車紅兵，蔡永占，何鵬飛，吳毅歆，何鵬搏，趙崇鈞，孔寶華**，何月秋**

(1.云南農(nóng)業(yè)大學，云南 昆明 650201；2.云南省煙草公司 曲靖市公司，云南 曲靖 655000；3.云南省微生物發(fā)酵工程研究中心有限公司，云南 昆明 650107)

我國是第一大煙草生產(chǎn)國，煙葉產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的30%，但煙草由病蟲害造成的損失達10%～15%[1]。煙草病蟲害主要是依靠化學農(nóng)藥控制的，但化學農(nóng)藥防治存在農(nóng)藥殘留、病蟲易產(chǎn)生抗性等缺點，同時易降低煙葉品質(zhì)，破壞生態(tài)環(huán)境，影響人類健康。寧南霉素是中國科學院成都生物研究所從四川省寧南縣土壤分離到諾爾斯鏈霉菌西昌變種(Streptomycesnourseivar.xichangensis)發(fā)酵產(chǎn)物中分離到的一種抗生素，它已被登記為煙草花葉病毒病、番茄病毒病、辣椒病毒病、水稻立枯病、大豆根腐病、水稻條紋葉枯病、蘋果斑點落葉病、黃瓜白粉病等病害抗生素。生物防治因安全性好而成為病蟲害防治研究的熱點[2-3]。植物有益內(nèi)生細菌能夠促進宿主植物的生長，提高宿主植物的抗病蟲害能力，增強宿主植物的抗逆性[4]，已被用作生物防治的主要資源。如煙草內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌YN201732(BacillusamyloliquefaciensYN201732，下稱Y32)，它能夠很好地防治煙草白粉病以及促進植物生長[5-6]。化學農(nóng)藥和抗生素在病蟲害防控中發(fā)揮了重要作用，但它們可能同時影響了植物有益內(nèi)生菌數(shù)量與種群結構，使植株處在農(nóng)藥單一的保護之下，從而弱化了內(nèi)生菌功能。為了證明這一假設，本文采用16S rDNA高通量測序技術，測定了寧南霉素對煙草內(nèi)生菌群落結構的影響，以期從微生態(tài)的角度證明生物防治的可行性，為避免濫用化學農(nóng)藥和抗生素類農(nóng)藥造成對活菌生物防治負面影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

K326煙苗，由云南省微生物發(fā)酵工程研究中心有限公司提供，于移栽后90 d開始試驗。10%寧南霉素可濕性粉劑(WP)由德強生物股份有限公司生產(chǎn)。Y32和其綠色熒光標記菌株YN32-P43GFPmut3a(下稱Y32GFP)為本實驗室保存菌株。

1.2 材料的預處理

菌株發(fā)酵液的制備：將保存的Y32和YN32GFP接種于無菌LB培養(yǎng)液中，在37 ℃、160 r/min恒溫搖床中培養(yǎng)3 d，用0.2%吐溫制成濃度為107cfu/mL的發(fā)酵液，備用。

1.3 試驗方法

試驗共設置7個處理，即a為噴施Y32GFP發(fā)酵液；b為噴施Y32發(fā)酵液(Y32WT)；c為噴施10%寧南霉素WP(N)；d為先噴Y32GFP發(fā)酵液，24 h后再噴施10%寧南霉素WP(Y32GFPN)；e為先噴10%寧南霉素WP，24 h后再噴施Y32GFP發(fā)酵液(N32GFP)；f為噴施液體LB(LB)；g為噴施清水(W-CK)。每處理重復3次，每個重復3株苗，共計63株。

分別在處理后第1天(2020年9月5日)取樣，樣品編號為：W-CK-5、LB-5、Y32WT-5、Y32GFP-5、N-5、Y32GFPN-5、N32GFP-5；第3天(2020年9月7日)取樣，樣品編號為：W-CK-7、LB-7、Y32WT-7、Y32GFP-7、N-7、Y32GFPN-7、N32GFP-7；第5天(2020年9月10日)取樣，樣品編號為：W-CK-10、LB-10、Y32WT-10、Y32GFP-10、N-10、Y32GFPN-10、N32GFP-10。用滅菌剪刀從各處理植株相同部位剪取葉片，75%酒精表面消毒，無菌水沖洗后裝于自封袋中，液氮速凍，干冰寄送至廣州基迪奧生物公司做內(nèi)生菌高通量測序。

從樣本中提取基因組DNA后，用帶有barcode的特異引物擴增16S rDNA的V5～V7區(qū)。引物序列為：799F：AACMGGATTAGATACCCKG；1193R：ACGTCATCCCCACCTTCC。將純化后的擴增產(chǎn)物(即擴增子)連接測序接頭，構建測序文庫，于Illumina平臺 PE250上機測序。

2 結果與分析

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控

本次試驗樣品細菌測序共獲得高質(zhì)量序列7204478條，其中最大序列長度 474 bp，最短序列長度 201 bp。本次實驗的序列具有較高的完整性，數(shù)據(jù)有效性好，可以用于本次樣品細菌群落分析。

2.2 Alpha多樣性分析

用序列數(shù)和Shannon指數(shù)構建樣本的稀釋曲線，用于驗證測序數(shù)據(jù)量是否足夠反映樣本的內(nèi)生菌群信息。隨著序列數(shù)的增加，各樣本曲線都逐漸變得平坦，即使再增加測序數(shù)量也只會產(chǎn)生很少新的OTUs，說明測序數(shù)據(jù)量較為合理，能夠反映煙草葉片樣本中絕大多數(shù)的內(nèi)生菌群信息。

本次測序所有樣品的覆蓋度指數(shù)均大于0.99，表明測序結果能準確地反映煙草葉片中實際的細菌菌群(表1)。各樣品的Alpha多樣性指數(shù)(Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)、Ace指數(shù)和Chao1指數(shù))中，Shannon和Simpson指數(shù)表示物種多樣性，Shannon指數(shù)數(shù)值越大表示物種多樣性越高；Simpson指數(shù)數(shù)值越大或越小表示物種多樣性越高，其計算公式為1-∑(Pi)2。Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)表示物種豐富度，其數(shù)值越大表示物種豐富度越高。

表1 煙草內(nèi)生細菌多樣性指數(shù)分析結果

在第1天所取樣品中，只噴施Y32發(fā)酵液處理(Y32WT-5)的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)分別為0.76±0.002和2.25±0.01，均大于只噴施寧南霉素(N-5)處理的0.10±0.05和0.39±0.14，大于先噴施寧南霉素，24 h后再噴施Y32GFP發(fā)酵液(N32GFP-5)處理的0.53±0.24和2.20±1.51，大于先噴施Y32GFP發(fā)酵液，24 h后再噴施寧南霉素(Y32GFPN-5)處理的0.16±0.17和0.64±0.58，大于清水對照(W-CK-5)的0.31±0.28和1.06±0.87。在第5天所取樣品中，只噴施Y32發(fā)酵液處理(Y32WT-10)的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)分別為0.77±0.01和2.28±0.11，大于只噴施寧南霉素(N-10)處理的0.41±0.25和1.14±0.57，大于先噴施寧南霉素，24 h后再噴施Y32GFP發(fā)酵液(N32GFP-10)處理的0.40±0.26和1.10±0.62，大于先噴施Y32GFP發(fā)酵液,24 h后再噴施寧南霉素(Y32GFPN-10)處理的0.23±0.12和0.79±0.33，大于清水對照(W-CK-10)的0.60±0.09和1.82±0.31。綜上所述，在第1天所取樣品和第5天所取樣品中，只噴施Y32發(fā)酵液的處理(Y32WT-5和Y32WT-10)，其物種多樣性高于只噴施寧南霉素(N-5和N-10)，先噴施寧南霉素，24 h后再噴施Y32GFP發(fā)酵液(N32GFP-5和N32GFP-10)，先噴施Y32GFP發(fā)酵液，24 h后再噴施寧南霉素(Y32GFPN-5和Y32GFPN-10)和清水對照(W-CK-5、W-CK-10)等處理，說明寧南霉素會降低煙草葉片內(nèi)生細菌多樣性，而生防菌Y32發(fā)酵液能夠提高煙草葉片內(nèi)生細菌的物種多樣性。

在所有樣品中，只噴施Y32發(fā)酵液的處理(Y32WT-5、Y32WT-7、Y32WT-10)，第1天所取樣品的Simpson指數(shù)為0.76±0.002，大于第3天所取樣品的Simpson指數(shù)0.61±0.34，小于第5天所取樣品的Simpson指數(shù)0.77±0.01；Shannon指數(shù)的變化規(guī)律與Simpson指數(shù)相同。只噴施Y32GFP發(fā)酵液的處理(Y32GFP-5、Y32GFP-7和Y32GFP-10)也呈現(xiàn)上述規(guī)律。而只噴施寧南霉素的處理(N-5、N-7和N-10)第1天所取樣品的Simpson指數(shù)為0.10±0.05，第3天所取樣品的Simpson指數(shù)為0.77±0.04，第5天所取樣品的Simpson指數(shù)為0.41±0.25；先噴施Y32GFP發(fā)酵液，24 h后再噴施寧南霉素(Y32GFPN-5、Y32GFPN-7、Y32GFPN-10)的處理，第1天所取樣品的Simpson指數(shù)為0.16±0.17，第3天所取樣品的Simpson指數(shù)為0.53±0.40，第5天所取樣品的Simpson指數(shù)為0.23±0.12；先噴施寧南霉素，24 h后再噴施Y32GFP發(fā)酵液(N32GFP-5、N32GFP-7、N32GFP-10)的處理，第1天所取樣品的Simpson指數(shù)為0.53±0.24，第3天所取樣品的Simpson指數(shù)為0.75±0.06，第5天所取樣品的Simpson指數(shù)為0.40±0.26，通過數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)它們的Simpson指數(shù)都隨時間呈先上升后下降趨勢；Shannon指數(shù)的變化規(guī)律與Simpson指數(shù)相同。綜上所述，只噴施寧南霉素的處理(N-5、N-7和N-10)與寧南霉素和Y32GFP發(fā)酵液不同先后噴施組合處理(Y32GFPN-5、Y32GFPN-7、Y32GFPN-10、N32GFP-5、N32GFP-7和N32GFP-10)，其物種多樣性隨時間呈先上升后下降趨勢，這一結果進一步證明生防菌能夠提高煙草葉片內(nèi)生細菌的物種多樣性，同時也證明寧南霉素會降低煙草葉片內(nèi)生細菌的物種多樣性。

從Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)來看，其變化規(guī)律基本與Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)相似，即寧南霉素會降低煙草葉片內(nèi)生菌的物種豐富度(表1)。

2.3 內(nèi)生細菌群落組成

在屬分類水平上，對相對豐度進行排名，生成物種相對豐度表(表2)。所有樣品中優(yōu)勢細菌屬均為泛菌屬(Pantoea)、沙雷氏菌屬(Serratia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單孢菌屬(Pseudomonas)，它們的相對豐度之和大于80%。先噴施Y32GFP，發(fā)酵液，24 h后再噴施寧南霉素的處理(Y32GFPN-5、Y32GFPN-7和Y32GFPN-10)中芽孢桿菌屬的相對豐度高于先噴施寧南霉素，24 h后再噴施Y32GFP發(fā)酵液的處理(N32GFP-5、N32GFP-7和N32GFP-10)；隨著時間的延長，芽孢桿菌屬的相對豐度逐漸下降，但始終是先噴施Y32GFP發(fā)酵液，24 h后再噴施寧南霉素的處理(Y32GFPN-5、Y32GFPN-7和Y32GFPN-10)中芽孢桿菌屬的相對豐度高于先噴施寧南霉素，24 h后再噴施Y32GFP發(fā)酵液的處理(N32GFP-5、N32GFP-7和N32GFP-10)，表明寧南霉素殘存對施入的Y32GFP及煙草內(nèi)生細菌有負面影響。只噴施寧南霉素的處理(N-5、N-7和N-10)中內(nèi)生細菌種類及相對豐度均低于其他處理，而且隨著時間的延長，其內(nèi)生優(yōu)勢菌屬細菌的相對豐度下降較快，這影響了煙草葉片內(nèi)生菌群的平衡，不利于煙株生長及抵抗病蟲害侵襲，進一步說明寧南霉素對施入的Y32GFP及煙草內(nèi)生菌有影響。從第1天所取樣品來看，在噴施Y32發(fā)酵液、Y32GFP發(fā)酵液和寧南霉素組合的處理中，雖然芽孢桿菌屬的相對豐度較高(這主要是由于噴施了生防菌Y32GFP)，但幾乎沒有或很少對其他煙草內(nèi)生菌產(chǎn)生影響。

2.4 Beta多樣性分析

基于unweighted unifrac距離的PCoA分析煙草葉片內(nèi)生細菌群落組成的結果(圖1)顯示，在屬水平，第1主成分PCo1和第2主成分PCo2對樣品的貢獻率分別為44.43%、8.85%，它們是影響煙草葉片內(nèi)生細菌群落結構的主要因素，且PCo1的貢獻率顯著大于PCo2。在所有樣品中，由于PCo2的作用Y32WT-5和Y32GFPN-7間距離較近，細菌群落組成相似，其余樣品均表現(xiàn)為在PCo1作用下第3天所取樣品和第5天所取樣品距離較近，細菌群落組成相似，均與第1天所取樣品距離較遠，細菌群落組成差異較大。同一時間不同處理，第1天所取樣品，在PCo2作用下分為上下兩組，除Y32GFP-5和Y32GFPN-5距離較近外，其相鄰處理間距離均相差不大。第3天所取樣品和第5天所取樣品N32GFP-7和LB-10聚在一起，細菌群落組成差異較??；Y32GFP-10和W-CK-10及W-CK-7聚在一起，細菌群落組成差異較?。黄溆嗵幚砭墼谝黄稹?/p>

圖1 在屬水平上煙草葉片內(nèi)生細菌主坐標分析結果

利用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)Pathway數(shù)據(jù)庫，即代謝通路數(shù)據(jù)庫，比對煙草葉片樣品內(nèi)生細菌 OTU對應的基因，進行PICRUSt2基因預測。結果(圖2、圖3)顯示，第1天、第3天、第5天所取樣品中，在處理Y32GFPN-5、Y32GFPN-7和Y32GFPN-10中新陳代謝、遺傳信息處理和細胞過程的相對豐度始終高于N32GFP-5、N32GFP-7和N32GFP-10處理。第1天和第3天所取樣品中，Y32GFP-5和Y32GFP-7處理的新陳代謝和遺傳信息的處理相對豐度高于N-5、N-7處理、N32GFP-5和N32GFP-7的處理。說明Y32GFP發(fā)酵液能夠有效提高煙草葉片生命代謝活動，加快生命進程，這有利于植物生長、增產(chǎn)，也可能是由于生防菌Y32激活了煙草系統(tǒng)抗性。

表2 煙草葉片內(nèi)生細菌在屬水平上的相對豐度

圖2 在OTU水平上煙草葉片內(nèi)生細菌KEGG代謝通路的相對豐度

圖3 在OTU水平上煙草葉片內(nèi)生細菌功能的分類

3 討論

農(nóng)藥是防治植物病蟲害的最有力武器。大量使用或者濫用農(nóng)藥其副作用明顯，如破壞環(huán)境、引起抗性病蟲的出現(xiàn)、影響植物內(nèi)生細菌群落結構，以及危害人體健康。本研究以寧南霉素為例，證明了廣譜殺菌劑影響植物內(nèi)生細菌物種的多樣性。所得結果表明，只噴施生防內(nèi)生菌Y32GFP發(fā)酵液的處理，其物種多樣性高于只噴施寧南霉素、先噴施寧南霉素，24 h后再噴施Y32GFP發(fā)酵液、先噴施Y32GFP發(fā)酵液，24 h后再噴施寧南霉素和清水對照等，這說明生防菌能夠提高煙草葉片內(nèi)生細菌的物種多樣性和豐度，寧南霉素會降低煙草葉片內(nèi)生細菌的物種多樣性和豐度。

在先噴施Y32GFP發(fā)酵液，24 h后再噴施寧南霉素的處理中，其新陳代謝、遺傳信息處理和細胞過程的相對豐度始終高于先噴施寧南霉素，24 h后再噴施Y32GFP發(fā)酵液處理，說明大量植物內(nèi)生菌與根圍促生菌能誘導植物獲得系統(tǒng)抗性[7]。此外，在煙草葉片中還發(fā)現(xiàn)了泛菌屬、沙雷氏菌屬、芽孢桿菌屬和假單胞菌屬等有益細菌。傅蕾等[8]發(fā)現(xiàn)泛菌屬(Pantoea)菌株PP04在100 mmol/L鹽脅迫下對雜交狼尾草具有明顯的促生作用與效果，且可通過緩解氧化脅迫對植物造成的損傷，顯著提高植物對鹽脅迫的耐受性。沙雷氏菌屬細菌因具有對昆蟲的高致病性和對害蟲生物防治的巨大潛力而受到國內(nèi)外學者的廣泛關注。已有研究表明，粘質(zhì)沙雷氏菌可感染煙青蟲[9]、蚜蟲[10]、白蟻[11]、蝗蟲[12]、天牛[13]、紅棕象甲[14]、黃曲條跳甲[15]等多種害蟲，是一類重要的昆蟲病原細菌。假單胞菌屬中的熒光假單胞菌對煙草黑脛病具有生防作用，惡臭假單胞菌有耐金屬作用[16-17]，也就是說植物內(nèi)生菌參與了植物生存的各個方面，并發(fā)揮著重要作用；僅用化學農(nóng)藥或者植物生化農(nóng)藥(抗生素等)，不僅降低了植物內(nèi)生菌多樣性，弱化了有益內(nèi)生菌的功能，打破了植物內(nèi)生菌群平衡，導致植物抗逆性及抗病蟲害能力下降，而且污染環(huán)境、危害人體健康。因此，在實際應用這些農(nóng)藥產(chǎn)品時，除考慮效果、農(nóng)產(chǎn)品安全、環(huán)境友好外，還要關注它們對植物內(nèi)生菌多樣性的影響。