吳琴燕 梁紅芳 張文文 溫小林 朱建飛 徐超 莊義慶

摘要：? 選擇6-磷酸海藻糖（T6P）和海藻糖（Tre）在超高效液相色譜UPLC分離中的最佳色譜柱。對T6P和Tre在C? 18 柱、Kinetex Hilic柱、T3柱、LunaNH2柱、Cogent diamond Hydride 柱和BEH Amide 柱6種色譜柱中的色譜行為進行對比研究。結(jié)果表明，T6P和Tre在LunaNH2柱和T3柱中分離效果較好，分別建立LunaNH2柱和T3柱的UPLC-MS/MS檢測方法，其檢出限分別為 1.25～ 5.10 ?μg/L 和 ?12.75～ 15.62 ?μg/L ，定量限分別為 3.75～ 15.60 ?μg/L 和 38.25～ 52.03 ?μg/L ，回收率分別為 71.5%～ 85.7%和 82.8%～ 95.6%，相對標準差分別為 3.8%～ 8.5%和 2.7%～ 3.3%，LunaNH2柱的靈敏度高，T3色譜柱的回收率高、穩(wěn)定性好。2種色譜柱均滿足禾谷鐮刀菌中T6P和Tre同時檢測的要求。

關(guān)鍵詞：? 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜; 禾谷鐮刀菌; 6-磷酸海藻糖; 海藻糖; 色譜柱

中圖分類號：? O657.63??? 文獻標識碼： A??? 文章編號：? 1000-4440（2021）05-1299-06

Selection of chromatographic column for trehalose-6-phosphate and trehalose detection in ?Fusarium graminearum ?by UPLC-MS/MS

WU Qin-yan? 1 ， LIANG Hong-fang? 1 ， ZHANG Wen-wen? 2 ， WEN Xiao-lin? 1 ， ZHU Jian-fei? 1 ， XU Chao? 1 ， ZHUANG Yi-qing? 1，3

（1.Central Laboratory of Zhenjiang Institute of Agricultural Sciences in Hill Area of Jiangsu Province， Jurong 212009，China; 2.Zhenjiang Agricultural and Rural Bureau， Zhenjiang 212400， China; 3.Central laboratory of Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract：?? The best chromatographic column of trehalose-6-phosphate （T6P） and trehalose （Tre） in ultra-high performonce liquid chromatography（UPLC） separation was selected. The chromatographic behaviors of T6P and Tre in six kinds of chromatographic columns （C? 18 ?column， Kinetex HILIC column， T3 column， LunaNH2 column， Cogent diamond hydride column and BEH Amide column） were compared. The results showed that Amino column and T3 column were suitable for the detection of T6P and Tre according to the chromatographic retention effect. UPLC-MS/MS methods for T6P and Tre in ?Fusarium graminearum ?were established based on LunaNH2 column and T3 column， respectively. The detection limits of LunaNH2 column and T3 column were 1.25-5.10 ?μg/L ?and ?12.75- 15.62 ?μg/L ， the limits of quantification were 3.75-15.60 ?μg/L ?and 38.25-52.03 ?μg/L ， the recoveries were 71.5%-85.7% and 82.8%-95.6%， the relative standard deviations（ RSD ） were 3.8%-8.5% and 2.7%-3.3%， respectively. The method established by LunaNH2 column has high sensitivity， and the method established by T3 column has high recovery rate and good stability. LunaNH2 column and T3 column can be used for the simultaneous detection of T6P and Tre in ?Fusarium graminearum.

Key words：? ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）; ?Fusarium? graminearum ; trehalose-6-phosphate; trehalose; chromatographic column

禾谷鐮刀菌（ Fusarium graminearum ）是小麥、玉米等農(nóng)作物中最常見的病原菌? [1-5] ，該菌致病，不僅導致農(nóng)作物產(chǎn)量下降，同時產(chǎn)生嘔吐毒素，嚴重影響農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)和安全性? [6-8] 。海藻糖（Trehalose，Tre）的生物合成途徑對真菌的致病力有至關(guān)重要的作用，據(jù)報道，禾谷鐮刀菌中敲除海藻糖合成途徑的相關(guān)基因，禾谷鐮刀菌將喪失海藻糖合成能力，繼而無法產(chǎn)生孢子，嘔吐毒素合成能力下降86%? [9-10] 。6-磷酸海藻糖（Trehalose-6-phosphate，T6P）是Tre生物合成的中間體，是植物和真菌中必不可少的信號代謝物? [11-14] ，對禾谷鐮刀菌中T6P和Tre進行定量檢測，可以為禾谷鐮刀菌生長和海藻糖合成途徑研究提供支撐。

Tre屬于糖類化合物，有較為成熟的檢測方法。T6P屬于酸性強糖，在微生物中含量極低，目前主要采用氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）? [10] 和液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）? [15-16] ?2種方法檢測，GC-MS需要衍生反應(yīng)，前處理復(fù)雜，檢測時間長，LC-MS檢測時間短，樣品前處理簡單，但主要采用單級桿質(zhì)譜掃描，母離子定性和定量檢測，假陽性概率較大? [17] 。另外，由于T6P具有強酸性質(zhì)，為強極性難保留和難分離的化合物，需采用親水模式分離，對色譜柱要求較高，據(jù)報道Dionex IonPac AS11-HC column ?（250.0 mm× 2.0 mm，9.0 μm）? ?[16] 、SIELC Primesep SB column ?（4.6 mm× 150.0 mm，5.0 μm）? ?[17] ?、Waters Acquity BEH amide column ?（3.0 mm× 100.0 mm，1.7 μm）? ?[15] 、 ZIC-HILIC HPLC column ?（2.1 mm× 150.0 mm，3.5 μm） ??[18] 和AQUITY UPLC BEH C18 ?（2.1 mm× 50.0 mm，1.7 μm） ??[19] 均可用于檢測磷酸糖，除Waters Acquity BEH amide column可以達到較大的分離度，具有較好的分離效果，其他色譜柱均不同程度存在分離度低、色譜響應(yīng)值低、色譜峰拖尾、色譜柱使用壽命短等問題。本研究根據(jù)T6P的強極性親水性質(zhì)，重新對色譜柱進行篩查，選擇合適的色譜柱，并建立同時檢測禾谷鐮刀菌中的T6P和Tre的UPLC-MS/MS方法。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 型UPLC系統(tǒng)，ABsciex 4500質(zhì)譜檢測器，電子天平（XP105DR 型，賽多利斯科學儀器有限公司產(chǎn)品），AWL-020I-P型超純水系統(tǒng)（艾科浦儀器有限公司產(chǎn)品），KQ-250E 型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司產(chǎn)品），H2050R型醫(yī)用離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品），DW-86L828J型超低溫冰箱（海爾生物醫(yī)療股份有限公司產(chǎn)品），渦旋混勻器（江蘇海門其林貝爾儀器有限公司產(chǎn)品）。

甲醇和乙腈（色譜純，美國默克公司產(chǎn)品），乙酸銨（ 純度≥ 98%，德國CNW 公司產(chǎn)品）。T6P和Tre購自sigma-aldrich貿(mào)易有限公司，質(zhì)譜用水為屈臣氏蒸餾水。

1.2 分析條件

色譜柱： Agilent C18色譜柱 （50.0 mm× 2.1 mm，1.7 μm）、Phenomenex，Kinetex Hilic 色譜柱 ?（100.0 mm× 2.1 mm，1.7 μm）、Waters Acquity UPLC HSS T3 Column ?（100.0 mm× 3.0 mm，1.7 μm）、Phenomenex lunaNH2 100（100.0 mm× 2.0 mm，3.0 μm）、Cogent diamond Hydride 色譜柱 ?（150.0 mm× 2.1 mm，2.2 μm ）和ACQUITY UPLC BEH Amide ?（2.1 mm× 100.0 mm，1.7 μm），柱溫40 ℃，進樣體積1 μl，流動相、洗脫梯度和流速根據(jù)色譜柱特性確定。

離子源：電噴霧離子源;掃描方式：負離子切換掃描;檢測方式：質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）;氣簾氣壓力：40 kPa;電噴霧電壓： -4 500 kPa ;離子源溫度：550 ℃;霧化氣壓力：65 kPa;加熱輔助氣壓力：65 kPa;駐留時間： 40 ms。其他優(yōu)化的質(zhì)譜條件見表1。

1.3 樣品制備

將供試PH-1禾谷鐮刀菌（由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院食品質(zhì)量安全檢測研究所提供）置于綠豆湯液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、140 ?r/min 條件下培養(yǎng)7 d，過濾去除菌絲后，離心濃縮成為1 ml ?1× 10? 5 個的孢子液備用。將孢子液接種于馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，每瓶接種1 ml，28 ℃、140 ?r/min 震蕩培養(yǎng)7 d后，過濾取菌絲，采用去離子水清洗3次后，烘干， -20 ℃ 儲存待測。

準確稱取菌絲樣品0.04 g于15 ml離心管中，加入4 ml去離子水，浸泡1 h后，采用高速勻漿機（上海滬析實業(yè)有限公司產(chǎn)品）勻漿，加入4 ml甲醇后， -80 ℃ 冷凍，用超聲波清洗機（南京先歐儀器制造有限公司產(chǎn)品）超聲解凍破壁30 min，離心，取上清液，待測。

1.4 測定指標

1.4.1 線性范圍? Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱檢測時，T6P的質(zhì)量濃度為31.25 ?μg/L 、62.50 ?μg/L 、125.00 ?μg/L 、250.00 ?μg/L 、500.00 ?μg/L 、 1 000.00 ??μg/L ，Tre的質(zhì)量濃度為3.9 ?μg/L 、7.8 ?μg/L 、15.6 ?μg/L 、31.3 ?μg/L 、62.5 ?μg/L 、125.0 ?μg/L 、250.0 ?μg/L ;Phenomenex lunaNH2柱檢測時，T6P和Tre的質(zhì)量濃度均為3.9 ?μg/L 、7.8 ?μg/L 、15.6 ?μg/L 、31.3 ?μg/L 、62.5 ?μg/L 、125.0 ?μg/L 、250.0 ?μg/L ，按照優(yōu)化后的色譜條件，對每個點重復(fù)測定3次。以質(zhì)量濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，以標準曲線的第一個和最后一個點的質(zhì)量濃度作為線性范圍。

1.4.2 檢出限與定量限? 考慮儀器的背景噪音，采用基線噪音分析方法，取標準曲線最低質(zhì)量濃度試樣測出的信號與噪聲信號進行比較，將信噪比 3∶ 1時相應(yīng)的質(zhì)量濃度確定為檢出限，將信噪比 10∶ 1時相應(yīng)的質(zhì)量濃度確定為定量限? [20] 。

1.4.3 準確度與精密度? 分別在試樣中加入T6P和Tre的標準工作液，在重復(fù)性測定條件下對每個添加質(zhì)量濃度測定6次，計算回收率和相對標準偏差（ RSD ）?；厥?率=（ 實際濃 度- 試樣原始濃 度）/ 標樣濃 度× 100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 T6P色譜柱的篩選

T6P具有親水性，為強酸性糖，極性較強。色譜柱需同時適合檢測糖類和強極性物質(zhì)。未經(jīng)過衍生分離糖類的常用色譜柱有氨基柱和酰胺柱，這些類型的色譜柱穩(wěn)定性、壽命以及分離重現(xiàn)性等方面性能均不佳? [21-22] ;Phenomenex，Kinetex Hilic柱采用強極性材料作為固定相，能對極性物質(zhì)產(chǎn)生氫鍵、靜電作用，表現(xiàn)出較強的保留特性，適合極性和親水化合物的檢測? [23] ;Cogent diamond Hydride 親水柱適合糖類、有機酸等高級化合物，是MicroSolv公司推薦的專用磷酸糖分離色譜柱。Agilent C18柱為疏水反向色譜柱，極性較強的樣品保留較弱，但蔣衛(wèi)杰等? [19] 利用C18柱實現(xiàn)了T6P的色譜分離;Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱采用三官能團鍵合和封端技術(shù)，可以耐受100%水相，對極性化合物有良好的保留。本研究考慮到T6P的親水性質(zhì)，并參考文獻 [15]～[19] ?，篩選出如表2所示的6種不同類型的色譜柱進行T6P的測定。

根據(jù)表2中色譜柱不同的分離機理，選擇適合T6P分離的色譜柱的流動相和檢測條件，比較T6P在6種色譜柱上的保留情況，如表3所示，采用Hilic柱和Diamond -Hydride柱時，T6P未出峰，說明磷酸糖極性太強，在Hilic和Diamond -Hydride色譜柱上出現(xiàn)強保留，這2種色譜柱不適合T6P的檢測。 Amide柱檢測柱壓大，T6P的色譜峰嚴重拖尾，色譜柱使用200個樣品后，T6P出現(xiàn)強保留，該色譜柱無法繼續(xù)用于檢測T6P，磷酸基團對Amide柱損耗較大。C18柱的T6P保留較弱，T6P在2 min左右無規(guī)則流出，與檢測原理相符，疏水反向色譜柱不適合極性物質(zhì)分離。LunaNH2柱和T3柱，T6P的保留效果較好，50 ?μg/L 的T6P通過LunaNH2柱檢測響應(yīng)強度約為 3.5× 10? 4? cps，而1 000 ?μg/L 的T6P利用T3柱檢測時響應(yīng)值只有 1× 10? 4? cps，T6P利用T3色譜柱檢測響應(yīng)強度遠低于LunaNH2柱（圖1）;Tre利用LunaNH2柱和T3柱這2種色譜柱檢測時，響應(yīng)值無顯著差異（圖2）。

2.2 色譜質(zhì)譜中流動相的優(yōu)化

質(zhì)譜檢測過程中水相含量高，不利于液滴霧化和脫溶劑化，通常需要降低流速，增加脫溶劑化氣流和溫度，來獲得較好的離子化效率。本研究中，在脫溶劑化氣流和溫度較高的情況下，T3柱采用了100%的水相影響了T6P的離子化效率，是其檢測響應(yīng)強度遠低于LunaNH2柱的主要原因，降低流速使T6P色譜峰拖尾嚴重，因此考慮在流動相中添加氨水，可以適當?shù)脑鰪婋x子化效率。本研究使用0.01%氨水為水相，發(fā)現(xiàn)T6P的響應(yīng)提高了10倍 （圖3），但是其響應(yīng)值仍遠低于LunaNH2柱。T3色譜柱的pH適應(yīng)范圍為 2～ 8，水相中加入0.01%氨水后，pH值接近8，靠近T3柱的極限值，但其使用壽命仍遠長于LunaNH2柱。LunaNH2柱的氨基容易流失，造成柱效下降， 1根色譜柱檢測磷酸糖平均壽命為 200～ 300個樣品，T3柱使用壽命長，響應(yīng)值較低，因此需綜合考慮檢測成本、樣品中T6P的含量，選擇合適的色譜柱進行測定。

2.3 線性范圍與檢出限

如表4所示，T6P和Tre通過LunaNH2柱時，在 4.25～ 250.00 ?μg/L 的線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，通過T3柱時在 31.25～? 1 000.00 ??μg/L 的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系;另外，通過LunaNH2柱的檢出限為 1.25～ 5.10 μg/L ，遠低于T3柱（ 12.75～ 15.63 ?μg/L ）;LunaNH2柱的定量限為 3.75～ 15.60 ?μg/L ，也低于T3柱（ 38.25～ 52.03 ?μg/L ），LunaNH2柱的靈敏度高于T3柱，2種色譜柱的決定系數(shù)均在0.99以上，均符合實際分析的要求。

2.4 回收率和精密度

準確稱取禾谷鐮刀菌40 mg，添加一定質(zhì)量濃度的標準品溶液后，每個質(zhì)量濃度4次重復(fù)，計算該方法的回收率和相對標準差，結(jié)果 （表5） 表明，利用LunaNH2和T3 2種色譜柱，在3個加標水平下，T6P的回收率分別為 71.5%～ 85.7%和 83.7%～ 95.6%，相對標準差為 3.8%～ 6.2%和 2.7%～ 3.3%;Tre的回收率分別為 72.4%～ 82.3%和 82.8%～ 84.8%，相對標準差為 4.5%～ 8.5%和 2.8%～ 3.2%;與LunaNH2柱相比， T3柱的回收率高，相對標準差低，說明T3柱的穩(wěn)定性優(yōu)于LunaNH2柱。利用LunaNH2和T3 2種色譜柱檢測出禾谷鐮刀菌pH-1中T6P含量分別為52.6 ?μg/g 和60.5 ?μg/g ，Tre含量為4.4 ?mg/g 和5.4 ?mg/g ，2種色譜柱檢測禾谷鐮刀菌pH-1中T6P和Tre含量無顯著差異，均可用于檢測禾谷鐮刀菌pH-1中T6P和Tre含量。

3 結(jié) 論

本研究根據(jù)T6P的親水性和強極性特點，對6種不同類型色譜柱進行篩查，確定了Luna NH2柱和T3柱同時適合T6P和Tre 2種化合物UPLC-MS/MS檢測，分別建立利用2種色譜柱同時檢測禾谷鐮刀菌中T6P和Tre的方法，發(fā)現(xiàn)Luna NH2柱的靈敏度高，T3柱的回收率高、穩(wěn)定性好。利用2種色譜柱檢測出禾谷鐮刀菌pH-1中T6P含量分別為52.6 μg/g 和60.5 μg/g ，Tre含量分別為4.4 mg/g 和5.4 ?mg/g ，均差異不顯著。該方法也可以被借鑒于其他真菌的相關(guān)研究和應(yīng)用中。

致謝：? 感謝江蘇省農(nóng)業(yè)科學院中心實驗室楊丹主任對樣品檢測提供的幫助！

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（責任編輯：陳海霞）