馬爭(zhēng)發(fā),譚維群,余甜甜,崔世煜,廖秋香,張麗杰

(重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054)

0 引 言

水凝膠是高分子間通過(guò)共價(jià)鍵、氫鍵或范德華力等作用相互交聯(lián)而形成的一種三維網(wǎng)狀材料，能夠在水中溶脹、吸收并保持大量水分而又不溶解于水[1-3]，具有良好的生物相容性、保濕性和易修飾性[4-6]。水凝膠被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，如創(chuàng)傷敷料[7]，組織工程支架[8-9]，藥物緩釋載體[10]等。PVA(聚乙烯醇)由VAc(醋酸乙烯)經(jīng)聚合醇解而制成的水溶性高分子材料，具有良好的成膜性、力學(xué)性能、降解性和安全性，且制備方法簡(jiǎn)單重復(fù)性好，是合成水凝膠敷料的主要原料之一。但單一PVA合成的水凝膠通常無(wú)生物活性，在生物醫(yī)學(xué)方面存在缺陷，極大的限制了其推廣應(yīng)用。通常與其他材料一起制備復(fù)合水凝膠以滿足各方面的需求。PMLA(聚蘋(píng)果酸)是唯一一種含酯鍵又能快速水解的高分子聚合物，水解產(chǎn)物為蘋(píng)果酸單體，可進(jìn)入三羧酸循環(huán)中被降解。同時(shí)其分子結(jié)構(gòu)上含有很水溶性、血液穩(wěn)定性和抑菌性等[11-13]，被廣泛應(yīng)用于藥物載體等領(lǐng)域，但在生物多化學(xué)性能活潑的羧基，這些游離的羧基賦予PMLA良好的修飾性、生物相容性、醫(yī)用敷料中尚未見(jiàn)使用。傷口的愈合是一個(gè)緩慢的過(guò)程，眾多的外界因素會(huì)導(dǎo)致其愈合緩慢，其中細(xì)菌感染就最常見(jiàn)的因素。在傷口愈合過(guò)程中如果產(chǎn)生感染細(xì)菌，就會(huì)引起傷口化膿，導(dǎo)致傷口愈合時(shí)間延長(zhǎng)，嚴(yán)重的甚至?xí)鹉摱狙Y，危害生命健康。因此，敷料具有抑菌性是非常有必要的。課題組在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，加入聚蘋(píng)果酸的敷料，具有良好的抑菌效果，因此本文通過(guò)將PMLA和PVA共混改性，采用凍融法制備出PVA/PMLA復(fù)合水凝膠，探究了復(fù)合水凝膠的物理性能和生物性能，以期制備出一種可用于預(yù)防傷口感染，促進(jìn)慢性傷口快速愈合的抗菌水凝膠敷料。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

聚乙烯醇-1799，成都市科隆化學(xué)品有限公司；聚蘋(píng)果酸(50% in H2O)，上海麥克林生化科技有限公司；青霉素-鏈霉素溶液(雙抗)、胰蛋白酶、DMEM高糖培養(yǎng)基，上海源培生物科技股份有限公司；MTT，北京酷來(lái)搏科技有限公司；胎牛血清，上海吉泰依科賽生物科技有限公司。

高壓滅菌鍋，上海博訊醫(yī)療器械有限公司；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Scientific 公司；超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；離心機(jī)，美國(guó)Scilogex公司；倒置生物顯微(IX71)，日本Olympus公司；鏡酶標(biāo)儀(Multiskan GO)，美國(guó) Thermo Scientific 公司；恒溫磁力攪拌器，金壇市精達(dá)儀器制造有限公司；冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；METTLER AE240電子天平，METTLER TOLEOD；掃描電子顯微鏡，日本Hitachi公司(S-4800型)；微機(jī)控制生物力學(xué)試驗(yàn)機(jī)，長(zhǎng)春機(jī)械科學(xué)研究院有限公司(DNS20型)；傅立葉變換紅外光譜儀，美國(guó)Perkin Elmer公司(Spectr μm 100)。

1.2 PMLA/PVA復(fù)合水凝膠的制備

準(zhǔn)確稱取適量的PVA放入純水中，在70 ℃水浴加熱下溶脹2 h，再以500 r/ min的轉(zhuǎn)速，90 ℃下攪拌1 h形成均勻的10%PVA溶液。精確稱取PLMA(50%inH2O)溶液，加入超純水，攪拌均勻，制得10wt%PLMA溶液。將PLMA溶液與PVA溶液按一定質(zhì)量比共混，混合溶液室溫下以500 r/ min的轉(zhuǎn)速攪拌30 min,再將混合溶液超聲10 min,將混合均勻的溶液倒入培養(yǎng)皿中，在-20 ℃下冷凍20 h，拿出在室溫下解凍4 h，冷凍-解凍循環(huán)3次，制得PMLA/PVA復(fù)合水凝膠。

1.3 PMLA/PVA復(fù)合水凝膠的性能評(píng)價(jià)

1.3.1 PMLA/PVA復(fù)合水凝膠的紅外光譜檢測(cè)

采用傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)待測(cè)干凝膠進(jìn)行全反射測(cè)試。測(cè)試范圍為4 000～500 cm-1，掃描次數(shù)為32，分辨率為1 cm-1。

1.3.2 凝膠分?jǐn)?shù)

稱取適量干凝膠M(g)，在50 ℃純水中浸泡24 h濾去水凝膠中未交聯(lián)的分子，剩余的凝膠在60 ℃下干燥，稱重記為m(g)。每組3個(gè)平行樣品，取平均值。凝膠分?jǐn)?shù)用以下公式計(jì)算[14-15]：

(1)

1.3.3 溶脹率測(cè)定

將適量水凝膠冷凍干燥后稱重記為m0，將干凝膠浸泡于超純水中，一段時(shí)間t后拿出凝膠，用濾紙擦干凝膠表面水分后稱其質(zhì)量記為mt，每組3個(gè)平行樣品，取平均值。按如下公式計(jì)算水凝膠t時(shí)刻的溶脹度SRt(%)：

(2)

1.3.4 保濕率測(cè)定

將水凝膠稱重記為w0，于室溫下靜置一段時(shí)間t后稱重記為wt，再將水凝膠烘干至恒重記為w3，每組3個(gè)平行樣品，取平均值，水凝膠的t時(shí)保濕率SR(%)：

(3)

1.3.5 力學(xué)性能測(cè)定

參考國(guó)標(biāo)GB/T1701—2001，將水凝膠剪成40 mm×10 mm的長(zhǎng)條狀，使用萬(wàn)能拉力機(jī)，在室溫下以50 mm/min的拉伸速度進(jìn)行試驗(yàn)，計(jì)算拉伸強(qiáng)度(σ)和斷裂伸長(zhǎng)率(ε)，計(jì)算公式分別如下：

(4)

式中：σ為拉伸強(qiáng)度， MPa；F為最大拉力，N；b為樣條的寬度，mm；h為樣條的厚度， mm。

(5)

式中：ε為斷裂伸長(zhǎng)率，%；L為樣條拉伸后的長(zhǎng)度， mm；L0為樣品本身長(zhǎng)度， mm。

1.3.6 掃描電子顯微鏡分析

PVA/PMLA復(fù)合水凝膠真空干燥后表面噴金，用掃描電鏡在10 kV加速電壓下觀察其表面形態(tài)。

1.3.7 抑菌性能評(píng)價(jià)

采用抑菌圈法評(píng)價(jià)凝膠的抑菌性能，同時(shí)探究了PMLA含量對(duì)水凝膠抑菌性能的影響。分別取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌(105～106CUF/mL)均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基表面，將復(fù)合水凝膠(直徑D=6 mm)凝膠片置于培養(yǎng)基上，37 ℃孵育12 h，觀察薄片周?chē)募?xì)菌生長(zhǎng)情況。

1.3.8 細(xì)胞毒性測(cè)定

參照GB/T16886.5—2003，取最佳配比的復(fù)合水凝膠，經(jīng)紫外充分滅菌1 h后完全浸泡于完全培養(yǎng)基中，于37 ℃水浴中浸提24 h得到浸提液。

取培養(yǎng)到第三代的細(xì)胞，接種100 μL到96孔板中，每孔1 000個(gè)左右的細(xì)胞，細(xì)胞單層鋪在孔底，加入100 μL水凝膠浸提液或新鮮培養(yǎng)基。設(shè)置空白、陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，分組如下表1。再繼續(xù)培養(yǎng)72 h天，每24 h取一個(gè)96板，每孔用20 μL MTT 溶液處理(5 mg/mL)，然后在37 ℃ CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)后，小心吸取孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO溶液，酶標(biāo)儀測(cè)在490nm處測(cè)定并記錄OD值，測(cè)定前先震板10 s。

表1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)分組Table 1 Grouping of cytotoxicity experiments

細(xì)胞的毒性情況通過(guò)計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率(relative growth rate，RGR，%)來(lái)判定，計(jì)算：

(6)

材料毒性分級(jí)如下表2所示，材料毒性分級(jí)0或1級(jí)為合格，2級(jí)需結(jié)合細(xì)胞形態(tài)綜合評(píng)價(jià)分析，3～5級(jí)為不合格[16-17]。

表2 材料毒性評(píng)分對(duì)照表Table 2 Comparison table of material toxicity scores

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜分析

PVA、PMLA和PVA/PMLA水凝膠的FT-IR譜圖如圖1所示。3 650～3 200 cm-1為O-H的伸縮吸收，O-H締合和氫鍵形成均會(huì)會(huì)使吸收峰向低波數(shù)偏移，PMLA(3 237 cm-1)和PVA(3 246 cm-1)均有較強(qiáng)較寬吸收，而且峰型較寬，說(shuō)明締合程度較大。當(dāng)兩者混合后吸收峰發(fā)生左移(3 308 cm-1)，且峰寬變窄，說(shuō)明締合程度減少。1 850～1 630 cm-1為C=O的伸縮振動(dòng)區(qū)，其中酮、酸的區(qū)域集中在1 725～1 700 cm-1，在PMLA的紅外圖譜中可以明顯看到1 725 cm-1的吸收峰，當(dāng)兩者混合后吸收峰發(fā)生右移(1 714 cm-1)，當(dāng)形成氫鍵時(shí)，吸收位置向低波數(shù)位移。COO-是一個(gè)多電子的共軛體系，兩個(gè)C=O振動(dòng)偶合，C-O在兩個(gè)地方出現(xiàn)強(qiáng)吸收，分別是反對(duì)稱伸縮振動(dòng)在1 610～1 560 cm-1，對(duì)稱伸縮振動(dòng)在1 440～1 360 cm-1，PMLA的紅外圖譜中在1 591 cm-1和1 420 cm-1處有強(qiáng)吸收峰，當(dāng)兩者混合后1 591 cm-1的吸收峰幾乎消失，COO-的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)受到明顯抑制，說(shuō)明產(chǎn)生了氫鍵。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PVA與PMLA混合后，兩者形成了較強(qiáng)氫鍵作用。

圖1 PVA、PMLA和PVA/PMLA水凝膠的FT-IR譜圖Fig 1 FT-IR spectra of PVA, PMLA and PVA/PMLA hydrogels

2.2 凝膠分?jǐn)?shù)

水凝膠是高分子交聯(lián)而成的一種三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，凝膠分?jǐn)?shù)表明了網(wǎng)絡(luò)形成的程度以及網(wǎng)絡(luò)在水中溶解的穩(wěn)定性。不同質(zhì)量比復(fù)合水凝膠的凝膠分?jǐn)?shù)如圖2所示，可以看出，復(fù)合水凝膠的凝膠分?jǐn)?shù)在50%～82%之間，有著良好的穩(wěn)定性。當(dāng)PVA含量7%，PMLA含量0.25%時(shí)，復(fù)合水凝膠有著最高的凝膠分?jǐn)?shù)(81.83±0.01%)；當(dāng)PMLA含量一定時(shí)，凝膠分?jǐn)?shù)隨著PVA含量的增加而增加；但當(dāng)PVA含量一定時(shí)，凝膠分?jǐn)?shù)隨著PMLA含量的增加而降低，這與冷凍解凍法制備PVA水凝膠的原理有關(guān)[18-20]，PMLA分子上含有大量游離的羧基(-COOH)，與PVA分子上的羥基(-OH)形成氫鍵，導(dǎo)致復(fù)合水凝膠的結(jié)晶度降低，凝膠分?jǐn)?shù)減小。

圖2 不同質(zhì)量比復(fù)合水凝膠的凝膠分?jǐn)?shù)Fig 2 Gel fraction of composite hydrogels with different mass ratios

2.3 溶脹率

水凝膠作為一種理想的創(chuàng)面敷料材料，其吸收和保存液體的能力是評(píng)價(jià)其效果的一個(gè)重要方面。水凝膠的溶脹率是評(píng)價(jià)凝膠吸收液體能力的重要指標(biāo)。不同比例的復(fù)合水凝膠的溶脹性能如下圖3所示。由圖可知，PVA/PMLA復(fù)合水凝膠的溶脹率在500%～1 000%，具有良好的吸水性。溶脹12 h后，水凝膠的吸水速率變?yōu)榫徛?4 h后基本達(dá)到溶脹平衡狀態(tài)。從圖中可以看出敷料的溶脹率隨著PVA濃度的增加而降低，在同一PVA濃度下隨著PMLA濃度的增加而減少，這是因?yàn)镻VA濃度增大復(fù)合水凝膠交聯(lián)程度提高；在同一PVA濃度下，隨著PMLA濃度的增大，PMLA和PVA有更多的氫鍵形成，交聯(lián)度提高從而使溶脹率下降。當(dāng)PVA為5%，PMLA為0%的水凝膠的溶脹率最高，可高達(dá)1 047%；溶脹率最低的是PVA為7%、PMLA為1%時(shí)的復(fù)合水凝膠，為548%。

圖3 不同比例的復(fù)合水凝膠的溶脹時(shí)間曲線(圖a為PVA5wt%，圖b為PVA6wt%，圖c為PVA7wt%)Fig 3 Swelling time curves for different ratios of composite hydrogels (Fig a for PVA 5 wt%, Fig b for PVA 6 wt% and Fig c for PVA 7 wt%)

2.4 保濕率

對(duì)于滲出傷口而言，敷料在吸收傷口滲液與蒸發(fā)的水分之間取得平衡是敷料應(yīng)用的重要性能，保持傷口的濕潤(rùn)能為細(xì)胞再生和運(yùn)動(dòng)提供合適的條件，維持酶和表皮生長(zhǎng)因子的生物活性，從而加速傷口愈[21]。圖4顯示了PVA/PMLA復(fù)合水凝膠的保濕能力與時(shí)間的關(guān)系。從圖中可知，隨著時(shí)間的增加，保濕率在逐漸下降。12 h后，復(fù)合水凝膠的保濕率在44%～70%，具有較好的保濕效果；24 h后，復(fù)合水凝膠的保濕率在6%～45%。從圖4中還可明顯地看出PVA水凝膠的保濕率明顯低于PVA/PMLA復(fù)合水凝膠，隨著PMLA濃度增加，保濕率增加。PVA為7%時(shí)，PMLA為1%的復(fù)合水凝膠的保濕能力最佳，保濕率為45.4%；PMLA為0%的水凝膠濕僅。這可能是因?yàn)榫厶O(píng)果酸上具有很多游離的羧基可與水分子作用形成氫鍵，增強(qiáng)了水凝膠對(duì)水分子的吸附力，這有利于為皮膚提供一個(gè)濕潤(rùn)的環(huán)境。

圖4 不同比例的復(fù)合水凝膠的保濕率-時(shí)間曲線(左圖a PVA 7wt%,PMLA分別為0wt%、0.25wt%、0.5wt%和1.0%，圖b為PMLA0wt%，PVA分別為5wt%、6wt%和7wt%)Fig 4 Humidity-time curves for different ratios of composite hydrogels (left panela PVA7 wt%, PMLA 0 wt%, 0.25 wt%, 0.5 wt% and 1.0 wt% respectively and panel b PMLA 0 wt%, PVA5 wt%, 6 wt% and 7 wt% respectively)

2.5 力學(xué)性能分析結(jié)果

不同配比的PVA/PMLA復(fù)合水凝膠通過(guò)萬(wàn)能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)測(cè)得其拉伸力學(xué)性能如圖5所示。從圖中可以看出，PVA水凝膠的拉伸強(qiáng)度分別為0.025、0.038和0.048 MPa，裂伸長(zhǎng)率在206.71%、182.23%、209.05%；PVA/PMLA復(fù)合水凝膠的拉伸強(qiáng)度在0.018～0.048 MPa，斷裂伸長(zhǎng)率在186.51%～235.32%之間。隨著PVA的增加，拉伸強(qiáng)度增加顯著，斷裂伸長(zhǎng)率沒(méi)有顯著變化；隨著PMLA的增加，復(fù)合水凝膠的拉伸強(qiáng)度略有降低，斷裂伸長(zhǎng)率明顯增大，說(shuō)明在PVA/PMLA水凝膠中，PVA鏈對(duì)拉伸強(qiáng)度起主導(dǎo)作用，PMLA對(duì)拉伸強(qiáng)度影響較小，但可以增加復(fù)合膠的斷裂伸長(zhǎng)率，這是因?yàn)镻MLA和PVA之間形成了氫鍵，使得PVA鏈的結(jié)晶度減低，拉伸強(qiáng)度降低；鏈段變長(zhǎng)，同時(shí)PMLA作為非結(jié)晶鏈，增強(qiáng)了水凝膠的分子鏈長(zhǎng)，其伸長(zhǎng)能力有效地提高，斷裂伸長(zhǎng)率變化明顯。

圖5 復(fù)合水凝膠的力學(xué)性能(圖a為斷裂伸長(zhǎng)率，圖b為拉伸強(qiáng)度)Fig 5 Mechanical properties of the composite hydrogel (Fig a shows elongation at break, Fig b shows tensile strength)

2.6 掃描電子顯微鏡分析

由圖6的電鏡結(jié)果可以看出，PVA(5%)水凝膠和(5%/0.25%)合水凝膠具大量的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。PVA水凝膠的孔隙率為69.6%，平均孔徑397 μm；PVA/PMLA復(fù)合水凝膠的孔隙率為65.0%，平均孔徑為515 μm，PVA/PMLA復(fù)合水凝膠的孔徑明顯大于PVA水凝膠，和紅外吸收光譜分析的結(jié)果一致。即形成PVA/PMLA的復(fù)合水凝膠中，PVA分子間氫鍵結(jié)合減少，凝膠分率下降，PMLA和PVA之間形成了氫鍵，使得PVA分子間結(jié)合得更疏松，孔徑增大。多孔的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不僅有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氧氣及水分在細(xì)胞之間進(jìn)行傳遞，還有利于將細(xì)胞代謝的物質(zhì)及時(shí)移除，從而促進(jìn)細(xì)胞遷移增殖。

圖6 水凝膠電鏡圖(A為PVA，B為PVA/PMLA)Fig 6 Hydrogel electron micrographs (A for PVA, B for PVA/PMLA)

2.7 抑菌實(shí)驗(yàn)

將不同配比的復(fù)合水凝膠對(duì)大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)和金黃葡萄球菌(革蘭氏陽(yáng)性菌)進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，抑菌效果如圖7所示。由圖7可知，PVA水凝膠無(wú)抑菌性，PVA/PMLA復(fù)合水凝膠具有較好的抑菌性，PMLA的含量越高復(fù)合水凝膠的抑菌效果越好。當(dāng)PMLA含量為1wt%時(shí)，復(fù)合水凝膠的抑菌效果較佳，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為14.8 mm和16.5 mm。

圖7 不同配比復(fù)合水凝膠抑菌效果(圖(a)為大腸桿菌，圖(b)為金黃葡萄菌)Fig 7 Bacterial inhibition effect of different ratios of composite hydrogels (Fig (a) for E. coli, Fig (b) for S. aureus)

2.8 細(xì)胞毒性

以溶脹和保濕性能最佳的復(fù)合水凝膠制備浸提液，采用MTT法測(cè)得復(fù)合水凝膠3d的增殖情況與細(xì)胞毒性等級(jí)表3所示。由表3可知，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的1-3d的細(xì)胞相對(duì)增殖率都在80%～90%之間，細(xì)胞毒性等級(jí)都在1級(jí)，但復(fù)合水凝膠的相對(duì)增值率高于市售敷料，依據(jù)GB/T—16886.5—2003醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，浸提液對(duì)細(xì)胞均無(wú)顯著影響。研究結(jié)果表明，復(fù)合水凝膠和市售敷料沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性，生物相容性優(yōu)于市售敷料。

表3 復(fù)合水凝膠的細(xì)胞毒性情況Table 3 Cytotoxicity profile of composite hydrogels

3 結(jié) 論

以PVA和PMLA為材料，通過(guò)物理方法制得表面光滑的復(fù)合水凝膠，考察了不同配比的PVA/PMLA復(fù)合水凝膠在吸水性、保濕性和力學(xué)性能等區(qū)別，并對(duì)復(fù)合水凝膠的細(xì)胞毒性進(jìn)行了體外評(píng)價(jià)。

(1)通過(guò)紅外光譜和掃描電鏡分析，結(jié)果表明PVA/PMLA復(fù)合水凝膠中PMLA能與PVA以氫鍵結(jié)合，有大量互通的孔隙結(jié)構(gòu)，隨著PMLA的加入，PVA分子間的氫鍵減少，復(fù)合水凝膠的空隙率減小、孔徑增大。

(2)通過(guò)對(duì)PVA/PMLA復(fù)合水凝膠的物理性能進(jìn)行表征，結(jié)果表明PVA/PMLA復(fù)合水凝膠具有良好的保濕性能和力學(xué)性能，PMLA的加入明顯提高了復(fù)合水凝膠的保濕能力。

(3)抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PVA水凝膠對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌無(wú)抑菌活性；PVA/PMLA復(fù)合水凝膠對(duì)兩種菌都具有良好的抑制效果，抑菌活性隨著PMLA含量的增加而增加。

(4)體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PVA/PMLA復(fù)合水凝膠無(wú)細(xì)胞毒性，生物相容性優(yōu)于市售敷料，有望作為一種理想的醫(yī)用水凝膠敷料，用于慢性傷口的護(hù)理。