●魏代民 劉長宇，2 張 偉 李若銘 劉俊彤 張 建 單曉楓※※

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 吉林 長春 130118；2.吉林省通化縣人力資源與社會保障局 吉林 通化 134100；3.吉林省圖們市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 吉林 延邊 137200）

近年來，我國不僅對食用魚類的需求穩(wěn)步增加，對觀賞性魚類的需求也在逐漸提升，觀賞性魚類的養(yǎng)殖已成為水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)的一個重要組成部分。錦鯽因體色鮮艷、食譜廣泛、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)等特點(diǎn)常被用于觀賞魚養(yǎng)殖[1]，但集約化、高密度的養(yǎng)殖模式以及水環(huán)境的管理不善等因素均會增加錦鯽感染各種細(xì)菌性疾病的風(fēng)險[2]。

疫苗的預(yù)防接種對降低細(xì)菌性疾病發(fā)病率起到重要作用。滅活疫苗具有制備工藝簡單、生產(chǎn)成本低、毒力弱、滅活效果穩(wěn)定以及幾乎不受母源抗體影響等優(yōu)點(diǎn)，是目前市面上主流的免疫方式。本試驗利用分離豚鼠氣單胞菌AC-CY菌株，制備錦鯽源豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae，A.caviae）滅活疫苗，通過對錦鯽的免疫與攻毒試驗，檢測不同階段的免疫指標(biāo)對A.caviae滅活疫苗的免疫效果，以期為防控豚鼠氣單胞菌引發(fā)的疾病提供一定理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株及試驗動物豚鼠氣單胞菌AC-CY菌株，分離自吉林省長春市某觀賞魚養(yǎng)殖場某患病錦鯽魚。健康錦鯽魚300尾（購自長春某魚類養(yǎng)殖場），平均單體重（70±3）g。試驗前在水箱中飼養(yǎng)14 d，觀察健康狀況。

1.1.2 試驗主要試劑HRP標(biāo)記的魚補(bǔ)體4（C4）酶聯(lián)免疫分析試劑盒，HRP標(biāo)記的魚補(bǔ)體3（C3）酶聯(lián)免疫分析試劑盒，HRP標(biāo)記的溶菌酶（LYS）酶聯(lián)免疫分析試劑盒，HRP標(biāo)記的免疫球蛋白M（IgM）酶聯(lián)免疫分析試劑盒，HRP標(biāo)記的堿性磷酸酶（AKP）酶聯(lián)免疫分析試劑盒，均購自南京建成生物技術(shù)有限公司；EasyScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；甲醛購自廣州某化工廠。

1.2 方法

1.2.1 滅活疫苗的制備將AC-CY菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)24 h后，將菌液濃度調(diào)至 1×107CFU/mL，將調(diào)好濃度的菌液按照菌液量分別加入0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%和0.5%的甲醛溶液，每種濃度3管，并將不同濃度的配制液放在4℃冰箱里滅活48 h，每隔6 h取100 μL均勻涂布于哥倫比亞綿羊血瓊脂培養(yǎng)基、RS瓊脂平板培養(yǎng)基及LB固體培養(yǎng)基上，同時設(shè)計不加甲醛溶液的陰性對照組。通過觀察各組細(xì)菌的生長情況，發(fā)現(xiàn)最佳滅活條件為甲醛溶液濃度0.4%，滅活時間48 h，溫度4℃。用PBS緩沖液將滅活疫苗離心清洗3次，封裝到疫苗瓶中。

1.2.2 疫苗的免疫及保護(hù)率測定將300尾健康錦鯽隨機(jī)分為2組，每組150尾，水溫24℃，養(yǎng)殖周期為49 d。分別在0、7、14、28 d，滅活組每尾腹腔注射0.2 mL的滅活疫苗，PBS組注射同等劑量PBS。

在35 d進(jìn)行攻毒試驗，將AC-CY菌液（前期試驗測定LD50= 2.51×102CFU/mL）過夜培養(yǎng)后濃度調(diào)至3×103CFU/mL，每尾注射0.2 mL，49 d時觀察死亡情況，計算相對免疫保護(hù)率（RPS）。公式：RPS=（1-免疫組死亡率/對照組死亡率）×100%[3]。

1.2.3 錦鯽血清相關(guān)免疫指標(biāo)檢測分別在免疫前（0 d），第1次免疫后（7 d），第2次免疫后（14 d）、21 d、第3次免疫后（28 d）及攻毒試驗（35 d），每組隨機(jī)選取10尾進(jìn)行麻醉后尾靜脈取血，將血清置于-80℃冰箱內(nèi)保存。利用ELISA法測定采集血清中的溶菌酶（LYS）、堿性磷酸酶（AKP）、魚補(bǔ)體4（C4）、魚補(bǔ)體3（C3）、免疫球蛋白M（IgM）含量。

1.2.4 實時熒光定量PCR的檢測分別在免疫前（0 d），第1次免疫后（7 d），第2次免疫后（14 d）、21 d、第3次免疫后（28 d）及攻毒試驗后（35 d），每組隨機(jī)選取10尾錦鯽，分別進(jìn)行麻醉采樣，采集肝臟、脾臟、腎臟、腸和腮5個組織器官。在超凈工作臺中提取RNA。取一部分RNA進(jìn)行濃度及完整性檢測，剩余RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

為評估免疫效力，試驗通過（qRT-PCR）方法測定錦鯽各組織中IL-10、IL-1β、IFN-γ和TNF-α的相對表達(dá)量，引物序列詳見表1，無cDNA模板設(shè)定作為陰性對照，參照樣品為0 d，每個樣品3個重復(fù)，內(nèi)參基因為β-actin，反應(yīng) 體 系：2×PerfertStartTMGreen qPCR SuperMix（Dye II）10 μL ，上 下 游 引 物 各0.5 μL ，cDNA 1 μL ，Nuclease-free Water 8 μL 。反應(yīng)條件：50℃2 min、95℃ 30 s、95℃ 5 s、62℃ 30 s，共40個循環(huán)[4]。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.2.5 血清殺菌活性檢測在第3次免疫后，滅活組及PBS組各隨機(jī)挑取3尾，尾靜脈麻醉后取血，分離出血清備用。將AC-CY菌株放入LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，使用PBS緩沖液洗滌3次，濃度稀釋至2×103CFU/mL后，取1 mL稀釋的菌液與0.2 mL的血清混合均勻，分別在0、1、2、3、4 h取出100 μL混合液體，均勻涂布于RS瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h。依據(jù)每個時間段培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌數(shù)，計算出每組的細(xì)菌存活指數(shù)（SI），測定各組血清殺菌水平。計算公式：

細(xì)菌存活指數(shù)（SI）=（取樣時細(xì)菌數(shù)/0 h細(xì)菌數(shù)）×100%[5]。

1.2.6 白細(xì)胞吞噬試驗將滅活組與PBS組在免疫前、第1次免疫后、第2次免疫后和第3次免疫后分別采血進(jìn)行制片并染色，使用顯微鏡觀察。隨機(jī)觀察100個白細(xì)胞，計算白細(xì)胞吞噬百分比（PP）以及白細(xì)胞吞噬指數(shù)（PI）[6]。計算公式：PP=（吞噬細(xì)菌的白細(xì)胞數(shù)/白細(xì)胞數(shù)）×100%PI=（100個白細(xì)胞吞噬的細(xì)菌總數(shù)）/100

2 結(jié)果與分析

2.1 血清免疫指標(biāo)檢測結(jié)果

由圖1可見，滅活組在第1次免疫后，AKP濃度、LYS濃度、C3濃度和C4濃度不斷上升，第2次免疫時濃度均達(dá)到此時免疫周期的峰值，21 d有所下降，第3次免疫后有所上升。在35 d攻毒試驗后，所有濃度均達(dá)到整個免疫周期的峰值。PBS組無明顯變化。

2.2 血清中IgM檢測結(jié)果

如圖2所示，經(jīng)過注射AC-CY滅活疫苗的錦鯽可產(chǎn)生IgM抗體，且抗體水平顯著（P＜0.001）高于PBS組，在第1次免疫后，其IgM抗體水平不斷上升，第2次免疫時IgM抗體水平達(dá)到免疫時期最高值，IgM抗體水平在21 d有所下降，第3次免疫后有所上升，在35 d攻毒試驗后，其IgM抗體水平達(dá)到免疫周期最高值。PBS組無明顯變化。

2.3 實時熒光定量PCR檢測結(jié)果

2.3.1 IL-1β基因相對表達(dá)量結(jié)果結(jié)果如圖3所示，在整個養(yǎng)殖周期內(nèi)滅活組IL-1β與PBS組均存在顯著性差異（P＜0.001），經(jīng)滅活疫苗接種免疫后，各臟器組織中IL-1β的相對表達(dá)水平升高，且隨著免疫次數(shù)及時間的增加，各組織的IL-1β相對表達(dá)量均有提升；其中，免疫周期內(nèi)（28 d）滅活組在14 d時腎臟表達(dá)量最高，攻毒試驗后（35 d），PBS組和試驗組的IL-1β表達(dá)量均上升，滅活組的表達(dá)量顯著高于PBS組（P＜0.001）。以上結(jié)果表明，錦鯽接種滅活疫苗能提高各組織中IL-1β的相對表達(dá)量，增強(qiáng)炎性反應(yīng)。

2.3.2 IFN-γ基因相對表達(dá)量結(jié)果結(jié)果如圖4所示，與PBS組相比，滅活組在接種疫苗后IFN-γ的表達(dá)量在各個時期均為上調(diào)。在21 d各個組織中的IFN-γ表達(dá)量均有不同程度的下降，在第3次免疫后（28 d），表達(dá)量略有提升，其在14 d腎臟中的表達(dá)量最高。攻毒后，2組IFN-γ的表達(dá)量均升高，滅活組顯著高于PBS組。

2.3.3 TNF-α基因相對表達(dá)量結(jié)果結(jié)果如圖5所示，滅活組各組織的TNF-α表達(dá)量峰值均為第2次免疫后（14 d），在各組織中表達(dá)量最高為14 d的腎臟。

2.3.4 IL-10基因相對表達(dá)量結(jié)果結(jié)果如圖6所示，各組織在免疫周期內(nèi)免疫基因IL-10的表達(dá)量在14 d均為峰值，其中腸道的表達(dá)量是各組織中最高。整個免疫周期內(nèi)，滅活組的IL-10表達(dá)量呈上升趨勢；攻毒后，2組的IL-10表達(dá)量均有所升高，滅活組顯著高于PBS組。

2.4 血清殺菌活性檢測結(jié)果

在第3次免疫（28 d）后，試驗組及PBS組隨機(jī)挑取3尾，尾靜脈麻醉后取血，同文中“1.2.5”方法收集血清。根據(jù)各時間段平板上生長的細(xì)菌數(shù)計算出每組的細(xì)菌存活指數(shù)（SI），判定各組血清殺菌水平。結(jié)果如表2所示，2組均有一定的殺菌能力，滅活組在4 h內(nèi)細(xì)菌存活指數(shù)不斷下降，最低達(dá)到37.47%；PBS組殺菌能力微弱，4 h內(nèi)的SI分別為98.57%、96.75%、93.65%、94.52%和95.43%。

表2 細(xì)菌存活指數(shù)（SI） 單位：%

2.5 白細(xì)胞吞噬試驗結(jié)果

2.5.1 白細(xì)胞吞噬百分比在顯微鏡下3次隨機(jī)記錄100個白細(xì)胞的吞噬情況，并根據(jù)計算公式計算3組平行試驗的PP平均值，試驗結(jié)果如圖7所示。在0 d時，滅活組與PBS組的PP值分別為16.96%和17.40%，2組無顯著差異，試驗組在7 d上升到28.09%，14 d達(dá)到最大值48.56%，而21 d有所下降為35.99%，28 d回升至41.01%。PBS組在期間的PP值變化不顯著。

2.5.2 白細(xì)胞吞噬指數(shù)在顯微鏡下3次隨機(jī)記錄100個白細(xì)胞的吞噬情況，并根據(jù)計算公式計算3組平行試驗的PI平均值，試驗結(jié)果如圖8所示。滅活組與PBS組的PI值分別為1.94和2.52，2組幾乎無差異。試驗組PI值在7 d上升到2.52，14 d達(dá)到最大值3.62，而21 d有所下降為2.77，28 d回升至2.95。PBS組在期間的PI值變化不顯著（P＞0.05）。

2.6 免疫保護(hù)試驗結(jié)果

在養(yǎng)殖周期35 d后，對2組錦鯽進(jìn)行攻毒試驗，49 d后，觀察死亡情況如9圖所示，攻毒后，PBS組在7 d內(nèi)全部死亡，滅活組RPS為77%。

3 討論

由于滅活疫苗具有制備工藝簡單、毒性小、效果明顯等優(yōu)點(diǎn)，是魚類最主要的商品化水產(chǎn)疫病防控疫苗，且魚類腹腔的注射方式效果也優(yōu)于口服法與浸泡法[7]。研究表明，制備滅活疫苗的甲醛濃度、滅活時間、滅活溫度對于其免疫效力影響極大，并且溫度、時間、濃度的篩選均為越小越好，這樣能最大化保留免疫抗原的效果，使免疫效果加強(qiáng)。張丹風(fēng)等[8]制備的A. hydrophila滅活疫苗的最佳溫度為4℃，此溫度下A. hydrophila的滅活效果最佳，這與本研究結(jié)果一致。而潘吉脈[9]研究的A. hydrophila滅活疫苗最佳滅活溫度為28℃，這與本研究結(jié)果不同，這可能是由于不同菌株的原因。本試驗制備的AC-CY滅活疫苗采用甲醛進(jìn)行滅活，摸索甲醛最佳制備滅活疫苗的濃度、時間及溫度后，選取甲醛溶液最終濃度為0.4%，滅活時間為48 h，溫度為4℃，可保留較好的免疫原性。

魚的免疫系統(tǒng)分為特異性免疫及非特異性免疫，其中非特異性免疫是魚抵擋外來病原菌至關(guān)重要的屏障，本試驗對滅活組錦鯽與PBS組錦鯽都進(jìn)行非特異性免疫指標(biāo)的檢測，用免疫指標(biāo)的變化評價免疫效力。LYS廣泛存在于許多生物體內(nèi)，可使病原微生物細(xì)胞壁破裂達(dá)到溶解的作用[10]；AKP參與生命的鈣、磷等代謝[11]，與生長發(fā)育密切相關(guān)，同時其濃度高低可用于肝膽等疾病的鑒別診斷[12]；C3和C4在補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑中扮演重要角色[13]；IgM在病原微生物入侵機(jī)體時，可調(diào)控體液免疫的吞噬和免疫應(yīng)答，其活力可表示機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的能力，是硬骨魚重要的免疫指標(biāo)[14]。本試驗結(jié)果表明，LYS、AKP、C3、C4和IgM的活性均有不同程度提高，AKP在攻毒試驗后血清中含量顯著升高，可能是AC-CY菌株進(jìn)入機(jī)體刺激肝臟免疫分泌大量AKP的原因，其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究；LYS、C3、C4活性的升高表明機(jī)體的非特異免疫能力被加強(qiáng)，疫苗對機(jī)體有保護(hù)作用；IgM是魚類體液反應(yīng)的特定組分，已有研究表明，注射疫苗可提升魚類各臟器組織中IgM的活力，但表達(dá)強(qiáng)度與組織器官類型相關(guān)[15]。

機(jī)體受到刺激時，組織細(xì)胞（大多為免疫細(xì)胞）會分泌多種不同的細(xì)胞因子，以加強(qiáng)機(jī)體免疫能力。當(dāng)病原體進(jìn)入機(jī)體時，早期免疫反應(yīng)為單核細(xì)胞經(jīng)刺激分泌IL-1β激活巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄TNF-α[16]。本試驗結(jié)果顯示，滅活組各組織中IL-1β、TNF-α表達(dá)水平均有顯著提升，在14 d時，腎臟IL-1β與TNF-α表達(dá)量為最高，推測AC-CY滅活疫苗作為抗原進(jìn)入機(jī)體時，首先刺激腎臟的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)。IFN-γ具有免疫調(diào)控的能力[17]。本試驗結(jié)果表明，滅活組IFN-γ表達(dá)水平在免疫周期內(nèi)迅速上升，第2次免疫后達(dá)到峰值，說明AC-CY滅活疫苗可能調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫水平，有一定的抗病毒能力。IL-10不僅參與細(xì)胞的生長與分化，同時還可調(diào)控炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)，從而抑制免疫炎癥因子過多產(chǎn)生[18]。本試驗IL-10表達(dá)水平的升高證明機(jī)體已開啟免疫保護(hù)，抑制過多的炎性因子對機(jī)體造成損傷。

免疫保護(hù)試驗的結(jié)果表明，免疫保護(hù)率為77%；血清殺菌試驗也證明血清具有一定的殺菌能力，說明AC-CY滅活疫苗在抗豚鼠氣單胞菌AC-CY感染的過程中具有良好的保護(hù)作用。

4 結(jié)論

本試驗制備的AC-CY滅活疫苗通過非特異性免疫指標(biāo)檢測和qRT-PCR檢測細(xì)胞因子等方法證明錦鯽的相關(guān)免疫指標(biāo)均提高，錦鯽機(jī)體受到AC-CY菌株侵襲時有一定保護(hù)的能力。

攻毒試驗證明，AC-CY滅活疫苗可以提高錦鯽抗豚鼠氣單胞菌AC-CY感染的能力，降低死亡率，其保護(hù)率為77%。