屈 慧，皇 海，張 蕊

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院，陜西 西安710032)

腫瘤的臨床分期一般根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟制定的腫瘤(TNM)分期確定，對(duì)腫瘤嚴(yán)重程度的判斷和治療方案的選擇均具有一定的指導(dǎo)作用[1]。但是，TNM分期存在一定的局限，TNM分期需經(jīng)穿刺活檢或手術(shù)獲得病理組織才能夠評(píng)估腫瘤分期，但穿刺活檢具有一定創(chuàng)傷性，患者多不易接受，而手術(shù)病理結(jié)果具有檢查時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)，易導(dǎo)致患者錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)間[2]。因此，早期檢測(cè)與腫瘤臨床分期相關(guān)的指標(biāo)，對(duì)于指導(dǎo)患者治療和預(yù)后預(yù)測(cè)具有重要的意義。細(xì)胞角蛋白 (Cytokeratin，CK)是一種蛋白質(zhì)，包括CK18、CK19等，在人體上皮細(xì)胞中廣泛存在，具有分化特異性，與上皮來(lái)源的惡性腫瘤具有一定的聯(lián)系，可能與原發(fā)性喉癌的臨床分期有關(guān)[3]。已有研究證實(shí)，CK與喉癌的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等具有密切的聯(lián)系[4]。骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)是一種磷酸化糖蛋白，能連接骨細(xì)胞外基質(zhì)及骨細(xì)胞，與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)[5]。研究表明，OPN與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有緊密的聯(lián)系，可能促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移，加重腫瘤惡性程度[6]。由此推測(cè)，CK、OPN可能均與原發(fā)性喉癌臨床分期相關(guān)，但是，目前尚無(wú)研究對(duì)此進(jìn)行分析。本研究分析血清CK18、OPN水平與原發(fā)性喉癌患者臨床分期的相關(guān)性，為分析喉癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)基礎(chǔ)提供方向。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)，選擇93例原發(fā)性喉癌患者作為研究對(duì)象，患者與家屬均知情且自愿簽署同意書(shū)。其中，男79例，女14例；年齡44～82歲，中位年齡53.00(47.00，58.00)歲；體重指數(shù)18.98～24.46 kg/m2，中位體重指數(shù)22.46(22.10，22.83)kg/m2。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《頭頸部惡性腫瘤診斷治療指南》[7]中原發(fā)性喉癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；②經(jīng)纖維喉鏡和病理活檢確診為原發(fā)性喉癌；③存在聲嘶、咽痛、呼吸困難、咽部異物感等臨床癥狀；④初診患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②合并其他嚴(yán)重軀體疾??；③合并自身免疫性疾??；④合并糖尿病、腎損傷等其他影響CK18、OPN的疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞角蛋白檢測(cè)：采集患者入院時(shí)3 ml空腹靜脈血，離心機(jī)(凱達(dá)，KS50R)3000 r/min (半徑12 cm)離心15 min，用武漢默沙克生物科技提供的試劑盒，以酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清CK18、CK19水平。

1.2.2 OPN檢測(cè)：采集患者入院時(shí)2 ml空腹靜脈血，離心機(jī)(凱達(dá)，KS50R)3000 r/min(半徑12 cm)離心15 min，用武漢艾美捷科技提供的試劑盒，以ELISA測(cè)定血清OPN水平。

1.2.3 腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)：采集患者入院時(shí)6 ml空腹靜脈血，離心機(jī)(湘銳，TDZ5-BP)3000 r/min(半徑13.5 cm)離心操作10 min，取血清，以酶聯(lián)免疫雙抗體夾心法檢測(cè)血清糖類抗原50(CA50)、糖類抗原199(CA199)、癌胚抗原(CEA)、糖脂類抗原72-4(CA72-4)水平。

1.2.4 臨床分期評(píng)估：進(jìn)行纖維喉鏡和病理活檢，根據(jù)檢查結(jié)果，參照TNM分期[8]分為晚期(TNM分期Ⅲ、Ⅳ期)和早中期(TNM分期Ⅰ、Ⅱ期)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料均經(jīng)Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)，偏態(tài)分布計(jì)量資料用中位數(shù)(四分位數(shù))[M(P25，P75)]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)，血清CK18、OPN水平與原發(fā)性喉癌患者臨床分期關(guān)系采用Logistic回歸分析檢驗(yàn)；繪制受試者工作曲線(ROC)，并計(jì)算曲線下面積(AUC)值，檢驗(yàn)血清CK18、OPN水平評(píng)估原發(fā)性喉癌患者臨床分期的價(jià)值，AUC值>0.9表示評(píng)估性能較高，0.71～0.90表示有一定評(píng)估性能，0.5～0.7表示評(píng)估性能較低，<0.5表示無(wú)評(píng)估性能，CK18、OPN相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者臨床病理特征和血清指標(biāo)比較 本研究中93例原發(fā)性喉癌患者中，早中期62例，占66.67%(62/93)，其中Ⅰ期16例，Ⅱ期46例；晚期31例，占33.33%(31/93)，其中Ⅲ期27例，Ⅳ期4例。兩組性別、年齡、體重指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；晚期組CK18、CK19、OPN、CA50、CA199、CEA、CA72-4高于早中期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者臨床病理特征和血清指標(biāo)比較

2.2 血清指標(biāo)與原發(fā)性喉癌患者臨床分期關(guān)系Logistic回歸分析 將2.1中比較結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入作為自變量(均為連續(xù)變量)，將原發(fā)性喉癌患者臨床分期作為因變量(1=晚期，0=早中期)，經(jīng)Logistic回歸分析檢驗(yàn)結(jié)果顯示，入院時(shí)血清CK18、CK19、OPN、CA50、CA199、CEA、CA72-4水平與原發(fā)性喉癌患者臨床分期有關(guān)，CK18、CK19、OPN、CA50、CA199、CEA、CA72-4高表達(dá)可能是原發(fā)性喉癌患者進(jìn)展至晚期的風(fēng)險(xiǎn)因子(OR>1，P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 血清指標(biāo)與原發(fā)性喉癌患者臨床分期關(guān)系Logistic回歸分析

2.3 血清CK18、OPN水平評(píng)估原發(fā)性喉癌患者臨床分期的價(jià)值 將原發(fā)性喉癌患者臨床分期作為狀態(tài)變量(1=晚期，0=早中期)，將入院時(shí)血清CK18、OPN水平作為檢驗(yàn)變量，繪制ROC曲線圖(圖1)，結(jié)果顯示，入院時(shí)血清CK18、OPN單獨(dú)及聯(lián)合評(píng)估原發(fā)性喉癌患者預(yù)后不良的AUC分別為0.886、0.832、0.899，均有一定評(píng)估價(jià)值，且當(dāng)兩者的Cut-off值分別取5.293 ng/ml、46.991 μg/L時(shí)，可獲得最佳評(píng)估價(jià)值。見(jiàn)表3。

表3 血清CK18、OPN水平評(píng)估原發(fā)性喉癌患者臨床分期的價(jià)值

圖1 血清CK18、OPN水平評(píng)估原發(fā)性喉癌患者臨床分期ROC曲線

2.4 原發(fā)性喉癌患者血清CK18、OPN相關(guān)性 經(jīng)Spearman相關(guān)性分析檢驗(yàn)，原發(fā)性喉癌患者血清CK18、OPN呈正相關(guān)(r=0.353，P<0.001)，見(jiàn)圖2。

圖2 原發(fā)性喉癌患者血清CK18、OPN相關(guān)性散點(diǎn)圖

3 討 論

原發(fā)性喉癌預(yù)后情況不佳，尤其是晚期喉癌，生存率較低，這與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)[9-10]。因此，分析與原發(fā)性喉癌臨床分期相關(guān)的血清指標(biāo)，對(duì)早期發(fā)現(xiàn)侵襲和轉(zhuǎn)移，指導(dǎo)治療方案的選擇和預(yù)后結(jié)果的預(yù)測(cè)，從而改善預(yù)后具有重要的意義。

CK主要分布于上皮細(xì)胞，在上皮起源的腫瘤中也有表達(dá)，與上皮起源的腫瘤具有密切的聯(lián)系[11]。其中，CK18是上皮細(xì)胞骨架的組成成分，與上皮細(xì)胞的凋亡、裂解具有密切的關(guān)聯(lián)，CK18水平的變化在一定程度上可反映上皮細(xì)胞惡變程度[12]。由此推測(cè)，CK的升高意味著癌癥惡性程度的增加，可能與原發(fā)性喉癌臨床分期相關(guān)。OPN屬于分泌型磷酸化糖蛋白，廣泛存在于人體內(nèi)，在腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、免疫反應(yīng)等過(guò)程均有參與[13]，被證實(shí)在胃癌、肺癌等多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有聯(lián)系[14-15]。OPN具有豐富的功能，可以分泌基質(zhì)細(xì)胞、趨化因子等，參與細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，能通過(guò)結(jié)合整合素，調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16]?？梢?jiàn)，OPN的水平變化可能也與原發(fā)性喉癌分期具有一定的聯(lián)系。CA50、CA199、CEA、CA72-4均為常見(jiàn)腫瘤標(biāo)志物，對(duì)腫瘤的鑒別診斷、轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)、預(yù)后評(píng)估等均具有一定的價(jià)值，可在一定程度上反映原發(fā)性喉癌的臨床分期。本研究對(duì)比不同分期原發(fā)性喉癌患者血清指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，晚期組CK18、CK19、OPN、CA50、CA199、CEA、CA72-4高于中早期組。說(shuō)明CK、OPN、腫瘤標(biāo)志物均可能與原發(fā)性喉癌患者臨床分期具有一定的關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步經(jīng)Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，入院時(shí)血清CK18、CK19、OPN、CA50、CA199、CEA、CA72-4水平與原發(fā)性喉癌患者臨床分期有關(guān)，CK18、CK19、OPN、CA50、CA199、CEA、CA72-4高表達(dá)可能是原發(fā)性喉癌患者進(jìn)展至晚期的風(fēng)險(xiǎn)因子。相較于CK19，CK18對(duì)原發(fā)性喉癌進(jìn)展至晚期的影響因子更大。因此，本研究重點(diǎn)分析CK18與原發(fā)性喉癌臨床分期的關(guān)系。分析原因?yàn)椋和砥谠l(fā)性喉癌患者上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞的進(jìn)程較快，促進(jìn)CK18被含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶分解后釋放入血，從而增加血清中CK18含量[17]。因此，晚期原發(fā)性喉癌患者血清CK18水平較高。CK18在癌癥細(xì)胞中高度表達(dá)，不僅利于癌細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)形態(tài)的維持，保護(hù)癌癥細(xì)胞，同時(shí)還會(huì)對(duì)癌細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖[18]。此外，CK18能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子β1，刺激鋅指轉(zhuǎn)錄因子、上皮性腫瘤細(xì)胞增加，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致原發(fā)性喉癌患者進(jìn)展為晚期[19-20]。OPN與原發(fā)性喉癌臨床分期有關(guān)，可能是由于：癌癥的進(jìn)展與癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，涉及細(xì)胞外基質(zhì)分解、細(xì)胞黏附等[21-22]。OPN能結(jié)合整合素受體，激活基質(zhì)金屬蛋白酶，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶分解細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲、黏附和轉(zhuǎn)移，而且OPN轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)后，刺激誘導(dǎo)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[23]。OPN參與細(xì)胞的分裂和浸潤(rùn)，能對(duì)骨鈣的沉積進(jìn)行調(diào)節(jié)，且可通過(guò)結(jié)合骨組織中的羥磷灰石，影響癌細(xì)胞的遷移[24]。OPN能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)肥大細(xì)胞，從而促進(jìn)腫瘤組織新生血管的形成，抑制癌細(xì)胞的凋亡，加重原發(fā)性喉癌[25]。此外，CA50、CA199、CEA、CA72-4為常規(guī)腫瘤標(biāo)志物，目前與原發(fā)性喉癌進(jìn)展相關(guān)研究較多，本研究并未進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)分析。本研究結(jié)果為分析血清CK18、OPN對(duì)原發(fā)性喉癌患者病情程度的評(píng)估價(jià)值，繪制ROC曲線圖，結(jié)果顯示，入院時(shí)血清CK18、OPN單獨(dú)及聯(lián)合評(píng)估原發(fā)性喉癌患者預(yù)后不良的AUC分別為0.886、0.832、0.899，均有一定評(píng)估價(jià)值。說(shuō)明，血清CK18、OPN可用于原發(fā)性喉癌患者臨床分期的評(píng)估。另外，本研究經(jīng)Spearman相關(guān)性分析檢驗(yàn)，原發(fā)性喉癌患者血清CK18、OPN呈正相關(guān)。但目前機(jī)制尚不清楚，后續(xù)應(yīng)增加相關(guān)研究加以證實(shí)。

綜上所述，血清CK18、OPN水平與原發(fā)性喉癌患者臨床分期相關(guān)，可用于原發(fā)性喉癌患者臨床分期的評(píng)估。