王光躍， 張淑平

（上海理工大學(xué)，上海 200093）

次氯酸鹽（ClO）是生物體內(nèi)最重要的活性氧物種之一[1-2]。在生物體內(nèi)，ClO-由髓過氧化物酶(MPO)催化的活化中性粒細(xì)胞中的過氧化氫和氯離子生成[3-4]。次氯酸鹽的生產(chǎn)過量會(huì)導(dǎo)致組織損傷和一系列人類疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎甚至癌癥等[5-6]。因此，快速、靈敏的檢測(cè)ClO-在生物體中相當(dāng)重要。

到目前為止，已經(jīng)報(bào)道了許多檢測(cè)ClO-的方法，例如生物發(fā)光法[7]、比色分析法[8]、電化學(xué)分析法[9]、輻射法[10]、熒光法[11-13]等等。其中，熒光法具有較好的靈敏度和選擇性。分子熒光探針因其特點(diǎn)，可用作生物系統(tǒng)中跟蹤生物分子的有力工具[14]。小分子熒光探針具有成本低、毒性小等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)逐漸成為生物及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的主要研究方法[15-20]。近年來，已有多個(gè)科研團(tuán)隊(duì)開發(fā)了多個(gè)熒光探針，并實(shí)現(xiàn)了良好的生物應(yīng)用[21-23]。而這些已開發(fā)出的熒光探針分子，大多具有較短的發(fā)射波長(zhǎng)（＜650 nm），成像時(shí)會(huì)被生物樣品自身熒光信號(hào)所干擾，導(dǎo)致較差的靈敏性，從而不能準(zhǔn)確地進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)物種檢測(cè)。

本文基于亞甲藍(lán)熒光團(tuán)化學(xué)結(jié)構(gòu)的逆向分析，首次合成出了化合物MB-nBu，并考察了化合物MB-nBu與ClO-反應(yīng)的光譜變化及穩(wěn)定性。另外，在進(jìn)行了化合物MB-nBu的細(xì)胞毒性探究實(shí)驗(yàn)后，對(duì)化合物MB-nBu的生物適用性進(jìn)行了探究。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)藥品試劑如表1所示，實(shí)驗(yàn)儀器如表2所示。

表1 實(shí)驗(yàn)藥品試劑

表2 實(shí)驗(yàn)儀器

1.2 探針MB-nBu的制備

探針MB-nBu的合成步驟，根據(jù)文獻(xiàn)[23-24]，做少量調(diào)整（如圖1所示）：

圖1 探針MB-nBu的合成

1）將亞甲基藍(lán)MB（1 mmol，384 mg）、碳酸鈉（4 mmol，424 mg）6 mL水和9 mL二氯甲烷混合，并在40℃攪拌，氮?dú)獗Ｗo(hù)下注射加入連二亞硫酸鈉（4 mmol，696 mg），攪拌反應(yīng)30分鐘，得到化合物1；

2）向溶液中加入碳酸鈉（424 mg，4 mmol），置于冰浴中、氮?dú)獗Ｗo(hù)，逐滴加入三光氣（TPG，113 mg，0.6 mmol）的DCM溶液，常溫下反應(yīng)2 h。薄層色譜監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全，溶液呈黃色。反應(yīng)結(jié)束用DCM/H2O萃取，收集有機(jī)相，得到化合物2；

3）將正丁氨（65 μL，1 mmol）溶于3 mL無水二氯甲烷中，加入三乙胺（260 μL），于冰浴、氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌，注射滴加化合物2的二氯甲烷溶液。溶液變?yōu)榈t色。常溫反應(yīng)8 h，薄層色譜監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全，反應(yīng)結(jié)束溶液變?yōu)闇\紅色。用乙酸乙酯/水萃取反應(yīng)液，有機(jī)相加無水硫酸鈉干燥，產(chǎn)物通過柱色譜純化（氧化鋁，EA/PE＝1/8），得到灰白色固體MB-nBu（123 mg，Yield：32%）。

MB-nBu：1H-NMR（500 MHz, DMSO-d6）δ7.26（d,J＝8.8 Hz, 2H），6.72（d,J＝2.7 Hz, 2H），6.68（dd,J＝8.9, 2.9 Hz, 2H），5.96（t,J＝5.7 Hz, 1H）, 3.02（t,J＝4.5 Hz, 2H）, 2.90（s, 12H）, 1.40～1.35（m,2H）, 1.26～1.21（m, 4H）, 0.88～0.86（m, 3H）。13C-NMR（101 MHz, CDCl3）δ156.14, 149.00, 134.24, 128.70,127.33, 111.39, 111.06, 40.84, 40.70, 32.21, 29.79, 20.17. HRMS(ESI)：C21H28N4OS[M+H]+理論值：385.20174，實(shí)測(cè)值：385.20561。

1.3 光譜測(cè)試

將探針稀釋至10 μM，在不同的pH中探針的熒光穩(wěn)定性及不同濃度次氯酸存在時(shí)探針的光譜變化。在熒光發(fā)射光譜實(shí)驗(yàn)中，測(cè)試所用激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)為λex/em＝620 /680 nm，狹縫為10 nm，電壓為700 V。

1.4 細(xì)胞成像

用完全培養(yǎng)基稀釋探針溶液，使其終濃度為10 μmol/L，于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中（37℃，含5%CO2，95%空氣）孵育HeLa細(xì)胞30 min。后分別在培養(yǎng)基中加入用完全培養(yǎng)基稀釋的終濃度為0、5 μM NaClO、2 μg/mL PMA（可誘導(dǎo)ClO-產(chǎn)生），在37℃繼續(xù)孵育1 h。最后利用激光共聚焦觀察成像結(jié)果（激發(fā)波長(zhǎng)：620 nm；收集范圍：650～750 nm）。

2 結(jié)果和討論

2.1 探針MB-nBu的可能機(jī)理

由探針與NaClO響應(yīng)后的吸收光譜（圖2a）及高效液相色譜分析HPLC分析（圖2b）結(jié)果，探針自身沒有吸收，而后出現(xiàn)三個(gè)吸收峰291 nm、609 nm、668 nm，與已報(bào)道文獻(xiàn)[25]中亞甲基藍(lán)的最大吸收波長(zhǎng)一致，證實(shí)了反應(yīng)完全后亞甲基藍(lán)（MB）的生成。由此推斷探針MB-nBu對(duì)ClO-的反應(yīng)，可能機(jī)理如圖3所示。

圖2 （a）探針MB-nBu及與ClO-響應(yīng)后的吸收光譜（280～800 nm）；

圖3 探針MB-nBu響應(yīng)ClO-的可能機(jī)理

2.2 探針MB-nBu對(duì)ClO-的響應(yīng)光譜

由于酰胺鍵的吸電子效應(yīng)，MB-nBu自身無熒光發(fā)射。如圖4所示，隨著次氯酸的加入，酰胺鍵斷裂熒光團(tuán)熒光恢復(fù)，MB的特征吸收迅速顯示，在680 nm處有一個(gè)峰，探針發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光。探針在680 nm處的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度不斷增高，熒光強(qiáng)度變大。當(dāng)加入10 μM的ClO-時(shí)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)約100倍（從7到670），且當(dāng)加入次氯酸10 μM時(shí)，探針的熒光發(fā)射基本達(dá)到平衡。另外，探針的熒光強(qiáng)度與0-10 μM的次氯酸濃度呈完美的線性關(guān)系（FL＝62.39[ClO-]＋23.99，R2＝0.998 1），檢測(cè)限為29.7 nM。低的檢測(cè)限表明該探針滿足于細(xì)胞等生理狀態(tài)中次氯酸的濃度（10-8～10-6M）檢測(cè)。

圖4 不同梯度濃度ClO-下（0～25 μM）：（a）探針MB-nBu的熒光發(fā)射光譜（640 nm～750 nm）；

2.3 探針的穩(wěn)定性測(cè)試

為了研究探針的穩(wěn)定性，測(cè)試了探針在不同酸堿度條件下的熒光強(qiáng)度，如圖5a所示?？梢钥闯觯撎结樤?.5～8.5的酸堿度范圍內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，因此該探針具有在體內(nèi)檢測(cè)ClO-的潛力?？紤]到這一點(diǎn)，選擇了pH 7.4作為以后的實(shí)驗(yàn)。然后，測(cè)量了探針在不同濃度ClO-中的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化。圖5b顯示，加入不同濃度的ClO-后，熒光強(qiáng)度立即增加到最大值（＜1s），然后保持相對(duì)穩(wěn)定。在隨后的120 s內(nèi)，熒光強(qiáng)度保持穩(wěn)定在最大值。極短的響應(yīng)時(shí)間更適合對(duì)生物體中的ClO-物質(zhì)進(jìn)行實(shí)時(shí)成像。

圖5 （a）不同pH條件，探針MB-nBu及有添加10 μM ClO-后的熒光強(qiáng)度；

2.4 探針的選擇性測(cè)試

為了評(píng)估探針對(duì)ClO-的檢測(cè)選擇性，在加入各種干擾劑后，進(jìn)一步研究了MB-nBu的和熒光響應(yīng)光譜（圖6），所述干擾劑包括: Blank、H2O2、ONOO-、·OH、NO、t-BuOO-、K+、Na+、Li+、Ag+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Al3+、NH4+、Cl-、CH3COO-、Br-、NO3-、I-、CO32-、SO42-、ClO4-、F-、S2O32-、S2O42-、Cys、GSH、Gly。加入50 μM的其他物種后，探針的熒光強(qiáng)度基本沒有發(fā)生變化。結(jié)果表明該探針MB-nBu對(duì)ClO-的檢測(cè)具有高選擇性。

圖6 （a）探針MB-nBu對(duì)不同分析物最大發(fā)射強(qiáng)度柱狀圖；

2.5 細(xì)胞毒性

這里通過MTT法來確定探針MB-nBu的細(xì)胞毒性，以0-100 μM的梯度濃度的探針溶液對(duì)HeLa細(xì)胞進(jìn)行孵育24 h，觀察24 h后細(xì)胞的存活率。如圖4b所示，當(dāng)探針的濃度在12.5 μM以內(nèi)時(shí)，HeLa細(xì)胞能維持在90%以上的存活率。當(dāng)孵育的探針濃度達(dá)到100 μM時(shí)，HeLa細(xì)胞的存活率依然在80%以上。結(jié)果表明，探針MB-nBu具有較低的細(xì)胞毒性，具有細(xì)胞水平成像應(yīng)用的潛力。

2.6 細(xì)胞成像

由于探針MB-nBu具有對(duì)次氯酸較好的的識(shí)別性能、低的細(xì)胞毒性，進(jìn)一步研究了探針在細(xì)胞中的成像能力。發(fā)現(xiàn)當(dāng)僅用探針MB-nBu孵育細(xì)胞，基本沒有觀察到可見的熒光（a～c）。如圖7所示，而當(dāng)加入外源性ClO-（5 μM）孵育有探針的HeLa細(xì)胞時(shí)，通過細(xì)胞成像儀觀察到有明顯的紅色熒光產(chǎn)生（d～f）。結(jié)果表明探針MB-nBu可在活細(xì)胞中檢測(cè)ClO-濃度。在加入2 μg/mL 的PMA培育細(xì)胞后，細(xì)胞中出現(xiàn)明亮的紅色熒光現(xiàn)象（g～i）。這證明了探針MB-nBu的細(xì)胞通透性良好，以及在活細(xì)胞中識(shí)別次氯酸的能力，可用于細(xì)胞內(nèi)外源性及內(nèi)源性ClO-的成像。

圖7 共聚焦成像：細(xì)胞中只加入探針MB-nBu（a～c）、加入探針及次氯酸（d～f）、加入探針及PMA（g～i）

3 結(jié)論

以亞甲基藍(lán)為熒光團(tuán)，設(shè)計(jì)并合成出了一種具有高靈敏度、高選擇性的ClO-熒光探針。探針MB-nBu對(duì)ClO-具有超快速（＜1s）、高特異性、低檢測(cè)限、良好的熒光穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，以及低的細(xì)胞毒性，并成功應(yīng)用于HeLa細(xì)胞中的內(nèi)源性和外源性ClO-的細(xì)胞成像?？傊?，探針MB-nBu在環(huán)境和生物學(xué)領(lǐng)域特異性檢測(cè)ClO-方面有很好的應(yīng)用前景。