燕 婧,馮 蕓,李 丹,高 藝,張 靜

(延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院,陜西 延安 716000)

微小RNA(microRNAs,miRNA)在1981年通過秀麗隱桿線蟲的遺傳篩選被首次鑒定出來[1]，在1993年由Lee等[2]進(jìn)行了分子鑒定,并且很快被人們意識到其在植物和動物生物學(xué)的各個方面都有具有高度保守機(jī)制和廣泛的功能學(xué)意義。miRNA是一類平均長度為20～23個核苷酸的非編碼小分子RNA，其廣泛存在于真核細(xì)胞生物中的,來源于帶有一個或多個局部發(fā)夾的較長的初級轉(zhuǎn)錄本(pre-miRNA)，這些發(fā)夾被RNA裂解酶(Dicer酶)進(jìn)一步加工成熟miRNA[3]。目前研究表明，miRNA的主要功能是通過結(jié)合目標(biāo)mRNA的3’UTR的互補(bǔ)序列來調(diào)節(jié)蛋白的翻譯，從而負(fù)向調(diào)節(jié)mRNA的翻譯[4]，進(jìn)一步參與腫瘤發(fā)生發(fā)展中的增殖、凋亡、黏附等各種生物學(xué)功能[5]。根據(jù)GLOBOCAN 2020統(tǒng)計(jì)，胰腺癌致死率極高，在世界范圍內(nèi)約有496 000例新發(fā)病例和466 000例死亡病例[6]。預(yù)測至2025年，胰腺癌將成為癌癥死亡的第三大原因[7]。目前，作為一種毀滅性的惡性腫瘤，胰腺癌可選擇的有效治療方法有限，手術(shù)切除或中醫(yī)調(diào)理是目前為數(shù)不多的保守治療的方法[8]。miR-185在腫瘤中也具有重要意義，有研究發(fā)現(xiàn)，其在胃癌[9]、乳腺癌[10]、肺癌[11]等腫瘤中都具有抑癌作用。此外也有研究報(bào)道m(xù)iR-185在乙肝纖維化中表達(dá)上調(diào)，通過靶向SREBF1促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。在本課題中我們首先成功構(gòu)建了miR-185-5p的特異性過表達(dá)載體。同時測定其在人胰腺癌Panc-1細(xì)胞系中的表達(dá)活性與效率，通過研究miR-185-5p對Panc-1細(xì)胞增殖活力的影響，為日后研究miR-185-5p在胰腺癌中的作用機(jī)制提供了新的認(rèn)識。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本研究中的人胰腺癌Panc-1細(xì)胞以及Topl0菌株由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供；氨芐青霉素(Amp)來自新泰生物公司；從TaKaRa公司購買了酶切和鏈接所用的限制性內(nèi)切酶EcoR I、Hind Ⅲ及T4DNA連接酶；真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR從美國英杰生命技術(shù)有限公司購買。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 miR-185-5p寡聚核苷酸合成。設(shè)計(jì)序列：首先在miRbase網(wǎng)站中查找miRNA-185-5p的成熟體序列，然后在該序列兩端插入兩個酶切位點(diǎn)Hind Ⅲ和EcoR I。序列如下：Topoligo：5’-AATTCAGGGGGC-GAGGGATTGGAGAGAAAGGCAGTTCCTGATGG-TCCCCTCCCCAGGGGCTGGCTTTCCTCTGGTCC-TTCCCTCCCAA-3’；Bo-ttomoligo：5’-AGCTTTGGGAGGGAAGGACCAGAGGAAAGCCAGCCCC-TGGGGAGGGGACCATCAGGAACTGCCTTTCT-CTCCAATCCCTCGCCCCCTG-3’，設(shè)計(jì)完成后由西安擎科生物科技有限公司進(jìn)行合成。

1.2.2 真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定。雙酶切：根據(jù)真核表達(dá)載體質(zhì)粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR，選取Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ在目的序列的兩端加入酶切位點(diǎn)序列，形成粘性末端；進(jìn)行膠回收；連接：用T4DNA連接酶將回收產(chǎn)物與進(jìn)行退火后的雙鏈miR-185-5p DNA序列置于16 ℃過夜連接；轉(zhuǎn)化：用E.Coli Top10(即Top10感受態(tài)大腸桿菌)；選擇培養(yǎng)：采用氨芐青霉素(Amp+)對重組子進(jìn)行選擇性培養(yǎng)；搖菌：選擇單克隆菌落，挑取放在LB(Amp+)液體培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)12～16 h后；測序：選擎科生物科技公司進(jìn)行測序。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)。將人胰腺癌Panc-1細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)基(PAA Laboratories)中(含10%胎牛血清)，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)期間換液頻率為2～3 d/次。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染設(shè)置為兩組：首先在6孔板中接種Panc-1細(xì)胞，待其在對數(shù)生長期時，轉(zhuǎn)染對照組空載體(pcDNATM 6.2)和實(shí)驗(yàn)組pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-miR-185-5p表達(dá)載體。

1.2.5 實(shí)時定量PCR(qRT-RCR) 。首先提取總RNA，使用Trizol裂解液裂解Panc-1細(xì)胞，后將RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，使用PCR試劑盒Hieff@Qpcr SYBR@Green Master Mix (上海翊圣生物科技有限公司)在iQ5 Optical real-time PCR system machine (Bio-Rad,USA)上進(jìn)行實(shí)時定量PCR。逆轉(zhuǎn)錄和PCR引物序列如下：miR-185-5p RT-primer：5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGA-CTCAGGAA-3’；miR-185-5p Forward-primer：5’-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3’； miR-185-5p Rev-erse-primer：5’-TGCTTGGAGAGAAAGGCAG-3’；U6-Forward-primer：5’-GCTTCGGCAGCACATAT-ACTAAAAT-3’；U6 Reverse-primer：5’-CGCTTCA-CGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.2.6 CCK8試驗(yàn)。使用CCK8試劑盒(Fudebio-tech，杭州，中國)測定miR-185-5p對Panc-1細(xì)胞增殖的影響。 首先在96孔板中接種Panc-1細(xì)胞，接種密度為3000個/孔。 轉(zhuǎn)染后分別在24、48、72 h進(jìn)行檢測，將10 μl CCK8試劑添加到每個孔中，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待孵育1 h后，使用酶標(biāo)儀記錄光密度(OD)值為450 nm的熒光吸光度(注意避光)，最后繪制相關(guān)的細(xì)胞生長曲線。

2 結(jié) 果

2.1 真核表達(dá)載體pcDNATM6.2-GW/EmGEP-miR-185-5p的構(gòu)建 首先將從公司合成的miR-185-5p DNA單鏈進(jìn)行退火連接成雙鏈DNA；然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，得出目的條帶約90 bp左右(圖1A)；將大片段的真核表達(dá)載體菌株(即pcDNATM6.2-GW/EmGEP-miR)用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行搖菌擴(kuò)增，擴(kuò)增好的菌液提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切(Hind Ⅲ和EcoR I)，再次用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得出了5000 bp左右的目的條帶(圖1B)，并對大片段進(jìn)行回收。

A:人工合成miR-185-5p的 DNA oligo退火產(chǎn)物電泳圖；B：雙酶切pcDNATM6.2-GW/EmGEP-miR后電泳圖；M:標(biāo)記

2.2 pcDNATM6.2-GW/EmGEP-miR-185-5p真核表達(dá)載體的鑒定 采用T4DNA連接酶將兩個片段連接，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后挑取單個菌落放在含有氨芐青霉素(Amp+)的LB液體培養(yǎng)基中將菌落擴(kuò)增培養(yǎng)，最后測序，將測序結(jié)果與miR-185-5p DNA oligo序列進(jìn)行比對，可以看出完全相匹配(圖2)，初步證明構(gòu)建成功。

圖2 pcDNATM6.2-GW/EmGEP-miR-185-5p真核表達(dá)載體測序結(jié)果

2.3 miR-185-5p真核表達(dá)載體在Panc-1細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率檢測 將構(gòu)建成功的pcDNATM6.2-GW/EmGEP-miR-185-5p表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)Panc-1細(xì)胞中，于24 h后進(jìn)行倒置熒光顯微鏡檢鏡觀察轉(zhuǎn)染效率(圖3A),然后提取RNA，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測(圖3B)，miR-185-5p的表達(dá)量，miR-185-5p的在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)水平相對于對照組顯著增加(P<0.05)。

2.4 過表達(dá)miR-185-5p抑制Panc-1細(xì)胞的增殖 將構(gòu)建成功的pcDNATM6.2-GW/EmGEP-miR-185-5p表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)Panc-1細(xì)胞中，采用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測其對Panc-1細(xì)胞增殖能力的影響(圖4)，發(fā)現(xiàn)在Panc-1細(xì)胞中過表達(dá)miR-185-5p，細(xì)胞增殖明顯降低(P<0.05)，表明Panc-1細(xì)胞的增殖能夠被miR-185-5p抑制。

A：熒光觀察Panc-1細(xì)胞的相差圖(右)和熒光圖譜(左)；B:qRT-PCR驗(yàn)證miR-185-5p的表達(dá)(*P<0.05)

注：*P<0.05

3 討 論

miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，它能夠通過翻譯抑制或著降解信使RNA(mRNA)在動植物中起重要的基因調(diào)控作用[13]。廣泛性是miRNA的作用特性之一，一種 miRNA 分子可沉默多個靶基因，而這些靶基因可參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞不同的生物學(xué)行為，同時它所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)也是多方面的。研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miRNA-183能夠促進(jìn)噪聲性耳聾發(fā)生發(fā)展[14]。 有數(shù)據(jù)表明miR-7-5p、miR-142-3p、miR-221-5p和miR-370-3p具有成為診斷雙相情感障礙(BD-Ⅱ)的有用工具的巨大潛力[15]。人們在關(guān)于miRNA與癌癥發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系研究，在近些年來也取得了很大的進(jìn)步。例如易亭伍等[16]發(fā)現(xiàn)miR-141-3p可以通過靶向KLF9調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞增殖。miRNA 簇是上皮到間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器。抑制pro-EMT miRNA簇有利于控制EMT和癌癥轉(zhuǎn)移[17]。最新研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)對非侵入性尿液樣本中miR-34a-5p和miR-218-5p的表達(dá)的評估可以作為宮頸癌早期檢測和預(yù)后的可靠生物標(biāo)志物[18]。

miR-185-5p基因位于22q11.21染色體上，同許多功能性的miRNA一致，miR-185-5p也能夠參與調(diào)節(jié)多種生物學(xué)功能。有研究發(fā)現(xiàn)miR-185-5p可以通過直接靶向CCND2作為口腔鱗狀細(xì)胞癌OSCC的腫瘤抑制因子[19]。Zhu 等[20]還發(fā)現(xiàn)miR-185可以通過靶向Six2來抑制肝細(xì)胞癌中的細(xì)胞增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。同時miR-185也有促進(jìn)腫瘤發(fā)生的這一相反作用的結(jié)果報(bào)道。例如，在乙肝纖維化中，miR-185的表達(dá)上調(diào)，并且可以通過靶向SREBF1來增加Col1A1和α-SMA33的表達(dá)[21]。

近幾年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA和胰腺癌的之間也有相關(guān)性。在關(guān)于miRNA參與胰腺癌發(fā)生發(fā)展的研究中發(fā)現(xiàn)miR-612作為一種腫瘤抑制因子，能夠與5-氟尿嘧啶一起在抑制人Panc-1胰腺癌細(xì)胞的生長和遷移以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面具有重要作用，被視為胰腺癌治療的新型治療方式[22]。同時有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-139-3p和miR-196b-5p能夠分別通過靶向NOB1和ING5抑制Panc-1細(xì)胞凋亡[23]。也有研究表明，miR-448在胰腺癌細(xì)胞和組織中下調(diào)并且過表達(dá)miR-448能夠抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖[24]。

作為一種高度致命的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，胰腺癌的發(fā)展相關(guān)可變風(fēng)險(xiǎn)因素包括肥胖、2型糖尿病和吸煙。據(jù)了解，胰腺癌的重要風(fēng)險(xiǎn)因素和先兆之一就是新發(fā)糖尿病，相關(guān)數(shù)據(jù)表明，相比長期糖尿病患者，患病時間不到1年的糖尿病患者患胰腺癌幾率相對高出大約1～5倍[25]。根治性手術(shù)是胰腺癌唯一潛在的治愈性治療方法。由于與該疾病相關(guān)的生存率一直很低，大多數(shù)胰腺癌患者的預(yù)后仍然嚴(yán)峻。因此迫切需要探索胰腺癌癌變和進(jìn)展的分子機(jī)制以開發(fā)有效的胰腺癌治療方法。

在本研究中，首先我們構(gòu)建了miR-185-5p的真核表達(dá)載體，以真核表達(dá)載體pcDNATM6.2-GW/EmGEP-miR為基礎(chǔ)，將由公司合成的miR-185-5p的寡聚核苷酸和由Hind Ⅲ和EcoR I雙酶切和純化后的大載體進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.Coli Top10之后，再進(jìn)行一系列的測序比對，驗(yàn)證出miR-185-5p的體外真核表達(dá)載體構(gòu)建成功；然后構(gòu)建成功的過表達(dá)載體被我們經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到Panc-1細(xì)胞中，24 h之后，通過倒置熒光顯微鏡中進(jìn)行觀察，并提取RNA進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了真核過表達(dá)載體后的Pan-1細(xì)胞中miR-185-5p的表達(dá)明顯增高；通過CCK8實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá)miR-185-5p會抑制人胰腺癌細(xì)胞Pan-1的增殖，提示miR-185-5p在胰腺癌中可能發(fā)揮抑癌作用。

總之，在本課題中，我們首先成功構(gòu)建了miR-185-5p的真核表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-185-5p可能抑制胰腺癌細(xì)胞生長，為后續(xù)關(guān)于胰腺癌的研究奠定了基礎(chǔ)。