劉明盛 張勇

(1成都市第五人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川 瀘州 611130；2西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科)

卵巢癌是女性常見(jiàn)的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一。卵巢癌的病理類(lèi)型較多，臨床上以上皮細(xì)胞來(lái)源的漿液性卵巢癌最為常見(jiàn)〔1〕。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)是一種長(zhǎng)度大于200 bp，但不具有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA〔2〕。LncRNA的異常表達(dá)與卵巢癌發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，且其機(jī)制多為負(fù)向調(diào)控了某種抑癌微小RNA(miRNA)的表達(dá)。例如，LncRNA NEAT1在卵巢癌中呈高表達(dá)且這部分患者預(yù)后較差〔3〕，分子研究證實(shí)LncRNA NEAT1通過(guò)下調(diào)miR-194的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)EMT轉(zhuǎn)錄因子ZEB1的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤EMT轉(zhuǎn)化和侵襲轉(zhuǎn)移〔4〕；經(jīng)典的促癌性PI3K/AKT通路則可以被LncRNA MALAT1負(fù)性調(diào)節(jié)，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞多重耐藥表型〔5〕。LncRNA MIAT是近年來(lái)鑒定出的一種新的LncRNA，本研究旨在探索LncRNA MIAT對(duì)卵巢癌侵襲的影響，以期對(duì)LncRNA MIAT成為卵巢癌分子治療靶標(biāo)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1組織標(biāo)本 本研究選取2014年1月至2015年1月成都市第五人民醫(yī)院50例卵巢癌與對(duì)應(yīng)癌旁組織。

1.2細(xì)胞來(lái)源及主要試劑 SKOV3細(xì)胞由我科實(shí)驗(yàn)室保存；LncRNA MIAT siRNA及陰性對(duì)照siRNA由美國(guó)Santa Cruz公司設(shè)計(jì)并合成；miR-150(MQPS0000665-1)及U6(MQP-0201)引物購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；IGFBP1引物(上游5′-TCACAGCAGACAGTGTGAGAC-3′；下游5′-CCCAG GGATCCTCTTCCCAT-3′)，GAPDH引物(上游5′-AAGCCTGCCGGTGACTAAC-3′；下游5′-GCGCCCA ATACGACCAAATC-3′)、Trizol試劑(15596-026)、RT-PCR試劑盒、qPCR試劑盒及轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(11668-027)均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)康寧公司，兔抗人IGFBP1單克隆抗體(#31025)及兔抗人GAPDH單克隆抗體(#5174)均購(gòu)自美國(guó)CST公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司；DMEM液體細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Mediatech公司；基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3qRT-PCR 標(biāo)本及細(xì)胞RNA由Trizol試劑提取。反轉(zhuǎn)錄PCR條件設(shè)定為：50℃ 30 min，94℃ 2 min，循環(huán)次數(shù)1；94℃ 15 s，60℃ 30 s，68℃ 3 min，循環(huán)40次；72℃ 10 min。通過(guò)2-△△Ct法以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算LncRNA MIAT及IGFBP1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量；以U6為內(nèi)參計(jì)算miR-150的相對(duì)表達(dá)量。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染 SKOV3細(xì)胞于適宜條件下培養(yǎng)至穩(wěn)定傳代。將SKOV3細(xì)胞按適宜密度接種6孔板。實(shí)驗(yàn)分組：LncRNA MIAT組(si-MIAT)每孔加入100 pmol的LncRNA MIAT siRNA、2 ml完全培養(yǎng)基及5 μl Lipofectamine 2000；陰性對(duì)照組(si-control)每孔加入100 pmol的陰性對(duì)照siRNA、2 ml完全培養(yǎng)基及5 μl Lipofectamine 2000。轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.5Transwell小室 按1∶8比例采用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液稀釋基質(zhì)膠后，按每孔100 μl包被Transwell小室膜的上室面，制作侵襲小室模型；無(wú)基質(zhì)膠包被的Transwell小室用于細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞以無(wú)血清培養(yǎng)基按每孔2萬(wàn)個(gè)接種于上室，下室內(nèi)加入750 μl含10%血清的完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后移除培養(yǎng)基，甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色。倒置白光顯微鏡下觀察細(xì)胞侵襲，計(jì)數(shù)遷移或侵襲細(xì)胞數(shù)目。

1.7Western印跡 RIPA試劑提取細(xì)胞總蛋白，凝膠垂直電泳分離蛋白，70 V恒壓轉(zhuǎn)膜150 min，5% 牛血清白蛋白封閉1 h后將條帶孵育于1∶1 000比例稀釋的相應(yīng)一抗中。4℃過(guò)夜后，使用1∶5 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗孵育條帶1 h。ECL曝光條帶。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、Kaplan-Meier生存曲線。

2 結(jié) 果

2.1LncRNA MIAT在卵巢癌組織中的表達(dá)情況 卵巢癌組織中LncRNA MIAT的表達(dá)(1.581±0.063)與對(duì)應(yīng)癌旁組織(0.438±0.026)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.438，P=0.026)。

2.2LncRNA MIAT表達(dá)與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系 以卵巢癌組織中LncRNA MIAT在卵巢癌組織中平均表達(dá)水平為界值，將50例卵巢癌組織分為L(zhǎng)ncRNA MIAT高表達(dá)組(n=33)及低表達(dá)組(n=17)。LncRNA MIAT高表達(dá)與卵巢癌患者存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(χ2=6.269，P=0.017)，提示LncRNA MIAT可能與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。見(jiàn)表1。

表1 LncRNA MIAT表達(dá)的臨床病理意義

2.3LncRNA MIAT表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系 LncRNA MIAT高表達(dá)組患者的3年總體生存率(HR=2.392，P=0.004)及無(wú)病生存率(HR=1.639，P=0.023)較LncRNA MIAT低表達(dá)組更低。LncRNA MIAT高表達(dá)是卵巢癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一(HR=3.318，P=0.009；HR=2.551，P=0.012)。見(jiàn)圖1和表2。

圖1 LncRNA MIAT異常表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響

表2 卵巢癌患者術(shù)后3年生存率相關(guān)因素的COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析

2.4LncRNA MIAT對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響 轉(zhuǎn)染LncRNA MIAT特異性siRNA的細(xì)胞內(nèi)LncRNA MIAT表達(dá)水平為(0.257±0.028)，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA的細(xì)胞內(nèi)LncRNA MIAT表達(dá)水平為(0.884±0.035)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.375，P=0.008)。si-MIAT組遷移細(xì)胞數(shù)量〔(95.112±8.254)個(gè)〕顯著低于si-control組遷移細(xì)胞數(shù)量〔(150.381±9.013)個(gè)；t=6.223，P=0.021〕。si-MIAT組侵襲細(xì)胞數(shù)量(68.291±6.364)顯著低于si-control組侵襲細(xì)胞數(shù)量〔(98.462±7.128)個(gè)；t=3.328，P=0.035〕。見(jiàn)圖2。

圖2 LncRNA MIAT對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫，×200)

2.5過(guò)表達(dá)LncRNA MIAT對(duì)下游靶點(diǎn)miR-150表達(dá)的調(diào)節(jié)作用 si-MIAT組miR-150表達(dá)水平(0.632±0.051)顯著高于si-control組(0.231±0.103；t=3.881，P=0.027)。si-MIAT組細(xì)胞內(nèi)IGFBP1 mRNA的表達(dá)水平(0.231±0.042)顯著低于si-control組(0.528±0.095；t=2.168，P=0.036)。si-MIAT組細(xì)胞內(nèi)IGFBP1蛋白的表達(dá)水平(0.331±0.026)顯著低于si-control組為(0.582±0.014；t=2.275，P=0.032)。見(jiàn)圖3。

圖3 沉默LncRNA MIAT表達(dá)抑制SKVO3細(xì)胞內(nèi)IGFBP1蛋白的表達(dá)水平

3 討 論

LncRNA MIAT作為一種新發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，其臨床意義尚不完全清楚〔6〕。在缺血性腦卒中患者的血液標(biāo)本中，LncRNA MIAT的表達(dá)水平顯著升高，并與患者的神經(jīng)功能缺損評(píng)分呈明顯正相關(guān)，高表達(dá)LncRNA MIAT的腦卒中患者死亡率較低表達(dá)者顯著升高〔7，8〕。在肝細(xì)胞癌〔9〕和胰腺癌〔10〕中，高表達(dá)LncRNA MIAT預(yù)示著患者術(shù)后早期復(fù)發(fā)和較短的總體生存期。本研究表明在LncRNA MIAT在卵巢癌中的異常高表達(dá)導(dǎo)致了腫瘤生物學(xué)功能發(fā)生的變化，導(dǎo)致腫瘤早期復(fù)發(fā)和患者死亡。從目前的研究證據(jù)來(lái)看，在不同類(lèi)型的惡性腫瘤中的生物學(xué)功能并不完全相同。在乳腺癌〔11〕中，高表達(dá)LncRNA MIAT能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生；在非小細(xì)胞肺癌〔12〕中，LncRNA MIAT不僅能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，同時(shí)還有增強(qiáng)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的作用。LncRNA發(fā)揮生物學(xué)功能的機(jī)制主要是作為分子海綿吸附某些miRNA〔13〕，microRNA主要通過(guò)結(jié)合靶基因3′-UTR區(qū)而發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用〔14〕。文獻(xiàn)〔15〕證實(shí)IGFBP1在卵巢癌中能發(fā)揮促腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，提示LncRNA MIAT發(fā)揮促癌作用的分子途徑可能是通過(guò)下調(diào)miR-150進(jìn)而促進(jìn)癌基因IGFBP1的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上，LncRNA MIAT在卵巢癌高表達(dá)，lncRNA MIAT促進(jìn)卵巢癌侵襲的作用可能是通過(guò)調(diào)控miR-150/IGFBP1信號(hào)通路的活化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。