洪 甲，楊 洋，欒麗霞

(1.西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院產(chǎn)科，陜西 西安 710100；2.西安醫(yī)學(xué)院第一附醫(yī)院婦科，陜西 西安 710077)

卵巢癌(Ovarian cancer，OC)作為婦科常見腫瘤可發(fā)生于任何年齡，具有較高的致死率[1]。其中，卵巢上皮性癌(Epithelial ovarian cancer)是最常見的卵巢癌病理類型，其發(fā)生比例可高達85%～90%，但目前，該類種腫瘤發(fā)病機制不清。相關(guān)研究[2]認(rèn)為腫瘤相關(guān)基因突變、失活、過表達，以及遺傳等相關(guān)因素是該疾病的潛在發(fā)生機制。在諸多致病因素中，包括長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)、微小RNA (microRNA,miRNA)在內(nèi)的多種非編碼RNA(non-coding RNAs，ncRNA)是目前的研究熱點，已有多個ncRNA被發(fā)現(xiàn)參與了卵巢癌等多種婦科惡性腫瘤的疾病過程[3-4]。lncRNA通過與miRNA協(xié)同，構(gòu)成調(diào)控關(guān)系網(wǎng)路，在諸多生理過程中發(fā)揮重要作用[5-6]。有研究[7]發(fā)現(xiàn)，lncRNA-p23154可通過調(diào)控細(xì)胞糖酵解、侵襲轉(zhuǎn)移及化療敏感性等方式，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展；并且lncRNA-p23154在口腔鱗癌細(xì)胞中可以通過對miR-375發(fā)揮競爭性內(nèi)源RNA (competing endogenous RNA，ceRNA )作用，影響口腔鱗癌細(xì)胞增殖[8]；而miR-375與卵巢癌發(fā)病直接相關(guān)[9]，其能夠通過靶向調(diào)控KLF4，抑制直腸癌細(xì)胞增殖功能[10]。因此，本研究在上述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，對lncRNA-p23154能否通過調(diào)節(jié)miR-375/KLF4通路，影響卵巢癌細(xì)胞功能，參與疾病發(fā)病過程進行了探索。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，Lipofectamine2000試劑盒購自美國Invitrogen公司，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒購自中國上海吉瑪公司,Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司，SYBR Premix Ex Taq試劑盒購自美國Invitrogen公司，BCA法蛋白定量試劑盒購自美國Gibco公司，CCK-8測定試劑盒購自中國碧云天公司，SDS裂解液購自美國Gibco公司，Tanswell小室購自美國BD公司，Matrigel膠購自美國BD公司，所有抗體購自英國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：將SKOV3細(xì)胞接種培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；按照Lipofectamine2000試劑盒說明書步驟，取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板中進行轉(zhuǎn)染實驗。實驗共分三組：過表達組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-p23154質(zhì)粒)、抑制組(轉(zhuǎn)染siRNA-p23154抑制序列)、對照組(轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒)，轉(zhuǎn)染后24 h進行后續(xù)實驗。每組重復(fù)3次。

1.2.2 qRT-PCR檢測lncRNA-p23154轉(zhuǎn)染效率及各組細(xì)胞中miR-375、KLF4 mRNA表達水平：按照Trizol試劑盒說明步驟分別提取1.2.1中三組轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA，并檢測RNA質(zhì)量。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟，反轉(zhuǎn)錄合成lncRNA-p23154、miR-375及KLF4 cDNA。分別以U6、β-actin為內(nèi)參，按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明行實時定量PCR反應(yīng)。目的基因引物序列由中國上海吉瑪公司合成生產(chǎn)，具體序列及PCR反應(yīng)條件，見表1。采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。每次檢測設(shè)定3個復(fù)孔，每個樣本重復(fù)3次。

表1 目的基因引物序列及PCR反應(yīng)條件

1.2.3 Western blot檢測各組細(xì)胞中KLF4蛋白表達水平：按照SDS裂解液說明分別提取1.2.1中三組轉(zhuǎn)染細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，上樣后凝膠電泳、分離等量蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，5%脫脂奶粉液室溫封閉1 h后，4 ℃冰箱中將PVDF膜加入鼠抗人KLF4(1∶1500)、鼠抗人GAPDH(1∶1500)單克隆抗體孵育液中過夜；洗膜后，加HRP標(biāo)記二抗(1∶2000)室溫下孵育1 h，使用化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)顯影并記錄印跡條帶，以KLF4/GAPDH比值計算目的蛋白表達量。每次檢測設(shè)定3個復(fù)孔，每個樣本重復(fù)3次。

1.2.4 CCK8法檢測SKOV3細(xì)胞增殖能力：按照CCK-8測定試劑盒說明步驟，檢測轉(zhuǎn)染后各組SKOV3細(xì)胞增殖能力。取1.2.1中三組對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至4×105個，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，CCK-8溶液孵育，酶標(biāo)儀檢測并記錄分組培養(yǎng)0、24、48、72 h時490 nm OD值。每次檢測設(shè)定3個復(fù)孔，每個樣本重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell檢測SKOV3細(xì)胞侵襲能力：將轉(zhuǎn)染后的各組SKOV3細(xì)胞消化后使用不含胎牛血清的1640培養(yǎng)基重懸，并接種于涂有Matrigel膠的Transwell(8 μm)的上室中，下室加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，用70%乙醇固定侵入小室的細(xì)胞，并用0.1%結(jié)晶紫染色，再次洗滌后，于光學(xué)顯微鏡下隨機選擇5個區(qū)域計數(shù)侵入細(xì)胞的數(shù)目。每組重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后lncRNA-p23154、miR-375、KLF4 mRNA及KLF4蛋白表達量比較 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，lncRNA-p23154在過表達組SKOV3細(xì)胞中表達水平增高、在抑制組中表達水平降低(均P<0.05)，表明細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。qRT-PCR檢測結(jié)果提示，在SKOV3細(xì)胞中過表達與抑制lncRNA-p23154效果顯著(均P<0.05)；與對照組和抑制組相比，過表達組SKOV3細(xì)胞中miR-375表達降低，KLF4表達均升高(均P<0.05)；Western blot結(jié)果顯示，與抑制組相比，過表達組SKOV3細(xì)胞中KLF4在蛋白水平表達升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后lncRNA-p23154、miR-375、KLF4 mRNA、KLF4蛋白表達量比較

2.2 lncRNA-p23154對SKOV3細(xì)胞增殖能力的影響 CCK8 法檢測結(jié)果顯示，與對照組及過表達組SKOV3細(xì)胞在24、48、72 h時間點比較，抑制組SKOV3細(xì)胞增殖能力升高(均P<0.05)，見表3。

表3 各組SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染后不同時間的OD值

2.3 lncRNA-p23154對SKOV3侵襲能力的影響 Transwell結(jié)果顯示，與對照組及過表達組SKOV3細(xì)胞相比，抑制組SKOV3細(xì)胞侵襲能力升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表4(圖1)。

表4 各組細(xì)胞侵襲能力比較 [細(xì)胞數(shù)(個)]

圖1 Transwell檢測各組細(xì)胞侵襲情況(結(jié)晶紫染色，×200)

3 討 論

卵巢癌作為威脅女性健康的惡性疾病，早期確診率低，中晚期致死率高、患者預(yù)后不佳[11]。多數(shù)患者確診后單純手術(shù)治療效果不佳，反復(fù)多次化療，極易產(chǎn)生耐藥，最終導(dǎo)致生存率不高[12-13]，為社會及患者家庭帶來了多方面的負(fù)擔(dān)。因此，進一步探究卵巢癌發(fā)病機制，尋找新的診斷及治療靶點尤為重要。卵巢癌病因復(fù)雜，現(xiàn)有諸多研究[3,14]明確了不同病理學(xué)類型的卵巢癌組織中差異表達的miRNA、lncRNA等，能夠通過上游路徑調(diào)控卵巢癌疾病相關(guān)因子，參與卵巢癌發(fā)病過程；例如lncRNA-HOTAIR在卵巢癌組織中病理性高表達，并能夠進一步通過促進miR-206表達，發(fā)揮其抑癌作用[15]。而Wang等[7]發(fā)現(xiàn)，lncRNA-p23154在口腔鱗癌發(fā)病過程中的相關(guān)機制，其能夠影響腫瘤細(xì)胞功能，參與疾病過程；并且lncRNA-p23154與卵巢癌相關(guān)miR-375之間具有調(diào)控關(guān)系[8]。以上提示，lncRNA-p23154具有參與諸如卵巢癌等其他婦科惡性腫瘤疾病的可能。因此，本研究選取lncRNA-p23154作為研究因子。

非編碼RNA在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的重要作用可見一斑，lncRNA雖不能直接編碼蛋白質(zhì)，但其通過與miRNA之間的調(diào)控關(guān)系[16]，共同參與了多種生理病理過程。在口腔鱗癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-p23154與miR-375之間的負(fù)向調(diào)控關(guān)系已得到驗證[8]，p23154能夠通過對miR-375發(fā)揮ceRNA作用，間接影響口腔鱗癌細(xì)胞相關(guān)功能。而本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在SKOV3細(xì)胞中過表達與抑制lncRNA-p23154效果顯著，并且在特異性的過表達與抑制lncRNA-p23154后，各組SKOV3細(xì)胞中miR-375表達同時出現(xiàn)了被負(fù)性調(diào)控影響的趨勢。

miR-375不僅在卵巢惡性腫瘤組織中高表達，并且還在該類型患者外泌體中穩(wěn)定存在[9]。miR-375能夠負(fù)性調(diào)控KLF4，影響直腸癌細(xì)胞[10]、前列腺癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力[17]。在初步明確lncRNA-p23154與卵巢癌可能具有相關(guān)性的基礎(chǔ)上，我們通過細(xì)胞增殖、侵襲能力檢測，發(fā)現(xiàn)抑制p23154后SKOV3細(xì)胞增殖及侵襲能力均增強；p23154表達增強后，miR-375的靶基因KLF4在mRNA及蛋白水平均升高。KLF4作為鋅指蛋白成員，能夠通過直接或間接、單獨或協(xié)同的方式，影響細(xì)胞增殖、分化相關(guān)基因，從而參與細(xì)胞周期G1/S等過程的調(diào)控，與細(xì)胞增殖、侵襲功能相關(guān)[18]。在宮頸癌中，KLF4與癌細(xì)胞生殖、疾病轉(zhuǎn)移均有相關(guān)性[19]。另外，KLF4與miR-375在3’UTR端具有互補結(jié)合的種子序列，兩者間具有負(fù)性調(diào)控關(guān)系；在子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)性卵巢腫瘤中，KLF4低表達[20]；在卵巢癌中，其能夠發(fā)揮抑癌作用，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲[18]。

因此，lncRNA-p23154與miR-375-KLF4構(gòu)成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在卵巢癌發(fā)病過程中可能起到的重要作用。結(jié)合本研究中實驗結(jié)果，提示：lncRNA-p23154能夠特異性結(jié)合miR-375，通過充當(dāng)競爭性內(nèi)源性RNA，在其高表達時負(fù)性調(diào)控，即抑制了miR-375表達；因此，繼而間接影響了miR-375對其靶基因KLF4的負(fù)性調(diào)控過程；當(dāng)SKOV3細(xì)胞中KLF4表達受到抑制時，細(xì)胞增殖、侵襲能力增強。

綜上，lncRNA-p23154與卵巢上皮性癌相關(guān)，其可能通過miR-375/KLF4途徑，影響SKOV3細(xì)胞增殖、侵襲；但具體的調(diào)控機制和作用靶點仍需后續(xù)研究進一步明確。通過本研究，為探尋卵巢癌發(fā)病機制及潛在的疾病預(yù)測診斷靶點提供了一定理論依據(jù)。