王曼 宋智斌

(1邢臺(tái)市人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，河北 邢臺(tái) 054001；2邢臺(tái)市信都區(qū)中心醫(yī)院內(nèi)科)

鼻咽癌是起源于鼻咽黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界每年有5萬(wàn)人死于鼻咽癌，其中大多數(shù)患者來(lái)自中國(guó)南部和東南亞地區(qū)〔1〕。目前，放化療是鼻咽癌患者的主要治療方法，但由于晚期患者放化療耐受及并發(fā)癥的出現(xiàn)嚴(yán)重影響治療效果，患者的5年生存率仍不理想〔2〕。因此，尋找安全、高效、低毒的抗腫瘤藥物，提高臨床鼻咽癌治療效果是目前亟待解決的重大課題。仙鶴草又名龍牙草，為薔薇科多年生草本植物，具有收斂止血，止痢殺蟲、強(qiáng)心益氣之功效，多用于治療各種出血和脫力勞傷等〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)〔4〕，仙鶴草具有較好的抗腫瘤活性，如仙鶴草水提液可顯著抑制肺癌細(xì)胞A549增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；仙鶴草丙酮提取物正丁醇萃取層可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞BEL-7402內(nèi)活性氧增加，促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔5〕，此外一定濃度的仙鶴草提取物對(duì)鼻咽癌有抑制作用〔6〕。但仙鶴草對(duì)鼻咽癌生物行為影響的具體機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究探討仙鶴草提取物對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖抑制和凋亡促進(jìn)及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 鼻咽癌細(xì)胞株CNE1和CNE2購(gòu)于美國(guó)ATCC。(DMEM)培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于Sigma公司；噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒和AnnexinV-FITC/PI試劑盒購(gòu)于北京索萊寶公司；Western印跡相關(guān)試劑、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)于上海碧云天公司；兔源細(xì)胞周期素(Cyclin)D1多克隆抗體、兔源P21單克隆抗體和兔源GAPDH多克隆抗體購(gòu)于Abcam公司，鼠源B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)相關(guān)X蛋白(Bax)單克隆抗體、鼠源Bcl-2單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔和羊抗鼠Ⅱ抗購(gòu)于Santa Cruz公司。仙鶴草購(gòu)于河南國(guó)藥堂中藥材批發(fā)商行，經(jīng)醫(yī)院中藥房鑒定為仙鶴草。仙鶴草提取物制備參照文獻(xiàn)〔6〕進(jìn)行。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇CNE1和CNE2細(xì)胞后，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、90%濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)CNE1和CNE2細(xì)胞，每隔1 d換液1次。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞處理和分組 將鼻咽癌細(xì)胞CNE1和CNE2分隨機(jī)分為對(duì)照組(未經(jīng)處理的CNE1或CNE2細(xì)胞)、不同濃度(40、60、80 mg/ml)仙鶴草提取物組(用相應(yīng)濃度的仙鶴草提取物處理細(xì)胞48 h)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-34c-5p組(轉(zhuǎn)染miR-34c-5p mimics)、仙鶴草60 mg/ml+anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染anti-miR-NC后用60 mg/ml仙鶴草提取物組處理48 h)和仙鶴草60 mg/ml+anti-miR-34c-5p組(轉(zhuǎn)染anti-miR-34c-5p后用60 mg/ml仙鶴草提取物組處理48 h)。轉(zhuǎn)染步驟參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書。

1.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 將按照1.3分組進(jìn)行相應(yīng)處理的CNE1或CNE2細(xì)胞接種到96孔板，分別在24 h、48 h、72 h時(shí)間點(diǎn)，各取一組細(xì)胞，每孔加入20 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，孵育4 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，室溫震蕩10 min，當(dāng)結(jié)晶完全溶解后，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在490 nm波長(zhǎng)處吸光值。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按照1.3分組進(jìn)行相應(yīng)處理的CNE1或CNE2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，取100 μl細(xì)胞懸液，加入5 μl的Annexin V-FITC混勻，室溫避光孵育10 min后，加入10 μl的碘化丙啶(PI)染液，繼續(xù)孵育5 min，補(bǔ)加磷酸鹽緩沖液(PBS)至500 μl，1 h內(nèi)進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

1.6qRT-PCR檢測(cè) 收集各組CNE1或CNE2細(xì)胞，TRIZOL試劑提取總RNA后，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，以U6為內(nèi)參，按照2-ΔΔCt公式計(jì)算miR-34c-5p的相對(duì)表達(dá)量。

1.7Western印跡檢測(cè) 提取各組CNE1或CNE2細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，Western封閉液室溫封閉1 h后，分別加入抗CyclinD1、P21、Bax和Bcl-2蛋白Ⅰ抗，側(cè)擺搖床4℃孵育過(guò)夜后，Western洗滌液洗膜，分別加入已稀釋的Ⅱ抗室溫條件孵育2 h，Western洗滌液洗膜后，在暗盒中進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影，以GAPDH為內(nèi)參，用Quantity One軟件分析各目的條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1仙鶴草提取物對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE1和CNE2增殖的影響 與對(duì)照組比較，不同濃度的仙鶴草提取物(40、60、80 mg/ml)可顯著抑制CNE1和CNE2細(xì)胞的增殖，抑制CyclinD1蛋白表達(dá)，促進(jìn)P21蛋白表達(dá)，且呈顯著的濃度依賴性(P<0.05)。選取仙鶴草60 mg/ml進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表1、表2和圖1。

表1 不同濃度的仙鶴草提取物對(duì)細(xì)胞CNE1增殖的影響

表2 不同濃度的仙鶴草提取物對(duì)細(xì)胞CNE2增殖的影響

2.2仙鶴草提取物對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE1和CNE2凋亡的影響 與對(duì)照組比較，60 mg/ml的仙鶴草提取物可顯著促進(jìn)CNE1和CNE2凋亡，顯著促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)，顯著抑制Bcl-2蛋白表達(dá)(P<0.001)。見表3，圖2，圖3。

表3 仙鶴草提取物對(duì)細(xì)胞CNE1及CNE2凋亡的影響

2.3仙鶴草提取物對(duì)細(xì)胞CNE1和CNE2中miR-34c-5p表達(dá)的影響 與對(duì)照組(0.22±0.02、0.23±0.02)比較，60 mg/ml仙鶴草提取物可顯著促進(jìn)CNE1和CNE2中miR-34c-5p的表達(dá)(0.78±0.07、0.66±0.06；t=23.077、20.397，均P=0.000)。

1～4：對(duì)照組、仙鶴草40 mg/ml組、仙鶴草60 mg/ml組、仙鶴草80 mg/ml組圖1 不同濃度的仙鶴草提取物對(duì)細(xì)胞CNE1和CNE2增殖蛋白表達(dá)的影響

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)仙鶴草提取物對(duì)細(xì)胞CNE1和CNE2凋亡的影響

圖3 仙鶴草提取物對(duì)細(xì)胞CNE1和CNE2凋亡蛋白的影響

2.4過(guò)表達(dá)miR-34c-5p對(duì)細(xì)胞CNE1和CNE2增殖、凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-34c-5p組CNE1和CNE2中miR-34c-5p的表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，表明成功構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-34c-5p的CNE1和CNE2細(xì)胞株。與miR-NC組比較，miR-34c-5p組CNE1和CNE2的增殖活力顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著增加，CyclinD1和Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著降低，P21和Bax蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.05)。提示過(guò)表達(dá)miR-34c-5p可抑制CNE1和CNE2細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。見圖4、表4、5。

表4 過(guò)表達(dá)miR-34c-5p對(duì)細(xì)胞CNE1增殖、凋亡的影響

圖4 過(guò)表達(dá)miR-34c-5p對(duì)細(xì)胞CNE1和CNE2增殖、凋亡蛋白表達(dá)的影響

2.5抑制miR-34c-5p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)仙鶴草提取物對(duì)細(xì)胞CNE1和CNE2的增殖抑制作用 與對(duì)照組比較，仙鶴草60 mg/ml組CNE1和CNE2細(xì)胞miR-34c-5p和P21蛋白的表達(dá)顯著升高，CyclinD1蛋白的表達(dá)顯著降低，細(xì)胞增殖活力顯著降低；與仙鶴草60 mg/ml+anti-miR-NC組比較，仙鶴草60 mg/ml+anti-miR-34c-5p組CNE1和CNE2細(xì)胞miR-34c-5p和P21蛋白的表達(dá)顯著降低，CyclinD1蛋白的表達(dá)顯著升高，細(xì)胞增殖活力顯著升高(P<0.05)。表明抑制miR-34c-5p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)仙鶴草提取物對(duì)細(xì)胞CNE1和CNE2的增殖抑制作用。見圖5、表6、7。

表5 過(guò)表達(dá)miR-34c-5p對(duì)細(xì)胞CNE2增殖、凋亡的影響

1～4：對(duì)照組、仙鶴草60 mg/ml組、仙鶴草60 mg/ml+anti-miR-NC組、仙鶴草60 mg/ml+anti-miR-34c-5p組；圖5同圖5 抑制miR-34c-5p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)仙鶴草提取物對(duì)細(xì)胞CNE1和CNE2增殖蛋白表達(dá)的影響

表6 抑制miR-34c-5p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)仙鶴草提取物對(duì)細(xì)胞CNE1增殖的影響

表7 抑制miR-34c-5p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)仙鶴草提取物對(duì)細(xì)胞CNE2增殖的影響

2.6抑制miR-34c-5p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)仙鶴草提取物對(duì)細(xì)胞CNE1和CNE2的凋亡的促進(jìn)作用 與對(duì)照組比較，仙鶴草60 mg/ml組CNE1和CNE2細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高；與仙鶴草60 mg/ml+anti-miR-NC組比較，仙鶴草60 mg/ml+anti-miR-34c-5p組CNE1和CNE2細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)顯著降低，Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。表明抑制miR-34c-5p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)仙鶴草提取物對(duì)細(xì)胞CNE1和CNE2的凋亡促進(jìn)作用。見圖6、表8。

圖6 抑制miR-34c-5p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)仙鶴草提取物對(duì)細(xì)胞CNE1和CNE2凋亡蛋白表達(dá)的影響

表8 抑制miR-34c-5p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)仙鶴草提取物對(duì)細(xì)胞CNE1及CNE2凋亡的影響

3 討 論

仙鶴草的藥理作用主要包括抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗氧化、降血糖和免疫增強(qiáng)等〔7〕。其中，仙鶴草的抗腫瘤作用是其研究熱點(diǎn)之一。Nho等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)，仙鶴草乙醇提取物可激活caspase活性，引起細(xì)胞周期G1期阻滯，抑制HepG2細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Huang等〔9〕在研究骨肉瘤U-2OS細(xì)胞對(duì)仙鶴提取物治療反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，仙鶴草提取物以濃度依賴性方式抑制細(xì)胞活力，通過(guò)上調(diào)Bax表達(dá)增加Bax/Bcl-2比率，引發(fā)細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，誘導(dǎo)U-2OS細(xì)胞凋亡；Wang等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，仙鶴草提取物在體內(nèi)外對(duì)S180腫瘤細(xì)胞也具有抑制作用；此外，仙鶴草和人參等草本提取物聯(lián)用對(duì)延長(zhǎng)晚期胰腺癌患者生存時(shí)間和提高生活質(zhì)量具有重要意義〔11〕。本研究表明仙鶴草提取物具有抗鼻咽癌作用，能夠有效抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

miR-34家族包括miR-34a、miR-34b和miR-34c，其中miR-34c通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期蛋白依賴激酶CDK4、cMyc及誘導(dǎo)p53表達(dá)在多種惡性腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔12〕。miR-34c-5p是成熟的miR-34c，Wang等〔13〕在研究鼻咽癌和慢性鼻咽炎患者差異表達(dá)的miRNA時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-34c-5p表達(dá)下調(diào)，低水平的miR-34c-5p與鼻咽癌患者晚期TNM分期顯著相關(guān)；Luo等〔14〕通過(guò)miRNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)，miR-34c-5p的表達(dá)下調(diào)可能與鼻咽癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移有關(guān)；同時(shí)，馬菲菲等〔15〕研究證實(shí)miR-34c-5p低表達(dá)與鼻咽癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力相關(guān)，過(guò)表達(dá)miR-34c-5p可明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖和遷移侵襲能力。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)論一致，即miR-34c-5p在鼻咽癌中發(fā)揮抑癌基因作用。

傳統(tǒng)中藥通過(guò)調(diào)控miRNA表達(dá)，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)藥物的敏感性，從而有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖機(jī)制被廣泛報(bào)道〔16〕。Wan等〔17〕研究表明，片仔癀通過(guò)上調(diào)miR-34c-5p表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，仙鶴草提取物干預(yù)可促進(jìn)miR-34c-5p表達(dá)，推測(cè)仙鶴草提取物對(duì)CNE1和CNE2細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用可能與上調(diào)miR-34c-5p表達(dá)有關(guān)，于是把miR-34c-5p抑制劑轉(zhuǎn)染至CNE1和CNE2細(xì)胞并用仙鶴草提取物干預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)抑制miR-34c-5p可逆轉(zhuǎn)仙鶴草提取物對(duì)細(xì)胞CNE1和CNE2的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用。提示仙鶴草提取物抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用與上調(diào)miR-34c-5p表達(dá)有關(guān)。