression of key gene of sex hormone synthase and gonad differentiation in medaka () larvae, and evaluate its effect on gonad differentiation and reproductive endocrine, the medaka embryos were exposed hatching-solution to larvae stage containing 20, 200, 2000 ng·L-1betamethasone and cortisol, respectively. The results showed that 2000 ng·L-1cortisol accelerated the embryos hatching time for 1 day, and 200 or 2000 ng·L-1betamethasone delayed the embryos hatching time for 2 days. During the gonad differentiation stage of larvae, both cortisol and betamethasone treatment caused significant changes in the expression levels of steroid hormone synthase genes and gonad differentiation-related genes. The expression levels of,,genes all decreased significantly (<0.05) by cortisol exposure, reflecting that cortisol treatment may inhibited sex hormone synthesis, and the inhibitory effect was positively correlated with cortisol concentration levels.Betamethasone exposure significantly reduced the expression levels of,, and significantly increased the expression levels of(<0.05). the results showed thatbetamethasone exposure could cause virilization. The expression levels ofgene decreased after cortisol or betamethasone treatment, which indicated the delay of the gonad differentiation of larvae. In summary, both cortisol and betamethasone exposure can disturb the reproductive endocrine system and delay the gonad differentiation of larvae. Betamethasone exposure can induce virilization of medaka larvae.

betamethasone; cortisol; Oryzias latipes; gonad differentiation; gene expression

10.14108/j.cnki.1008-8873.2021.05.003

X171.5

A

1008-8873(2021)05-016-07

2020-03-12;

2020-04-17基金項目:國家自然科學(xué)基金項目(41806177, 41976108); 中國博士后基金(2019M653010)

向家志(1995—), 男, 四川省廣元市人, 碩士研究生, 從事環(huán)境毒理學(xué)研究, E-mail: xiyiangxiang@163.com

通信作者:張俊彬, 男, 博士, 教授, 主要從事海洋魚類生理研究, E-mail: jbzhang@szu.edu.cn

向家志, 蘇冒亮, 張俊彬. 皮質(zhì)醇及其衍生物(倍他米松)對青鳉性腺分化影響的探究[J]. 生態(tài)科學(xué), 2021, 40(5): 16–22.

XIANG Jiazhi, SU Maoliang, ZHANG Junbin. Effects of betamethasone and cortisol on gonad differentiation of Japanese medaka[J]. Ecological Science, 2021, 40(5): 16–22.